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主 管 单 位 中国科学院

主 办 单 位 中国科学院微生物研究所 中国微生物学会

编 辑 出 版 月刊

邮 发 代 号 2-504

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  • 蒋富凤,雷涛,吴清平,张菊梅,庞锐

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200032

    Abstract:

    副溶血性弧菌是一种广泛存在于海产品中并可引起人类急性肠胃炎的食源性致病菌。该菌形成的生物被膜能够增强体外环境中的存活率,促进对宿主的定殖和感染,还会导致被污染的加工设备与食物之间发生交叉感染。深入了解生物被膜形成背后的调控机制,有助于制定有针对性的策略,干扰其适应环境变化的过程,从而降低副溶血性弧菌对人类的危害。本文主要综述了鞭毛、菌毛和胞外的多糖等基质组分在生物被膜形成中的作用以及c-di-GMP和群体感应对生物被膜形成的调控。

  • 左月婷,薛亮,吴清平,高珺珊,张菊梅

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200034

    Abstract:

    诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的重要食源性病原之一。由于体外复制系统和感染模型的缺乏,研究人员对其宿主保护性免疫的理解始终有限,导致控制病毒感染方面的研究也受到较大阻碍。近年来,随着病毒衣壳蛋白外源表达、替代病毒的使用、志愿者实验的开展,尤其是细胞培养模型的突破,使得体液免疫和细胞免疫的研究取得较大进展。因此,本文针对诺如病毒感染宿主的先天性免疫、体液免疫和细胞免疫应答机制等进行了综述,并对后续其在诺如病毒候选疫苗研制等领域的应用进行了展望。

  • 杨钰婷,陈瑾,陈姗姗,周顺桂

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200089

    Abstract:

    群感效应(quorum sensing,QS)是微生物之间以信号分子受体蛋白感知信号浓度变化,从而调控菌群的行为及功能,使其适应环境变化的信号通讯机制。电活性微生物(electroactive microorganisms,EAMs)能进行胞外电子传递,在可再生能源利用和环境修复方面具有广阔的应用前景。近年来,关于QS在EAMs胞外电子传递中的作用的研究日益增多。本文总结了QS对纯EAMs或混合产电菌群的直接或间接电子传递的影响效应及机制,阐述了基于QS的EAMs逻辑与门的构建及其应用前景,并从机制研究的角度展望其未来发展方向。

  • 潘晖,刘欣欣,孔令慧,夏永军,印伯星,艾连中,熊智强

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190630

    Abstract:

    [目的] 研究精氨酸代谢调控蛋白ArgR对嗜热链球菌胞外多糖(EPS)合成的调控作用。[方法] 利用大肠杆菌异源表达嗜热链球菌ArgR蛋白,通过尿素变性-复性和Ni2+亲和层析纯化。采用凝胶电泳迁移(EMSA)和生物膜层干涉(BLI)分析ArgR和eps基因簇中PepsA启动子的相互作用和动力学信息。构建过表达和弱化argR基因菌株,利用苯酚-硫酸法测定其合成EPS差异。[结果] 大肠杆菌异源表达的ArgR为包涵体,使用尿素变性-复性纯化可获得2.95 mg/mL可溶性蛋白;EMSA和BLI结果显示ArgR和启动子PepsA有特异性结合,且结合因解离水平低而稳定;过表达argR基因可显著降低嗜热链球菌EPS合成,而弱化argR基因则提高EPS合成。[结论] 本研究表明ArgR能特异性结合嗜热链球菌eps基因簇启动子,并负调控EPS生物合成。

  • 闫敏,秦诗洁,崔永亮,涂卫国,沈甜,刘含,张芳,余秀梅

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200014

    Abstract:

