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主 办 单 位 中国科学院微生物研究所 中国微生物学会

编 辑 出 版 月刊

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  • 李袁飞,贡继尚,饶友生,成艳芬,朱伟云

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190287

    Abstract:

    厌氧真菌是自然界中降解植物纤维素类物质最高效的微生物之一。近年来,大量厌氧真菌和甲烷菌共培养菌株被分离。共培养中,甲烷菌通过对厌氧真菌代谢产物的利用显著提高厌氧真菌对木质纤维素的降解;厌氧真菌通过为甲烷菌提供能量和营养物质使甲烷菌快速生成大量甲烷。全面深入地了解共培养中两者的互作关系以及共培养降解木质纤维素产甲烷的特性,将有助于研究对木质纤维素降解以及甲烷生成的调控。因此,本文主要综述了共培养的分离鉴定、多样性、互作关系以及对木质纤维素的降解。

  • 曹德民,宋晓峰,朱宝利

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200098

    Abstract:

    肠道微生物影响着人体的营养、代谢、免疫等多种生理活动,对人体健康有非常重要的影响。目前的研究表明,肠道微生物在病毒感染性疾病的感染及预后过程中发挥着重要的作用。本文分别总结了肠道病毒感染、非肠道病毒感染与肠道微生物的相互作用关系以及微生态调节干预病毒感染等内容,以期为相关研究的进一步深入和病毒感染性疾病的防治提供新思路。

  • 李文骥,郑平

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200120

    Abstract:

    单质硫(硫粒)是硫化物生物氧化的中间产物。按化学计量式精准调控O/S比(溶解氧与硫化物的摩尔比),单质硫可成为硫氧化细菌(Sulfur-oxidizing bacteria,SOB)的主要代谢产物。根据单质硫的分布,单质硫可分为胞内硫粒和胞外硫粒。单质硫由胞内向胞外的跨膜转运过程是泌硫型SOB的重要生理特征。从生物脱硫系统中回收单质硫,可实现废物资源化,具有重大意义。本文综述了硫氧化细菌源单质硫的生成过程、赋存形式、代谢特性、转运机理及生物脱硫系统中的单质硫回收,以期为新型泌硫型生物脱硫工艺的研发提供参考。

  • 崔灿,杨海涛,王泽方

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200133

    Abstract:

    在过去的10年中,以新德里金属β-内酰胺酶-1(NDM-1)为代表的金属β-内酰胺酶在全球范围内广泛传播,对公共卫生安全产生了较大的威胁。尤其是近些年这些酶的突变体的出现使得耐药菌给人类健康造成了更加复杂和困难的挑战。目前,临床上仍然缺乏有效的治疗药物和手段。研发有效广谱的抑制剂成为解决此问题的重点。因此本文将针对NDM-1及其相关抑制剂复合物的三维结构解析工作进行综述,希望从生物学机制研究的角度带给相关研究人员一点启发和帮助。

  • 毕银丽,解琳琳

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200171

    Abstract:

    生态修复是目前全球关注的热点问题,如何增加植被的覆盖度及生态修复效率是目前研究的重点。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi,AMF)和深色有隔内生真菌(dark septate endophyte,DSE)均是自然界植物根际分布广泛的一类内生真菌,均能与植物形成菌根共生体,具有一定的促进植物生长、抵抗逆境及修复污染土壤等功能与作用,在生态修复中具有广泛的应用潜力。本文综述了AMF及DSE两种微生物的功能、作用及其在生态修复应用中的研究进展,并进一步对AMF和DSE在生态修复中存在的问题和前景进行展望。

  • 宋凯,郭晓春,陈博,何亚文

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200598

    Abstract:

    黄单胞菌是一类引起多种作物病害的病原细菌总称。它们利用自身产生的DSF(Diffusible signaling factor)-家族群体感应(quorum sensing,QS)信号分子感应群体密度,调控致病相关基因的表达。当黄单胞菌培养达到对数生长后期时,培养体系中DSF信号分子浓度迅速降低,呈现一种典型的群体感应信号反转(turnover)现象。编码脂酰辅酶A连接酶的基因rpfB在黄单胞菌生长后期表达量显著提高,敲除rpfB导致DSF生物合成显著提高,因此,RpfB参与DSF-家族QS信号分子的降解,在群体感应后期引导黄单胞菌退出群体感应状态。DSF信号通过RpfC/RpfG双组分系统、环二鸟苷酸和全局性转录因子Clp负调控rpfB的表达。DSF群体感应信号关键降解基因rpfB存在于多种细菌中,表明该信号反转机制相对保守,但其调控的生物学功能因菌而异。

