DNA聚合酶是遗传信息复制、损伤修复过程中的关键酶，广泛存在于细菌、古菌和真核生物三域生命中。DNA聚合酶一般具有DNA聚合酶活性、3′→5′外切酶活性、5′→3′外切酶活性等。聚合酶活性在DNA模板指导下，以dNTPs作为底物，在引物链的3′羟基端聚合核苷酸；另外DNA聚合酶的3′外切酶活性会对新合成链进行校对和修复，以确保DNA复制的准确性。根据序列相似性、酶学特性以及高级结构的差异，DNA聚合酶可以分为七大家族，分别是A、B、C、D、X、Y和RT (reverse transcriptase) 家族^[1-2]，这些家族的聚合酶在结构和催化活性上均有自己的特性^[3-4]。

在古菌中，泉古菌(Crenarchaeota) 只编码B家族DNA聚合酶，然而在广古菌(Euryarchaeota) 中存在2类DNA聚合酶，分别是B家族和D家族。B家族DNA聚合酶(PolB) 是一类较为保守的单亚基DNA聚合酶，主要参与基因组DNA复制以及DNA损伤修复；D家族DNA聚合酶(PolD) 是古菌中特有的一类DNA聚合酶，PolD由2个亚基组成：具有3′→5′核酸外切酶活性的小亚基(DP1)以及具有5′→3′ DNA聚合酶活性的大亚基(DP2)^[5]。在古菌中，PolB可以分为3个亚型：(1) PolB1仅在TACK (Thaumarchaota、Aigarchaota、Crenarchaeota和Korarchaeota) 超门中存在。(2) PolB2是一类独特的DNA聚合酶家族，因大多数关键残基突变而失活，并且在古菌谱系中显示出斑片状分布。(3) PolB3在除Thaumarchaeota以外的所有古菌中都存在。PolB1和PolB3都具有3′→5′核酸外切酶活性和DNA聚合酶活性，而PolB2的分子量相对较小，且只具有完整的聚合酶结构域，缺少完整的外切酶结构域^[6-9]。

1976年人们从Thermus aquaticus中鉴定了第一个热稳定性的Taq DNA聚合酶^[10]。随着其他(超) 嗜热微生物的发现以及蛋白重组表达技术的发展，大量热稳定的DNA聚合酶得到分离与鉴定。耐热DNA聚合酶作为分子生物学技术的重要工具酶被广泛应用，如聚合酶链式反应(PCR)、基因克隆、基因测序、疾病诊断、基因治疗以及多态性分析等^[11]。虽然A家族Taq DNA聚合酶的发现是PCR发展中的一个重大突破，但其3′→5′核酸外切酶活性的缺失导致其扩增产物的错误率相对较高。超嗜热古菌中的B家族DNA聚合酶因其显著的热稳定性和3′→5′核酸外切酶活性引起了人们的极大兴趣。一些B家族DNA聚合酶已经被鉴定并应用于PCR，特别是来自广古菌门热球菌科Thermococcales的菌株，主要包括火球菌属的Pyrococcus furiosus^[12]、热球菌属的Thermococcus litoralis^[13]、Thermococcus 9 N-7^[14]、Thermococcus kodakarensis^[15]、Thermococcus fumicolans^[16]、Thermococcus sp. NA1^[17]、Thermococcus waiotapuensis^[18]及Thermococcus barophilus Ch5^[19]等。

Thermococcus eurythermalis A501属于广古菌门，分离自瓜伊玛斯盆地2 006.9 m深处的一个黑烟囱热液口，是一种严格厌氧的超嗜热古菌，可以在广泛的温度、pH值和压力范围内生长，最佳生长温度和压力分别为85 ℃和20 Mpa；最适pH及盐度分别为7.0–8.0和2.0%^[20]。Thermococcus eurythermalis A501编码B家族(B3亚型) 和D家族2类DNA聚合酶。在本项工作中，我们克隆了其PolB基因，在大肠杆菌Rosetta(DE3) 中进行了表达。对重组DNA聚合酶Teu-polB进行了纯化、生化特性表征，并优化了PCR扩增反应条件。为PCR提供了一种新型的高忠实性DNA聚合酶。