    [目的] 探究镉吸附细菌是否能够高效固定土壤有效镉(Cd),为土壤有效Cd的微生物固定提供理论依据。[方法] 利用含Cd2+牛肉膏蛋白胨液体培养基对细菌进行Cd的耐受性测试筛选出镉抗性强的菌株;通过16S rRNA基因相似性及系统进化分析鉴定耐镉细菌,将菌细胞加入含CdCl2溶液中进行Cd2+吸附效率测定;通过土培模拟实验,测定土壤pH、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质、CEC、有效Cd及微生物数量来分析镉吸附细菌对镉污染土壤的影响。[结果] 从德阳鱼腥草根际土壤中分离获得的57株细菌对Cd2+表现出不同程度的抗性,并从中筛选出3株耐Cd优势细菌普罗威登斯菌属(Providencia)DY8、芽孢杆菌属(Bacillus)DY3和芽孢杆菌属(Bacillus)DY1-4。其对溶液中的Cd2+表现出较好的吸附作用,吸附效率随着Cd2+浓度升高而降低。DY8、DY3、DY1-4能使镉污染土壤中有效Cd含量分别降低72.11%、68.55%、62.32%,同时显著提高镉污染土壤中碱解氮、有效磷的含量。[结论] Cd污染农田土壤中含有丰富的耐Cd微生物资源,Cd吸附细菌能降低土壤中有效Cd的含量,且能有效改善土壤养分条件。

  • 熊悯梓,钞亚鹏,赵盼,宋双伟,石莹莹,莫乘宝,仲乃琴

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200021

    Abstract:

    近年来,随着国家对马铃薯产业重视程度的增加,生产的专业化和规模化程度越来越高,化肥农药用量不断加大,加之连作等种植模式,致使以疮痂病为代表的土传病害普遍发生且逐年加重,个别地块发病率达90%以上,给种植业者带来巨大的经济损失。[目的] 为了探索马铃薯疮痂病发生与土壤环境的关系,分析区域性种植方式和施肥量对土壤细菌种群变化的影响,为实现土传病害有效防治提供借鉴。[方法] 本文分别从1年连作土传病害轻的宁夏西吉(西北)、3年连作土传病害严重的河北沽源(华北)、5年轮作未发现土传病害的内蒙古海拉尔(东北)大田马铃薯根际采集土壤,利用高通量测序技术,比较了样品间细菌群落结构差异。[结果] 3组样品共获得有效条带617558条,可分类操作单元(OTUs)3077个。各样品中变形菌门(Proteobacteria)数量最多,含量均在33%以上。与未发病土壤样品相比,土传病害发生严重的样品中细菌数量、物种数、细菌多样性、种类丰富度均有所降低,有害菌数量增加,益生菌数量减少。其中,放线菌(Actinobacteria)数量明显增多,变形菌(Proteobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)和酸杆菌(Acidobacteria)数量明显减少,组分及数量差异明显的细菌(尤其是放线菌门)大多与土壤全磷含量呈显著相关。[结论] 过量施用化肥和常年连作改变了土壤细菌群落结构,生态环境恶化,导致土传性病害发生。其中,磷可能是影响土壤微生物群落结构变化最主要的肥料元素。

  • 饶俊超,张荣珍,徐岩

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200027

    Abstract:

    [目的] 利用木聚糖为辅助底物加强手性催化反应中的辅酶循环,构建来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶II(SCRII)、枯草芽孢杆菌(Bacillussp.)YX-1葡萄糖脱氢酶突变体Ala258Phe/GDH和里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30木聚糖酶(XYN2)在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中的融合表达体系,高效合成(S)-苯乙二醇。[方法] 调节3种酶编码基因在pET-28a载体上的位置,运用重叠延伸PCR技术,构建了E.coli/pET-SCRII-A258F-XYN2和E.coli/pET-A258F-SCRII-XYN2两种重组菌,研究了其合成(S)-苯乙二醇的最适反应条件。[结果] 重组菌株E.coli/pET-SCRII-A258F-XYN2在底物2-羟基苯乙酮与辅助底物木聚糖的比例为1:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达98.8%(W/W);而重组菌株E.coli/pET-A258F-SCRII-XYN2在底物与辅助底物的比例为2:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达95.6%(W/W),两者合成产物的光学纯度均>99%。[结论] 通过构建3种酶的融合表达体系,成功将木聚糖酶和葡萄糖脱氢酶突变体介导的辅酶再生循环体系引入不对称生物合成反应,提高了手性转化效率,为将大自然中丰富的木聚糖用于手性催化奠定了较扎实的研究基础。

  • 张少飞,张园,申传璞,陈奇

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200029

    Abstract:

    [目的] 分离Streptomyces sp.NO1W98中的杀黑星菌素并鉴定其生物合成基因簇。[方法] 利用有机溶剂萃取法对Streptomyces sp.NO1W98放大规模发酵产物进行提取;以正向、反向色谱柱层析进行化合物的分离纯化;借助波谱学手段进行单体化合物的结构鉴定;采用Illumina Hiseq技术进行基因组序列测定,对得到的序列进行生物信息学分析、注释并定位杀黑星菌素的生物合成基因簇vtd,利用基于PCR-targeting的遗传操作系统构建vtd内相关基因的阻断突变株,同时利用pSET152AKE进行基因回补,并分析与野生菌株的发酵产物差异。[结果] 从NO1W98发酵产物提取物中初步分离鉴定了2个大环内酯类化合物杀黑星菌素A(1)和B(2);NO1W98的基因组大小约为11.6 Mb,蕴涵49个次级代谢产物生物合成基因簇,其中scaffold 3上的Region 3.3可能负责杀黑星菌素的生物合成;基因阻断和回补实验初步鉴定了杀黑星菌素的生物合成基因簇,包含6个骨架基因、5个转运基因、2个调控基因以及9个后修饰基因。[结论] 杀黑星菌素的分离、结构鉴定和基因簇的鉴定以及生物合成途径的推导为其遗传改造和工程菌株的构建奠定了分子基础。

  • 郑豆豆,罗素亚,杜穆花,何广正,徐书景,鞠建松

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200033

    Abstract:

    [目的] 通过易错PCR技术提高鼠伤寒沙门氏菌中丙氨酸消旋酶的催化活性。[方法] 利用易错PCR技术构建丙氨酸消旋酶基因alrSt的突变体文库,采用缺陷菌株UT5028筛选突变体基因,以D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性,通过凝胶过滤层析法分析酶蛋白寡聚化状态,并采用HPLC检测酶蛋白的动力学参数。[结果] 经过易错PCR及定点突变技术最终获得了3个催化活性有所提高的突变体A3V、Y343H和A3VY343H,酶学特性分析发现,与野生型蛋白StAlr相比,突变体Y343H仅对底物L/D-丝氨酸的催化效率略有提高,kcat/Km值分别是StAlr的2.01和3.68倍;而突变体A3V则对底物L/D-丙氨酸或L/D-丝氨酸的Kmkcatkcat/Km值均有较大幅度的改变,其kcat/Km值分别是StAlr的105.51、97.36、4.63和10.73倍。凝胶过滤层析结果显示,突变体A3V在蛋白含量极低时就呈现出单体和二聚体共存状态,且随着蛋白含量的增加,其向二聚体状态迁移的速率最为明显。[结论] 丙氨酸消旋酶StAlr的第3位点是影响其催化活性和低聚合状态的关键位点。

  • 崔佳丽,游金坤,李洁实,乔腾生,董训赞

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200040

    Abstract:

    [目的] 研究核桃壳提取液(walnut shell extracts,WSE)对单针藻Monoraphidium sp.QLZ-3生长和油脂积累的影响。[方法] 向BG-11培养基中添加不同量的WSE(培养基中保留有BG-11中全部营养成分)。[结果] 结果显示,当BG-11培养基中的WSE含量为40%时,单针藻的生物量产率及油脂产率达到(534.70±4.07)mg/(L·d)和(296.35±15.36)mg/(L·d),相比对照组分别提高了的14.82%和33.50%,蛋白质和碳水化合物含量分别有不同程度的上调和下调。与对照组相比,微藻中谷胱甘肽(glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量与活性均上调。此外,WSE作用下,微藻对多酚的移除达到84.37%,同时上调了核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,rbcL)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,accD)基因的表达量。[结论] 研究表明,WSE联合BG-11可以提高微藻的生物量产率和油脂产率,降低微藻培养的原料成本,为核桃壳的资源化利用及微藻的工业化生产提供了一定的技术支撑。

  • 张立伟,石玉祥,张永英,李欣泽,郝贺,朱原,周双,王芝超,杜瞳彤,阿合玛尔列·海依拉提,时欣欣,韩旺,仝星,朱阵

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200044

    Abstract:

    [目的] 本试验旨在阐明鸡源大肠杆菌致病性及分子流行特性,为探索大肠杆菌流行途径制定合理的防控策略提供新思路。[方法] 2018–2019年在河北省采集病死鸡肝脏样品,通过选择培养基筛选、生化鉴定、血清凝集试验对分离菌株进行系统鉴定,应用PCR方法检测分离株中毒力基因流行情况。参考系统发育群分类方法对大肠杆菌进行分群分析,并参照McMLST网站数据库提供的7对管家基因序列进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。[结果] 结果显示,56株分离株符合大肠杆菌生化特征,分为8个生化表型,B4(30.36%)、B5(25%)和B2(23.21%)为主要生化表型。56株分离株大肠杆菌血清凝集试验均呈阳性,分为11种血清型,O78(26.79%)、O2(23.21%)、O157(17.86%)和O1(14.29%)为主要流行血清型。56株大肠杆菌共检测出15种肠外大肠杆菌毒力基因,未检出papCibeAibeB基因。黏附相关基因fimC和抗血清存活因子相关基因ompA携带率为100%。aatAyijPirp2matiss,检出率分别为98.21%、98.21%、98.21%、96.43%、92.86%。同时,大肠杆菌与铁转运相关基因iroNfyuAiucDirp2检出率均在80%以上。56株大肠杆菌中有20株属于肠出血型大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC),其次是肠聚集型大肠杆菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)(n=4)、肠产毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)(n=2)。这些菌株D群分离株较多,其次是B2群。通过MLST分型分析,共分为22个ST型,其中ST88(n=7)、ST85(n=6)、ST243(n=6)型为主要流行型。[结论] 结果显示大肠杆菌血清型多样,毒力因子种类繁多,致病性大肠杆菌同时携带多种毒力基因,表明动物源大肠杆菌具有较强的毒力基础。

  • 甘莉,祝艺然,卢亦杰,孙静,陈中炜,程昌勇,宋厚辉

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200061

    Abstract:

    [目的] 本试验旨在构建单核细胞增多性李斯特菌谷胱甘肽合成酶基因gshF缺失株和互补株并研究其在细菌运动和鞭毛形成中的调控作用。[方法] 采用同源重组的方法构建得到gshF缺失株后,测定野生株及缺失株的运动性和体外生长能力;同时利用荧光定量PCR方法检测gshF缺失株中鞭毛相关基因转录水平的变化。[结果] 缺失gshF后细菌在体外培养基中的生长能力未受影响,但缺失株的运动性及鞭毛形成能力显著降低。此外,缺失株中鞭毛形成重要调控基因gmaR以及鞭毛结构元件基因flaA的转录水平显著低于野生株,而其他鞭毛相关基因的转录水平变化不明显。[结论] 研究首次表明单增李斯特菌谷胱甘肽合成酶通过调控鞭毛重要基因的转录进而影响细菌的运动性和鞭毛形成,研究有助于深入理解重要食源性胞内菌通过精确调控鞭毛形成以适应外界和宿主环境的分子机制。

  • 王超,崔艳华,曲晓军

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200067

    Abstract:

    [目的] 在乳酸乳球菌NZ9000中异源表达德氏乳杆菌保加利亚亚种中由双组分系统TCS1(JN675228/JN675229)调控的与酸适应相关基因,进而探究德氏乳杆菌保加利亚亚种应对酸胁迫的机制。[方法] 通过逆转录聚合酶链式反应和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证由德氏乳杆菌保加利亚亚种TCS1调控的与酸适应相关基因中腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)、D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶(ddl)、寡肽ABC转运蛋白(oppDII)和延伸因子Ts(tsf)在乳酸乳球菌NZ9000中的表达情况。酸处理实验验证基因表达对宿主菌酸胁迫耐受能力的影响。并采用酵母双杂交验证双组分系统TCS1与表达的酸适应相关基因之间的互作关系及具体的互作部位。[结果] 结果表明,乳酸乳球菌NZ9000中成功表达了aprtddloppDIItsfaprtddl基因使重组菌对酸胁迫的抗性分别提高了75倍和114倍。oppDIItsf基因的表达对重组菌株的耐酸能力没有明显影响。酵母双杂交实验表明TCS1中的组氨酸蛋白激酶HPK1与Ddl之间存在相互作用,且HPK1-C结构域是二者相互作用的关键区域。[结论] aprtddl过表达菌株酸刺激的适应能力显著高于对照菌株,该研究结果可为德氏乳杆菌保加利亚亚种及类似菌株耐酸性特性的获得策略提供参考。

  • 柳朝阳,向利,王红梅,鲁小璐

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200070

    Abstract:

