2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 徐怀英, 黄迪海, 张伟, 秦春芝, 刘星丽, 王友令, 欧阳文军, 秦卓明
- XU Huai-Ying, HUANG Di-Hai, ZHANG Wei, QIN Chun-Zhi, LIU Xing-Li, WANG You-Ling, OUYANG Wen-Jun, QIN Zhuo-Ming
- 中国禽源新城疫病毒(NDV)流行株F和HN基因的遗传演化和变异频率
- Genetic evolution and substitutions frequency of F and HN gene of Newcastle disease virus isolates from poultry in China
- 微生物学通报, 2017, 44(12): 2933-2941
- Microbiology China, 2017, 44(12): 2933-2941
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170422
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文章历史
- 收稿日期: 2017-06-13
- 接受日期: 2017-08-28
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-09-15
2. 山东省健牧生物药业有限公司 山东 济南 250100;
3. 山东师范大学 山东 济南 250014
2. Shandong Jianmu Biological Pharmaceutical Co., Ltd., Jinan, Shandong 250100, China;
3. Shandong Normal University, Jinan, Shandong 250014, China
新城疫(Newcastle disease，ND)主要是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的家禽、野鸟等感染的一种烈性传染病，是危害中国乃至全世界养禽业最重要的疫病之一[1-2]。自1926年首次在英国发现以来，该病已在世界范围内流行近90年，给全球家禽和野生鸟类造成了严重危害，带来了巨大的经济损失。
NDV是一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒。依据其基因组大小，初步分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两大类。Class Ⅰ主要源自水禽，由15 198个核苷酸组成，主要为弱毒。Class Ⅱ由15 186和15 192两类核苷酸组成，除基因Ⅰ型和部分基因Ⅱ型为弱毒外，大部分为强毒。NDV基因组包含6个基因，分别编码3′NP-P-M-F-HN-L5′六种结构蛋白和两种非结构蛋白[3]。NDV的囊膜由F和HN两个糖蛋白组成，F糖蛋白能够融合宿主细胞膜，使病毒侵入宿主细胞内；HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中识别细胞受体，介导病毒吸附细胞膜，是极其重要的保护性抗原，这两种蛋白决定着NDV的抗原性(包括毒力等)和免疫原性[4-5]。
为探讨近20年来中国NDV分子遗传变异的趋势，课题组在总结前期研究的基础上，结合已在GenBank登录的国内外364株NDV序列，并以最早在国内发生的Ⅶ型Go/GD/QY/1997 (简写“QY97”)为参考毒株，从F和HN基因的核苷酸和氨基酸水平上分析比较其替代频率，旨在进一步探讨NDV的遗传变异规律，为NDV的合理防控提供依据。
1 材料与方法 1.1 NDV基因序列来源本课题组1997-2015年期间分离、鉴定并测序的89株NDV流行毒株的基因序列，以及从GenBank下载的364株具有代表性的国内外禽源NDV流行毒株和15株国内外经典毒株序列。
1.2 方法(1) 利用Lasergene 7.1和MEGA 5.1软件对NDV毒株的F和HN基因核苷酸(nt)和氨基酸(aa)序列进行比对，利用F和HN基因nt序列全长绘制系统发育树，参照Diel等方法进行基因分型[6]。
(2) 参照文献[7-8]的方法，利用MEGA 5.1软件，比较NDV流行株不同基因型的F和HN基因的核苷酸(氨基酸)替代频率。同时，以国内最早发生的Ⅶ型QY97为参考(GenBank登录号为KJ782375)，重点评价了1997-2015年在我国广泛流行的Ⅶ型NDV流行株的替代频率，并对其关键氨基酸位点进行分析，进而探讨其分子变异机制。