Thermococcus eurythermalis A501菌株基因组DNA采用酚氯仿法提取。大肠杆菌DH5α、Rosetta(DE3) 表达菌株、pUC19质粒及表达载体pET28a均为本实验室保存。用于酶学特性分析的寡核苷酸底物和PCR引物均合成自生工生物工程(上海) 股份有限公司，序列详见表 1和表 2。DNA聚合酶PrimSTAR、Hind Ⅲ和NdeⅠ限制性内切酶、λDNA、dNTPs、DNA Ladder购自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶购自赛默飞世尔科技(中国) 有限公司。Ni-NTA蛋白纯化树脂购自Bio-Rad公司。ClonExpress Ⅱ一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞公司。PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Brandford蛋白浓度测定试剂盒、蛋白Marker及其余生化试剂均购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。

首先以Thermococcus eurythermalis A501基因组DNA为模板，使用DNA聚合酶PrimerSTAR扩增全长Teu-PolB基因，正反向引物序列分别为XL2380和XL2381 (表 2)。PCR扩增获得全长Teu-PolB基因(3 939 bp) 的琼脂糖凝胶电泳结果如图 1A所示。使用Hind Ⅲ和NdeⅠ双酶切pET28a载体，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。用诺唯赞公司的ClonExpressⅡ试剂盒的一步克隆法将全长Teu-PolB基因与双酶切的pET28a载体进行同源重组，具体操作参照试剂盒说明书。DNA序列测定验证全长Teu-PolB基因的正确性。

图 1 全长Teu-PolB基因PCR扩增(A) 和Teu-PolB的表达载体构建策略(B) Fig. 1 Amplified full-length Teu-PolB gene (A) and Constructing strategy for Teu-PolB expression plasmid (B). (i) The full-length Teu-PolB gene is split by one intein-coding sequence that forms a continuous open reading frame with the two polymerase-coding exteins; (ii) Deletion of intein in the full-length Teu-PolB gene through site-directed mutagenesis by overlapping primer PCR.

图选项

由于Teu-PolB包含一段intein蛋白的编码DNA序列(1 474–3 084)，它的存在很可能会影响Teu-PolB蛋白的重组表达。因此为了提高Teu-PolB的表达产量，通过重叠引物PCR介导的定点突变删除intein蛋白编码DNA序列(图 1B)，正反向突变引物序列分别为XL2530和XL2531 (表 2)。DNA序列检测验证突变位点和序列准确性，最终获得重组表达载体pET28a-Teu-PolB。

将不含intein序列的DNA聚合酶Teu-PolB的原核重组表达载体pET28a-Teu-PolB转化至大肠杆菌Rosetta (DE3) 感受态细胞中。挑取单菌落至20 mL添加有50 mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，转接至500 mL培养基中，37 ℃、200 r/min条件下培养至OD₆₀₀为0.6–0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，在20 ℃、200 r/min条件下继续培养16–20 h，诱导Teu-PolB蛋白表达。将菌体细胞用40 mL裂解缓冲液重悬(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，300 mmol/L NaCl)，进行超声波破碎细胞。超声破碎后于75 ℃水浴锅中加热20 min，失活大肠杆菌自身蛋白。然后在4 ℃条件下8 000 r/min离心40 min，收集上清液获得重组蛋白粗液。利用Ni-NTA树脂亲和纯化Teu-polB蛋白，得到DNA聚合酶Teu-PolB。

将上一步亲和纯化的Teu-PolB洗脱液透析到低盐缓冲液A (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.0，50 mmol/L NaCl)，然后通过离子交换层析(Source 15Q离子树脂) 进行纯化。用缓冲液A预先平衡柱子，Teu-PolB蛋白上样后，通过缓冲液B (25 mmol/L Tris-HCl pH 7.0，1 mol/L NaCl) 梯度提高洗脱液的盐离子浓度，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，确定DNA聚合酶Teu-PolB的洗脱条件。最终将目的蛋白置换至储存溶液：20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，100 mmol/L KCl，0.5% (V/V) Nonidet P40，0.5% (V/V) Tween 20，50% (V/V) 甘油glycerol，于–20 ℃保存。蛋白浓度经Bradford法测定。

用于鉴定Teu-PolB聚合酶活性、外切酶活性及其他生化特性的寡核苷酸片段见表 1，其中双链底物的配制方法是将模板链和5′端带荧光标记的引物链按1.5︰1.0的分子数混合入退火缓冲液(终浓度为10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L NaCl) 中，置于95 ℃、水浴5 min，自然冷却至室温，直接进行反应或避光冻存于–20 ℃。Teu-PolB的DNA聚合酶活性测定反应体系(20 μL) 包括：50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，2 mmol/L MgCl₂，30 mmol/L KCl，2 mmol/L (NH₄)₂SO₄，0.01% Triton X-100，0.005% BSA，100 nmol/L荧光标记底物，10 μmol/L dNTPs和一定浓度的Teu-PolB蛋白。50 ℃反应10 min后，加入20 μL反应终止液(100 mmol/L EDTA，95%甲酰胺，0.02%溴酚蓝，0.2% SDS)。上述反应体系在不添加dNTPs的条件下，用同样的方法测定Teu-PolB的核酸外切酶活性。反应产物在15%或18%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素) 中电泳分离，使用AmershamTyphoon RGB激光成像仪(GE公司) 扫描成像。