  • 赖鉴添,杨婷,史发超,和锐敏,王鑫,邵丹青,何琴,卢颖林,胡黎明,安玉兴

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190633

    Abstract:

    [目的] 从甘蔗叶堆肥中分离筛选具有高效溶磷及促生功能的菌株,为微生物肥料制备提供一种可利用的菌种资源。[方法] 以Ca3(PO42和Zn3(PO42为磷源,进行平板溶磷筛选实验;采用形态学特征和ITS rDNA序列分析法进行菌种鉴定;采用液体摇瓶培养测定菌株的溶磷能力;将溶磷菌接种至辣椒幼苗根部分析其促生效应。[结果] 从堆肥中筛选得到1株高效溶磷真菌DC30-2-P1,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),菌株在Ca3(PO42和Zn3(PO42培养基的菌落直径(d)分别为55.33 mm和45.00 mm,透明圈直径(D)分别为65.33 mm和67.67 mm,(D/d)分别为1.16和1.50,菌株溶磷效果明显;在以Ca3(PO42(5 g/L)为磷源的液体培养基培养至96 h,有效磷含量达到2973.85 mg/L。盆栽试验结果表明接种DC30-2-P1对辣椒生长具有明显促进作用,与无添加溶磷菌处理组比较,其地上部鲜重和干重分别增加了18.6%和43.5%,地下部鲜重和干重分别增加了30.2%和25%,株高增加了13.6%,叶绿素含量增加了44.9%,植物全磷含量和土壤有效磷含量均提高了80%以上。[结论] 筛选到的菌株DC30-2-P1在溶解难溶性磷化合物、促进作物对磷的吸收和生长有良好效应,为微生物制剂的开发提供菌株资源。

  • 覃晓云,李芳,王树军,刘志媛

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200094

    Abstract:

    [目的] 为建立根癌农杆菌介导的莱茵衣藻快速简便高效的遗传转化体系,本研究以模式生物莱茵衣藻为受体材料,从转化方法和转化子快速鉴定两个方面进行了优化。[方法] 比较了固体培养基共培养转化方法和液体培养基共培养转化方法对根癌农杆菌LBA 4404介导的莱茵衣藻CC425转化效率的影响;研究并比较了(1)首先经过TE裂解再进行PCR(两步法)和(2)不经TE裂解直接进行PCR(一步法)的两种转化子鉴定方法的最佳反应条件和扩增效率。[结果] 农杆菌LBA 4404和莱茵衣藻CC425液体培养基共培养5 d后的转化效果最好,转化率达43.33±1.67个转化子/106个藻细胞。PCR最佳反应条件为:使用高保真DNA聚合酶Taq 1进行扩增;参加PCR反应的细胞密度为5×103-5×106个/mL;TE裂解缓冲液沸水浴20 min(两步直接PCR方法),或者预变性15 min(一步直接PCR方法)。两步法直接PCR的扩增效率优于一步法,但后者反应步骤更简洁。[结论] 本研究建立并优化了农杆菌液体介导莱茵衣藻遗传转化体系,该体系可快速获得遗传转化子,减少转化工作量。

  • 朱晓峰,张桢,崔雷鸿,朱伟云,杭苏琴

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200102

    Abstract:

    [目的] 对3株乳酸杆菌和4种寡糖类益生元进行组合筛选,并探究其对猪结肠微生物体外发酵特性的影响。[方法] 将3株乳酸杆菌(罗伊氏乳杆菌L45、植物乳杆菌L47和罗伊氏乳杆菌L63)分别添加至以菊粉(inulin)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)或乳果糖(lactulose)为唯一碳源的培养基中,结合菌株24 h的生长活性和产酸特性,筛选出最优组合;进一步利用体外发酵技术探究所筛选合生元组合对微生物和发酵特性的影响。[结果] L45和L63分别以FOS和Lactulose为碳源发酵时的生长曲线与葡萄糖相似,L47发酵Inulin和FOS的△OD600显著高于葡萄糖(P<0.05),且L47发酵Inulin产生的乳酸是葡萄糖的1.20倍,L47+FOS和L47+Inulin组合效应较好。体外发酵结果表明,与对照组相比,L47+FOS和L47+Inulin降低了发酵液中螺旋体门(Spirochaetes)的相对丰度,提高了乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度;L47+Inulin和L47+FOS显著提高了总短链脂肪酸含量(P<0.05);与L47+Inulin组相比,L47+FOS组乙酸和丁酸含量更高(P<0.05)。[结论] L47+FOS与L47+Inulin具有较好的组合效应,且具有改善猪结肠体外发酵的能力,提示L47+FOS和L47+Inulin作为合生元的发展潜力,两种组合在体内情况的效果有待深入研究。