2 结果与分析 2.1 系统发育树的构建利用NDV F和HN基因全长核苷酸(nt)序列绘制系统进化树，二者的绘制结果基本一致。图 1显示的是依据F基因nt全长绘制的系统发育树。依据Diel等[6]的标准，初步将NDV毒株分为15个基因型(图 1)。本实验室分离的89株NDV流行株主要分布于基因Ⅱ型(8株)、Ⅵ型(6株)、Ⅶ型(71株)和Ⅸ型(4株)。其中，基因Ⅶ型进一步演化为不同的亚型(图 1)，而Ⅶ d型多达67株(占Ⅶ型的94.4%)，这表明Ⅶ d亚型不仅是Ⅶ型中的优势株，也是我国NDV流行株中的优势株。
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| 图 1 中国1997-2015年新城疫流行株F基因系统发育树 Figure 1 F gene phylogenetic tree of NDV strains from 1997 to 2015 in China 注：GenBank号列于NDV毒株名称之前；◀：表示含2个以上毒株；括号中的数字表示毒株数量；标尺刻度代表序列差异. Note: GenBank accession number were listed before the names of NDV. ◀: More than two strains; The numbers in brackets indicate NDV isolates; The scale bar means sequence difference. |
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国外NDV流行株主要分布于Ⅹ型、Ⅺ型和ⅩⅢ型，与中国NDV流行株明显不同，具体分布如下：基因Ⅹ型(3株，源自北美洲的美国)、Ⅺ型(3株，源自非洲的马达加斯加)和ⅩⅢ型(4株，源自南亚的巴基斯坦)。
比较发现：NDV流行株基因型的分布与地域、时间密切相关。不同时间、不同国家和区域，其基因型不同，具有地域性特点，显示出NDV遗传演化的多样性和复杂性。
2.2 相似性比较NDV F和HN基因相似性比较显示：同一基因型内核苷酸(nt)相似性较高(表 1)。以HN基因为例：基因Ⅶ型毒株间nt相似性为92.1%-99.9%；基因Ⅱ型毒株间为95.6%-100%；基因Ⅰ型毒株间为93.1%-100%；基因Ⅲ型毒株间为99.3%-99.9%；基因Ⅸ毒株间为99.4%-99.9%；基因Ⅵ型毒株间为91.4%-100%。相反，不同基因型间差异较大，如La Sota与基因Ⅶ型毒株之间nt/aa相似性为78.1%-80.1%；与基因Ⅸ型相似性为86.8%-87.4%；与基因Ⅵ型相似性为79.9%-81.2%。F和HN基因nt相似性结果一致。
| 基因型 Genotype |
年代 year |
F基因 F gene |
HN基因 HN gene |
|||||
| 毒株数量 Number of strains |
基因型内的同源性 Homology in the same genotype (%) |
平均替代率 Average substitution rate (×10-3) |
毒株数量 Number of strains |
基因型内的同源性 Homology in the same genotype (%) |
平均替代率 Average substitution rate (×10-3) |
|||
| Ⅰ | 1967-2014 | 23 | 95.5-99.9 | 1.01 | 23 | 93.1-100 | 0.97 | |
| Ⅱ | 1946-2015 | 23 | 96.3-99.6 | 0.07 | 17 | 95.6-100 | 0.08 | |
| Ⅲ | 1950-2009 | 8 | 96.0-100 | 0.02 | 6 | 99.3-99.9 | 0.07 | |
| Ⅸ | 1948-2014 | 25 | 98.9-99.8 | 0.02 | 12 | 99.4-99.9 | 0.06 | |
| Ⅵ | 1972-2015 | 62 | 92.7-100 | 2.22 | 47 | 91.4-100 | 1.82 | |
| Ⅶ | 1997-2015 | 327 | 93.3-99.9 | 2.26 | 274 | 92.1-99.9 | 3.23 | |
|
| 图 2 NDV流行株与La Sota株F基因的核苷酸差异及其与年代的相关性 Figure 2 The relationship between F gene nt homologies of NDV epidemic strains against La Sota in different years |