PCR反应缓冲液对于PCR反应的效率、灵敏度和保真度非常重要。本研究以λDNA (NCBI参考：NC 001416) 为模板进行PCR，引物序列见表 1，λ-F为正向引物，λ-2R和λ-4R分别为扩增2 kb和4 kb片段的反向引物。50 μLPCR反应体系构成如下：60 ng Teu-PolB，5 ng λDNA，10 pmol引物，0.2 mmol/L dNTPs和1×PCR缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl或50 mmol/L Tricine-KOH，2 mmol/L MgCl₂、30 mmol/L KCl，2 mmol/L (NH₄)₂SO₄，0.01% Triton X-100，0.005% BSA)。反应条件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 0.5 min，60 ℃ 0.5 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 5 min。为了测试pH对PCR的影响，以λDNA为模板在pH 7.0–9.2范围内扩增2 kb长度的片段，同时测试不同的KCl、(NH₄)₂SO₄、Triton X-100和BSA浓度对PCR的影响。为了测试MgCl₂对PCR的影响，按上述方法在50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0中以各种MgCl₂浓度扩增2 kb的λDNA片段。反应完成后，取5 μL样品与上样缓冲液混合，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增效果。

DNA聚合酶的保真度测定以pUC19质粒(2 686 bp) 作为模板，用重叠引物PCR介导的定点突变删除多克隆位点序列(multiple cloning site，MCS、632-688)，正反向突变引物序列分别为PUC-1和PUC-2 (表 2)。随机挑选单菌落抽提质粒，将MCS片段删除成功的质粒克隆进行DNA全序列测定分析，验证DNA聚合酶合成DNA的准确性。

Teu-PolB的表达纯化结果如图 2A所示。在20 ℃摇床低温诱导过夜后，经Ni-NTA亲和纯化以及离子交换层析，可以从1 L培养液中获得2.4 mg的Teu-PolB蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测表明其纯度达90%以上。通过与蛋白分子量标准比较，Teu-PolB蛋白的单体分子量在90–100 kDa之间，与理论计算值(90.104 kDa) 相符。

图 2 Teu-PolB的表达纯化及酶活性测定 Fig. 2 Expression, purification and activity titration of Teu-PolB. (A) 15% SDS-PAGE analysis of Teu-PolB protein expression and purification process. Lane M: molecular weight marker; lanes UI and I: the total proteins in E. coli before and after induction; lanes S and D: supernatant and pellet of cell lysate after centrifugation; lane P1 and P2: the Teu-PolB purified by Ni-NTA column, and ion-exchange column, respectively. (B) Polymerase activity titration of Teu-PolB. (C) Exonuclease activity titration of Teu-PolB. Lane M: 35 nt oligodeoxynucleotides; lane E-: the reaction without the enzyme.

图选项

Teu-PolB含有3个结构域：N末端结构域、聚合酶结构域和3′→5′核酸外切酶结构域，包括古菌B家族DNA聚合酶高度保守的3个3′→5′核酸外切酶基序^[21]和6个5′→3′聚合酶基序^[22-23]。对其进行体外酶学活性鉴定，于反应体系中加入不同浓度的Teu-PolB，50 ℃条件下反应10 min，结果表明Teu-PolB具有DNA聚合酶活性(图 2B)。当反应体系中不添加dNTPs时，Teu-PolB会将5′末端带有标记的寡核苷酸片段切割成不同长度的DNA，表明Teu-PolB具有3′→5′核酸外切酶活性，且对dsDNA和ssDNA底物的切割效率没有特异性(图 2C)。

首先对Teu-PolB聚合酶和外切酶活性的最适酶反应温度进行了检测。考虑到本研究所用dsDNA底物在55 ℃以上会解链成单链DNA，聚合酶活性反应温度为30–55 ℃，结果显示该酶在55 ℃时聚合酶活性最高(图 3A)。利用2种DNA底物(dsDNA和ssDNA) 测定Teu-PolB外切酶活性的最适温度，结果显示3′→5′核酸外切酶活性最适温度均为65 ℃ (图 3B)。鉴于外切酶活性最适温度为65 ℃，因此聚合酶活性的最适温度很可能也是65 ℃左右。