  • 范伟祥,曹艳丽,崔璐璐,逯晓寒,林海,孙淑红

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200110

    Abstract:

    [目的] 旨在对鸡源丁酸梭菌进行分离鉴定与安全性评估。[方法] 利用厌氧培养方法对源自汶上芦花鸡与SPF鸡粪便样品进行丁酸梭菌的分离与纯化,挑选可疑菌落进行微生物质谱鉴定,进一步通过16S rRNA基因测序进行鉴定,16S rRNA测序结果与NCBI核苷酸数据库中丁酸梭菌的16S rRNA序列进行同源性分析;同时,进行所有分离株对氧氟沙星、头孢吡肟等9种药物的药敏试验,利用PCR方法进行mefA等23种耐药基因扩增,基于益生菌安全要求对样品进行alpha等4种梭菌毒素基因以及typeA等4种肉毒毒素基因的测定。[结果] 共分离鉴定了24株丁酸梭菌。24株均对氧氟沙星等7种抗生素表现为敏感,L-1、L-6、L-12仅对新霉素表现为中介,L-19仅对头孢吡肟表现为中介。全部菌株的mefA等16种耐药基因结果全部为阴性,sul2florblaTEM 3种耐药基因全部呈阳性,tetC携带率为79.2%,cmlA携带率为45.8%,blaOXA携带率为37.5%,aadB携带率为12.5%,qnrA携带率为4.2%。PCR结果显示所有分离菌株的alphabetaepsiloniota等4种梭菌毒素基因携带率0%。全部分离菌株均未携带typeAtypeBtypeEtypeF 4种肉毒毒素基因。[结论] 结果表明,从未饲喂抗生素和丁酸梭菌的汶上芦花鸡与SPF鸡群中获得的24株丁酸梭菌分离株达到预期的安全性要求,可作为益生添加菌的筛选参考株。

  • 姜宏,杜郑君,钱莺莺,陈楠,蔡梦宇,费晴如,陈静静,周育

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200122

    Abstract:

    [目的] 探究微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对AFB1的降解活性,并确定漆酶在菌株CW117降解代谢AFB1过程中的贡献。[方法] 从微嗜酸寡养单胞菌基因组中,共筛选到两个漆酶基因lc1lc2,并用大肠杆菌BL21外源表达蛋白rLC1和rLC2,在体外检测其对AFB1的降解活性。同时参考前人报道,研究了氧化性辅剂对漆酶AFB1降解的促进作用。在体外实验基础上,利用自杀质粒pK18mobsacB,以同源重组方法构建了两株漆酶缺失株CW117lc1和CW117lc1-lc2,验证了漆酶基因(lc1lc2)对AFB1体内降解作用。[结果] 体外实验显示,重组酶rLC1具有AFB1降解活性,氧化性辅剂ABTS、AS或SA可显著地提高rLC1降解活性,但rLC2未显示降解活性。突变株CW117lc1和CW117lc1-lc2对AFB1仍显示了较高的降解活性,且在大多数降解时间点与野生株CW117无显著差异。[结论] 微嗜酸寡养单胞菌CW117菌株中,LC1在体外显示了AFB1的降解活性,且降解活性可以被氧化性辅助因子增强,LC2未显示体外降解活性;体内试验发现,漆酶基因lc1lc2对菌株CW117降解AFB1的贡献较小,该菌株还存在其他降解途径。

  • 肖宇,李河

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200124

    Abstract:

    [目的] 由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。[方法] 根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株△Cfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株△Cfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。[结果] 与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体△Cfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞。[结论] 研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。

  • 顾美英,古丽尼沙·沙依木,张志东,朱静,刘晓静,唐琦勇,欧提库尔·玛合水提,宋素琴,冯雷,唐光木,徐万里

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200131

    Abstract:

    [目的] 黑果枸杞是我国荒漠区特有的药用盐生植物,本研究分析了黑果枸杞不同组织中内生细菌群落多样性特征及分布规律。[方法] 应用Illumina MiSeq高通量测序技术对黑果枸杞内生细菌的16S rRNA V5-V7区域序列进行测定,并分析群落组成、多样性及功能等生物学信息。[结果] 黑果枸杞不同组织内生细菌群落多样性及功能均有较大的差异。花、叶、果、茎和根产生的OTUs分别是182、173、119、187和254,群落多样性表现为根 > 花 > 果、茎 > 叶。从门水平上看,变形菌门是优势菌门,在不同组织中均有分布,花、叶、果、茎和根中的相对丰度分别为87.66%、41.51%、81.76%、97.67%和61.85%。在属水平上显示内生细菌的分布表现出器官差异性。花部能够准确分类的优势菌属为沙雷氏菌属和不动杆菌属,相对丰度分别为11.57%和8.55%。叶部为红球菌属和慢生根瘤菌属,相对丰度分别为29.68%和5.53%。果实中为泛菌属、红球菌属和沙雷氏菌属,相对丰度分别为23.12%、5.52%和4.29%。茎部为沙雷氏菌属和假单胞菌属,相对丰度分别为12.03%和17.71%。根部为盐单胞菌属、FodinicurvataLipingzhangella,相对丰度分别为24.18%、5.16%和4.86%。在不同组织中分布较广的盐单胞菌、沙雷氏菌、不动杆菌、红球菌、泛菌等菌属均具有较高耐盐性和促生、生防、降解有机污染物及抗氧化等功能。PICRUSt功能预测分析显示,黑果枸杞组织中内生细菌功能中涉及丰富的多糖、萜类和酮类、酶及维他命等次生代谢产物的生物合成。[结论] 黑果枸杞内生细菌具有丰富的群落和功能多样性,拥有多种益生功能性状,也含有多个与人和植物体代谢相关的功能信息。不同组织优势菌属和功能信息各有不同,其中根部的内生细菌物种最丰富,花部和茎部参与各种代谢调控的细菌丰度最高。此外,不同组织中还含有大量未知种属的微生物类群,这些都为内生细菌功能利用和挖掘新的有益微生物资源提供广阔的发展空间。

  • 刘会芳,韩宏伟,王强,庄红梅,王浩

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200139

    Abstract:

    [目的] 番茄是一种受连作障碍影响明显的蔬菜作物,本试验旨在研究不同蔬菜作物与番茄轮作后对设施土壤微生物多样性、酶活性及土壤理化性质的影响,以期筛选出适宜与番茄轮作的蔬菜作物,为从设施栽培模式选择角度缓解或避免番茄连作障碍提供理论依据。[方法] 试验以连续两茬种植番茄后分别种植大白菜(A)、黄瓜(B)、辣椒(C)、茄子(E)、秋葵(F)、西葫芦(G)6种作物为不同处理,以继续种植番茄(D)和休耕闲置土壤(H)为对照,采用16S rRNA和真菌ITS区测序、同时测定土壤酶活性、pH值、有机质含量、速效氮、磷、钾含量,研究不同蔬菜作物与番茄轮作对土壤微生物多样性、酶活性及土壤理化性质的影响。[结果] 种植作物土壤细菌和真菌多样性指数均显著高于闲置土壤(H);番茄连作与轮作土壤中的细菌门水平群落结构比较固定,但不同物种的丰度差异较大。真菌对于环境变化的响应比细菌更加敏感,轮作各样本间真菌群落结构差异明显大于细菌群落结构,在物种丰度和门水平上均存在较大差异;轮作茄子和大白菜显著增加了土壤中硝化细菌[亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)]的丰度;PCA分析表明轮作茄子和空白闲置土壤细菌和真菌的群落结构与其他处理的差异较大;轮作不同作物土壤酶活性差异显著,但变化规律不明显。轮作大白菜、黄瓜和空白闲置土壤过氧化氢酶活性显著高于番茄连作和轮作其他作物。不同蔬菜轮作土壤肥力主成分分析结果表明土壤pH值、有机质、速效氮与速效磷是主要贡献因子,综合肥力排名第一的为空白土样,其次为轮作黄瓜的土样,综合肥力最低的为轮作茄子土样。[结论] 种植作物可以显著提高土壤微生物多样性;轮作茄子和大白菜显著增加了土壤中硝化细菌的丰度,有利于土壤中氮素代谢和利用;轮作黄瓜和大白菜,显著提高土壤中过氧化氢酶的活性,有利于降低番茄连作产生的自毒作用。因此综合分析认为,茄子、黄瓜和大白菜是避免或缓解番茄连作障碍的潜在优势轮作作物。