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| 阶段 Period |
年代 Year |
毒株数量 Number of strains |
基因长度 Length (nt) |
变异数量 Number of variation |
变异率 Variation rate (%) |
转换数 P |
颠换数 Q |
替代率 substitution rate (%) |
平均替代率 Average substitution rate (×10-3) |
| 未使用基因Ⅶ型疫苗 Unused genotype Ⅶ vaccine |
1997 | 1 | 1 662 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4.72* |
| 1998 | 1 | 1 662 | 40.0 | 2.41 | 38.0 | 2.0 | 2.53 | ||
| 1999 | 2 | 1 662 | 75.0 | 4.51 | 69.5 | 5.5 | 4.90 | ||
| 2000 | 5 | 1 662 | 39.4 | 2.37 | 35.6 | 3.8 | 2.54 | ||
| 2001 | 6 | 1 662 | 36.5 | 2.20 | 32.8 | 3.7 | 2.36 | ||
| 使用基因Ⅶ型疫苗 Using genotype Ⅶ vaccine |
2002 | 6 | 1 662 | 34.3 | 2.06 | 29.5 | 3.8 | 2.16 | 1.60 |
| 2003 | 23 | 1 662 | 46.2 | 2.78 | 41.5 | 4.7 | 3.00 | ||
| 2004 | 6 | 1 662 | 39.5 | 2.38 | 34.5 | 5.0 | 2.59 | ||
| 2005 | 16 | 1 662 | 42.5 | 2.56 | 38.0 | 4.5 | 2.76 | ||
| 2006 | 33 | 1 662 | 47.5 | 2.86 | 42.4 | 5.1 | 3.10 | ||
| 2007 | 42 | 1 662 | 51.9 | 3.12 | 46.2 | 5.7 | 3.40 | ||
| 2008 | 47 | 1 662 | 53.5 | 3.22 | 48.0 | 5.5 | 3.50 | ||
| 2009 | 20 | 1 662 | 56.8 | 3.42 | 51.6 | 5.2 | 3.70 | ||
| 2010 | 20 | 1 662 | 62.8 | 3.78 | 56.6 | 6.2 | 4.11 | ||
| 2011 | 45 | 1 662 | 63.7 | 3.83 | 57.6 | 6.1 | 4.17 | ||
| 2012 | 17 | 1 662 | 67.2 | 4.04 | 61.1 | 6.1 | 4.40 | ||
| 2013 | 12 | 1 662 | 64.4 | 3.87 | 58.2 | 6.2 | 4.22 | ||
| 2014 | 4 | 1 662 | 59.0 | 3.55 | 53.0 | 6.0 | 3.86 | ||
| 2015 | 5 | 1 662 | 67.1 | 4.04 | 60.8 | 6.3 | 4.40 | ||
| 注：*：与2002-2015年NDV分离株差异显著(p < 0.01). Note: *: highly significiant difference comparing NDV isolates in 2002-2015 with separate periods (p < 0.01). |
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| 阶段 Period |
年代 Year |
毒株数量 Number of strains |
基因长度 Length (nt) |
变异数量 Number of variation |
变异率 Variation rate (%) |
转换数 P |
颠换数 Q |
替代率 Substitution rate (%) |
平均替代率 Average substitution rate (×10-3) |
| 未使用基因Ⅶ型疫苗 Unused genotype Ⅶ vaccine |
1997 | 1 | 1 716 | 0.0 | 0.00 | 0.0 | 0.0 | 0.00 | 8.20* |