    [目的] 对湖南省锡矿山地区的砷氧化菌株的种属进行初步鉴定,并对砷锑氧化菌株Bosea sp.AS-1(简称AS-1)进行全基因组测序和生物信息学分析。[方法] 分离砷氧化菌株,并利用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。在此基础上,对能够高效氧化砷的菌株AS-1进行全基因组测序,对测序数据进行基因组装和功能注释、COG、GO及KEGG聚类分析,以及次级代谢产物合成基因簇与代谢途径预测等。[结果] 湖南省锡矿山的砷氧化菌株主要分布在α-、β-、γ-变形菌纲以及厚壁菌门。菌株AS-1基因组的测序结果显示AS-1基因组包含一条大小为5.536 Mb环状染色体和两个大小分别为189.9 kb和112.1 kb的质粒。对AS-1基因组进一步分析发现该菌株的基因组中包含砷锑代谢相关基因,还有鞭毛形成、鞭毛运动及生物膜形成的基因,这些基因的存在可能与AS-1能高效耐受和氧化砷和锑的特性相关。此外,菌株AS-1中还存在部分碳固定基因和硫氧化基因,这暗示着AS-1能够进行自养生长并氧化环境中的硫元素。[结论] 菌株AS-1可以在自养条件下生长并且能够氧化Sb(III)为Sb(V)。

  • 鲍奕达,张丽杰,郑鹏飞,陈海风,黄家全,徐岩

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200071

    Abstract:

    [目的] 解析郫县豆瓣及其酿造半成品-蚕豆醅与辣椒醅微生物多样性和来源,探究郫县豆瓣酿造过程风味化合物特征。[方法] 采用高通量测序法测定蚕豆醅、辣椒醅与混合醅(蚕豆醅-辣椒醅混合物,发酵成熟形成郫县豆瓣)在酿造过程中的微生物群落结构;利用高效气相质谱与高效液相色谱高通量检测蚕豆醅及辣椒醅中基础理化指标及挥发性、非挥发性风味化合物浓度;利用多种生物信息学分析方法对混合醅酿造微生物及风味化合物进行溯源。[结果] 微生物方面:44%–59%的混合醅细菌来源于辣椒醅,5%–22%的混合醅细菌来源于蚕豆醅,其他混合醅细菌来源未知。同时,42%–77%的混合醅真菌来源于辣椒醅,2%–18%的混合醅真菌来源于蚕豆醅,其他混合醅真菌来源未知。另外,16个细菌属由辣椒醅特异性贡献;2个细菌属及2个真菌属由蚕豆醅特异性贡献。化合物方面:1-辛烯-3醇(1-octen-3-ol)、苯乙醛(phenylacetaldehyde)、异丁醛(isobutyraldehyde)、苹果酸(malic acid)与糠醛(furfural)仅由蚕豆醅贡献。辣椒素(capsaicin)、3-甲基-1-丁醇(3-methyl-1-butanol)、已醇(hexanol)与异丁醇(isobutanol)仅由辣椒醅贡献。[结论] 郫县豆瓣发酵中大部分微生物来源于辣椒醅,大部分发酵底物(氨基酸及葡萄糖)来源于蚕豆醅。两种发酵半成品均特异性贡献微生物及风味化合物,形成郫县豆瓣的独特风味密码。

  • 冯艳茹,高亚君,杭小红,何勇强,姜伯乐

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200074

    Abstract:

    [目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将III型效应物(type III secreted effectors,T3SEs)分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端(1–1220 aa)和C端(1221–2030 aa)分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S::EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。

  • 孙明珠,潘珊珊,王迪,宫正,谢明杰

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200087

    Abstract:

    [目的] 研究染料木素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)外排蛋白的影响。[方法] 通过联合药敏实验检测染料木素影响MRSA对环丙沙星的敏感性;利用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)技术,检测染料木素作用MRSA41577后菌体蛋白表达量的变化;通过生物信息学方法对差异显著的蛋白进行系统分析;通过qPCR和尼罗红外排实验,探讨耐药相关的蛋白介导细菌耐药的作用机制。[结果] 联合药敏实验结果显示,染料木素能增强MRSA对环丙沙星的敏感性;通过iTRAQ技术检测到差异显著蛋白共有129个,包括60个表达上调的蛋白和69个表达下调的蛋白;生物信息学分析结果显示,与细菌耐药相关的蛋白约有14个,其中,通过主动外排系统介导细菌耐药的蛋白主要有PstB、PstS等;qPCR结果显示,与对照组相比,PstB、PstS的基因表达量分别下降了51.6%和78.6%;尼罗红外排实验结果显示,染料木素与尼罗红之间存在竞争关系,为MRSA41577的竞争性抑制剂。[结论] 染料木素可通过降低MRSA41577外排基因pstBpstS的mRNA表达量,进而影响PstB、PstS外排蛋白的表达来逆转细菌耐药;此外,染料木素还是MRSA41577的竞争性外排抑制剂,可通过与底物竞争外排的方式,使抗菌药物留在菌体内发挥抗菌作用。

  • 张朝晖,彭康,卢亚南,陆跃乐

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200096

    Abstract:

    [目的] 将一种可以高选择性水解R-甲霜灵的新脂酶基因,在大肠杆菌中进行克隆和表达,并研究重组脂酶的性质。[方法] 根据已知的目标酯酶N端10个氨基酸序列,在已测序的Albibacters sp. zjut528基因组中找到相匹配的一个酯酶基因,它全长969 bp,编码322个氨基酸,将该基因命名为RMest。通过引物扩增得到该基因的DNA片段,将它与表达载体pET-28a(+)连接后,转化大肠杆菌BL21Gold(DE3),构建重组菌,IPTG诱导表达该酯酶,并用Ni2+亲和层析介质进行纯化。[结果] 在重组菌RMest-pET-28a(+)-E.coli BL21 Gold(DE3)中成功表达了重组酯酶RMesterase,大小约为46 kDa。用胞内重组酶液催化水解R,S-甲霜灵,底物浓度10 g/L,反应6 h,底物转化率为49.8%,产物(甲霜灵酸)的eep为99.3%,对底物的对映体R-构型具有专一(选择)性。该酶最适温度和pH分别为40℃和pH 9.0。该酶的活性受到产物甲醇的抑制。通过Blast+在Uniprot KB数据库中搜寻与酯酶RMest同源的蛋白,采用邻近法构建该酶的蛋白系统发育树,结果显示它与某些Lysophospholipase、AB hydrolase-1 domain-containing protein和Esterase的同源性最高,但是与它们均存在较大的进化距离,表明该酶是一种相对独立进化的新酯酶。[结论] 在大肠杆菌中成功克隆和表达了一种新的脂酶基因RMest,重组酯酶RMesterase可以高手性选择性水解R,S-甲霜灵生成R-甲霜灵酸。

  • 邓益琴,徐力文,张亚秋,郭志勋,冯娟

    2020, Doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200129

    Abstract:

    [目的] 为探讨我国华南沿海海水养殖鱼类病原菌美人鱼发光杆菌的非典型毒力基因和耐药性的时空变化,解析影响其毒力和耐药性变化的可能环境因素,为该菌所引起的病害防控提供建议。[方法] 本研究以分离自我国广东和海南沿海患病海水鱼的35株美人鱼发光杆菌为研究对象,利用普通PCR扩增技术,分析5个非典型毒力基因在菌株中的分布情况,并采用纸片扩散法(K-B)分析菌株对15种抗生素的耐药性。[结果] 19株菌含有1–2个被检测的非典型毒力基因,尤其是hlyA和vvh的检出率均高于20%。35株菌多重耐药指数为0.00–0.67,表现出27种耐药谱,多重耐药率(菌株耐抗生素种类>3)达到60.00%,尤其对万古霉素、阿莫西林、麦迪霉素和利福平的耐药率均高于50%,但对庆大霉素、诺氟沙星、环丙沙星、氯霉素和氟苯尼考的耐药率均低于10%。非典型毒力基因含量和耐药性,呈现一定的随年份增加而增强以及海南>广东的时空差异,尤其是耐药性中的谱型丰富度、多重耐药率、某一菌株的最多耐药数量以及多重耐药指数,海南(分别是1.00,69.23%,10,0.32)均大于广东(分别是0.82,54.55%,9,0.25)。[结论] 美人鱼发光菌的非典型毒力基因可能是通过水平基因转移获得,海南与广东区域美人鱼发光菌毒力基因与耐药的差异主要受到温度和抗生素使用的影响。

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