  • 张琦,梁雅静,张宇馨,陈玲慧,韩钟娆,李贝贝,金一,何晓青

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200151

    Abstract:

    [目的] 为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。[方法] 将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。[结果] 利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。[结论] 本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。

  • 祝友朋,韩长志

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200155

    Abstract:

    [目的] G蛋白信号调控因子(RGS)作为G蛋白信号转导途径的负调控因子,在植物病原菌的致病性和有性生殖调控方面发挥着重要作用。研究真菌中RGS蛋白类型与其理化性质及特征的关系,为今后深入开展不同真菌中具有不同类别RGS的功能解析打下坚实的理论基础。[方法] 前期对模式生物、病原菌、非致病菌等49个真菌中229个RGS蛋白序列进行找寻,并根据其保守结构域和同源性确定RGS类型有DEP-RGS、RGS-TM、PXA-RGS-PX、RGS、RGS-PAS-PAC、TM-RGS等6类。利用蛋白质数据库、ProtComp v9.0、PHD以及MEME等网站对上述RGS蛋白进行理化性质、亚细胞定位以及二级结构、基序等特征分析。[结果] 上述不同类别的RGS蛋白具有明显的类别特征性,同时,也具有以下共同特征:理论等电点集中在6.01-7.00;不稳定性系数集中在40.01-60.00;95%以上的RGS蛋白属于亲水性蛋白;亲水性最强氨基酸残基存在较多的是R、D、E、Q、N;疏水性最强氨基酸残基存在较多的L、A、V、F、I;二级结构组成特征为b折叠较少;转运肽情况尚未明确;亚细胞定位多集中在细胞核。[结论] 真菌中6类RGS蛋白的理化性质具有一定的共同特征,但不同类别的RGS蛋白也具有明显的类别特征,主要表现在保守结构域、二级结构、等电点、转运肽和亚细胞定位情况。

  • 朱佳芯,张庚,商美妮,刘红军,沈宗专,李荣,沈其荣

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200159

    Abstract:

    [目的] 为筛选安全、高效的耐热木霉功能菌株,有效促进热作区香蕉的生产,本研究从热作区土壤分离筛选适温范围较宽的木霉菌株,研制木霉生物有机肥,并研究其对香蕉枯萎病发病率、果实产量及品质的影响。[方法] 通过稀释涂布法筛选出木霉菌株,根据菌株在不同温度下的生长情况、拮抗尖孢菌能力及酶活强弱进行菌株复筛;将复筛所得菌株试制成生物有机肥,在田间条件下,研究木霉生物有机肥的施用对香蕉发病率、产量及品质的影响;最后结合菌株ITS及tef1序列分析鉴定所选菌株的分类信息。[结果] 从海南土壤中筛选出4株耐热木霉菌株,其在20-40℃能生长,其中菌株JS84在40℃高温下生长速度最快,对尖孢镰刀菌4号生理小种抑制率最高,产酶活力能力最强。田间试验结果表明:施用JS84木霉生物有机肥(JS84)显著降低了香蕉枯萎病发病率;有效改善了香蕉果实品质并提高了土壤养分;该处理产量显著高于不施肥对照、化肥处理、有机肥处理和商品木霉生物有机肥处理(NJAU4742),分别增产32%、18%、8%和6%。ITS结合tef1序列分析结果表明,JS84菌株为桔绿木霉菌(Trichoderma citrinoviride)。[结论] 从热作区土壤中成功筛选到一株桔绿木霉JS84,其适宜生长温度宽,研制的木霉生物有机肥对热区香蕉具有显著的抗枯萎病及增产作用。

  • 王天乐,刘喜朋

    2021, DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200169

    Abstract:

    [目的] 克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidusA.fulgidus)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。[方法] 将A.fulgidus RecJ(AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物,体外反应后,利用8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物。[结果] AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3'-5'外切核酸酶活性,酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+,且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+;其最适反应温度范围为55-65℃;高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性。AfuRecJ还具有单链RNA 3'-5'外切酶活性,且活性高于单链DNA底物。单链核酸3'末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用。AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性,可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA,而且对双链DNA中的3'单链DNA结构(3'突出单链尾巴与末端分叉结构)具有类似单链DNA的水解活性。[结论] 本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3'-5'外切核酸酶,且相比单链DNA,单链RNA为优势底物,推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复。

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