| 1998 | 1 | 1 716 | 8.0 | 3.08 | 7.0 | 1.0 | 0.50 | ||
| 1999 | 3 | 1 716 | 52.7 | 3.00 | 48.0 | 4.7 | 3.30 | ||
| 2000 | 9 | 1 716 | 51.4 | 3.78 | 45.2 | 6.2 | 3.26 | ||
| 2001 | 8 | 1 716 | 64.7 | 3.53 | 58.6 | 6.1 | 4.13 | ||
| 使用基因Ⅶ型疫苗 Using genotype Ⅶ vaccine |
2002 | 9 | 1 716 | 60.5 | 4.01 | 53.5 | 7.0 | 3.83 | 1.84 |
| 2003 | 22 | 1 716 | 68.7 | 4.37 | 61.1 | 7.6 | 4.38 | ||
| 2004 | 11 | 1 716 | 69.5 | 4.38 | 62.7 | 6.8 | 4.44 | ||
| 2005 | 14 | 1 716 | 74.9 | 4.67 | 66.5 | 8.4 | 4.85 | ||
| 2006 | 20 | 1 716 | 75.0 | 4.43 | 66.5 | 8.5 | 4.79 | ||
| 2007 | 24 | 1 716 | 80.0 | 4.65 | 71.2 | 8.8 | 5.14 | ||
| 2008 | 37 | 1 716 | 75.9 | 4.43 | 67.7 | 8.2 | 4.89 | ||
| 2009 | 11 | 1 716 | 79.6 | 4.65 | 71.0 | 8.6 | 5.14 | ||
| 2010 | 9 | 1 716 | 83.0 | 4.45 | 74.0 | 9.0 | 5.35 | ||
| 2011 | 29 | 1 716 | 90.5 | 5.29 | 79.6 | 10.9 | 5.92 | ||
| 2012 | 19 | 1 716 | 92.6 | 5.41 | 83.0 | 9.6 | 5.99 | ||
| 2013 | 11 | 1 716 | 96.6 | 5.64 | 86.2 | 10.4 | 6.26 | ||
| 2014 | 2 | 1 716 | 75.5 | 4.41 | 65.5 | 10.0 | 4.87 | ||
| 2015 | 2 | 1 716 | 98.5 | 5.57 | 88.0 | 10.5 | 6.41 | ||
| 注：*：与2002-2015年NDV分离株差异显著(p < 0.01). Note: *: highly significant difference comparing NDV isolates in 2002-2015 with separate periods (p < 0.01). |
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由表 3可见：1997-2015年间，NDV流行株HN基因的年平均核苷酸替代率为3.37×10-3。其中，1997-2001年(未使用基因Ⅶ型疫苗) HN基因的年平均核苷酸替代率为8.28×10-3；2002-2015年(疫苗使用后)为1.84×10-3。
(2) 氨基酸替代率比较：参照上述方法，对近20年的NDV基因Ⅶ流行株氨基酸替代率进行比较。结果发现F基因在1997-2015年间的年平均氨基酸替代率为1.14×10-3。其中，1997-2001年间的替代率为3.86×10-3，而在2002-2015年间的替代率仅为0.31×10-3。HN基因在1997-2015年间的年平均氨基酸替代率为2.35×10-3。其中，1997-2001年间的替代率为5.86×10-3，而2002-2015年间的替代率仅为1.49×10-3。
综合比较显示：HN基因的年平均替代率略高于F，显示出二者具有相同的进化规律。
2.4 NDV基因Ⅶ型的关键氨基酸位点分析通过对71株国内NDV基因Ⅶ型的氨基酸基序和系统发育比较发现，NDV基因Ⅶ型流行毒病还可以进一步分为不同的基因亚型，该结果已在多篇文献中描述[9-10]。本研究证实，基因Ⅶ d亚型不仅为优势流行株，还具有其它亚型所不具备的氨基酸位点，如71R、474I和500A等；同时，F蛋白出现了较多的氨基酸替代，即78K→R、145N→K、279Q→H、387K→R、480K→R、513V→I和520G→A，其中除4个氨基酸为保守性替换外，其它3个氨基酸的改变涉及到极性所带电荷的变化，而且具有氨基酸变异的累积。
HN基因与F基因相似，也出现了多个特异性的氨基酸替代位点，如45V→A、48T→M、49T→E、102T→V、118A→E、120N→S、129D→G、310D→G、362G→A、347E→K、443T→M、479H→Y和540V→A等。
3 讨论 3.1 NDV基因型的多样性和复杂性中国是一个养禽大国，免疫接种是防控ND的基本国策，通过疫苗的推广应用，我国已经把ND控制到比较低的水平。尽管如此，中国依然是世界上NDV流行较为严重的国家。近期的第四次NDV世界大流行无论在疫病流行的规模、速度、宿主的种类、危害程度及持续时间上，均超过了前三次[11-13]。目前，中国NDV流行株主要包含基因Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅻ和ⅩⅤ型[6-13]，是世界上NDV基因型存在较多的国家之一，这无疑对我国的NDV防控提出了新的挑战。
基因分型是在NDV分类中应用最广泛、最便捷和最准确的方法，因为它建立在对病原分子序列分析的基础上，不同基因型之间的进化距离和系统发育存在着更为精准的相关性。研究者们在参照国际公认的禽流感基因型划分标准的同时，对NDV提出了更为合理的分型依据，初步确定了NDV不同基因型间的平均进化距离(10%)，并把其作为鉴定新基因型的标准[6]。依据新的分类方法，Class Ⅰ病毒由单一基因型组成，而Class Ⅱ则由18个基因型组成(本实验有15个基因型)，包括先前确定的10个(Ⅰ-Ⅸ和Ⅺ)基因型和8个新基因型(Ⅹ、Ⅻ-ⅩⅧ)[14-16]，新基因型大都来自北美洲、非洲和欧洲，但Ⅻ和ⅩⅤ源自中国。图 3显示了不同时间的NDV进化和新基因型出现的时间，显示出在一定的免疫压力下，点突变、不同宿主种间传播、气候、地域等因素共同促进了NDV的演化。
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| 图 3 新城疫病毒不同年代基因型的演化历史 Figure 3 Evolutionary history of different genotypes of Newcastle disease virus in different years |
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遗传和变异是病毒适应外界环境并维持生存的一种重要方式，也是病毒逃避和抵抗宿主疫苗免疫的重要手段。NDV属于RNA病毒，单股、负链、不分阶段，其复制酶缺乏校正机制，因此，NDV的变异频率相对于DNA病毒较高[17]。NDV不同基因型之间，其遗传变异速率不一，以基因Ⅵ型和Ⅶ型变异频率最大，而其它基因型则相对较小。该F基因变异频率结果与Lee等的研究相近(年核苷酸变异频率为2.89×10-3)[18]。进一步的研究表明，1997-2001年NDV基因Ⅶ型最早出现时，其HN基因核苷酸年平均进化率明显比F基因高，这暗示着对NDV抗原性影响较大的HN基因则必然会影响疫苗的免疫效果。部分养殖场为提高疫苗的保护效果，陆续接种了基因Ⅶ灭活疫苗，因此在2002-2015年间，HN基因核苷酸年平均替代率仅为1.84×10-3。这表明，当流行株与疫苗株完全匹配时，可大大降低免疫鸡群的排毒量和载毒量，减少NDV变异的频率[19]。该结果与低致病性禽流感H9N2的变异十分相似。但对于多片段的禽流感病毒而言，H9N2流行株HA基因的年均替代率明显高于NDV的HN变异频率[8]。
3.3 NDV变异对于疫苗防控的启示尽管NDV只有一个血清型，但其编码的基因型已进化到18个。这表明，NDV在长期的免疫选择压力下正处于持续的进化之中。前期的研究表明，NDV的HN基因和F基因同源性均与HI交叉抑制试验具有相关性，但主要与HN基因有关，这也在一定程度上证实了长期的点突变积累造成了NDV抗原性的变化[20]。
HN蛋白是NDV囊膜上最大的纤突糖蛋白，在免疫反应中具有决定作用，是重要的保护性抗原。HN蛋白结构呈β螺旋折叠，内有4股反向平行的6个β折叠区。相对应的氨基酸区域位点为：175-228 (β1：抗原对应位点23)、237-288 (β2：抗原对应位点3)、316-396 (β3：抗原对应位点3、1、4和14)、401-403 (β4)、472-515 (β5：抗原对应位点2)和521-577C末端(β6：抗原对应位点2)[21-22]。生物信息学分析发现，NDV流行株的HN基因在上述氨基酸关键位点已经发生了改变，如347位为“E→K”、362位“G→A”等，上述位点的改变均会对NDV的抗原性产生影响[23]。
新城疫在全球已流行近90年，疫苗预防在控制ND流行方面发挥了重要作用。但再完美的疫苗也不能阻挡NDV的遗传演变和替代，对病原的杀灭净化和生物安全措施应成为下一步疫病防控的重点。
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