图 3 温度对Teu-PolB活性的影响及其热稳定性 Fig. 3 The effect of temperature on Teu-PolB activity and the thermostability of polymerase activity of Teu-PolB. (A) Effect of temperature on polymerase activity of Teu-PolB. (B) Effect of temperature on exonuclease activity of Teu-PolB. Lane M: 35 nt oligodeoxynucleotides; lane E-: the reaction without the enzyme. (C) The thermostability of polymerase activity of Teu-PolB. The enzyme activity without heat treatment is used as control and set as 100%, and the measured values of remained enzyme activity of various heat treatments are the percentages relative to the control.

图选项

为了探究Teu-PolB的热稳定性，我们首先将酶在反应缓冲液中(酶浓度为3 nmol/L) 于80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、98 ℃下分别加热0、30、60、90、120、180 min，然后加入底物，在55 ℃下反应10 min，终止反应，电泳检测剩余酶活性，并通过ImageQuant TL 8.1软件定量分析加热处理后的剩余活性。以加热0 min的聚合酶活性作为100%，绘制热稳定性曲线。90 ℃、95 ℃、98 ℃的热失活曲线见图 3C (Teu-PolB在80 ℃或85 ℃下处理3 h剩余聚合酶活性均在98%以上，故未在图中标明)。Teu-PolB在90 ℃和95 ℃处理3 h后酶活小幅下降，剩余酶活分别为93.7%和85.4%；98 ℃加热使酶活显著下降，3 h后剩余酶活为33.4%，98 ℃的热失活半衰期约为2 h。该结果表明Teu-PolB具有良好的热稳定性。

利用3′-OH和3′-磷酸化的引物作为底物，检测3′末端基团磷酸化对Teu-PolB活性的影响。如图 4A所示，3′末端的磷酸基团显著抑制Teu-PolB的3′→5′核酸外切酶活性，从而阻碍其聚合酶活性。DNA聚合酶延伸反应需要引物核酸(DNA或RNA) 序列，在引物的3′-OH持续添加新的核苷酸，从而进行延伸反应。细胞的染色体DNA复制反应以RNA作为引物来合成子代DNA链。因此，能够延伸RNA引物的DNA聚合酶具有染色体DNA复制功能，而不能延伸RNA引物的DNA聚合酶一般只负责DNA修复过程的DNA合成反应。为了检测Teu-PolB是否具有染色体DNA复制功能，利用相同长度的单链DNA和RNA作为引物，检测Teu-PolB在体外的引物选择性。结果显示，Teu-PolB能够有效延伸2种引物，但对DNA引物链的延伸作用更强(图 4B)，表明Teu-PolB可以在细胞内负责染色体DNA的合成。

图 4 RNA引物及引物3′端磷酸基团对Teu-PolB活性的影响 Fig. 4 The effects of 3′-terminal phosphate group (A) and RNA primers (B) on Teu-PolB activity. The reactions were performed with different substrate at 55 ℃ for 10 min. Lane M: 35 nt oligodeoxynucleotides; lane E-: the reaction without the enzyme.

图选项

古菌B家族的DNA聚合酶被广泛应用于PCR^[24]。上述结果表明Teu-PolB具备良好的PCR应用前景。PCR扩增效果与反应缓冲液组分密切相关，因此我们首先对Teu-PolB的PCR缓冲液组分进行了优化，结果如图 5所示。在50 mmol/L Tris-HCl或50 mmol/L Tricine-KOH缓冲液中，Teu-PolB均能在广泛的pH值范围内扩增出2 kb的λDNA片段；Tris-HCl缓冲液明显优于Tricine-KOH缓冲液，且在pH 8.0的Tris-HCl缓冲体系中活性最高(图 5A)。Teu-PolB是Mg²⁺依赖性酶，其催化活性对Mg²⁺浓度敏感，结果显示MgCl₂浓度在2.5 mmol/L时能最大限度地激活Teu-PolB的活性(图 5B)。此外，离子强度优化结果表明KCl和(NH₄)₂SO₄的最佳浓度分别为60 mmol/L (图 5C) 和10 mmol/L (图 5D)。Triton X-100和BSA的最佳浓度分别为0.015% (图 5E) 和0.01% (图 5F)。最后确定Teu-PolB的最佳PCR缓冲液组成为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2.5 mmol/L MgCl₂，60 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH₄)₂SO₄，0.015% Triton X-100和0.01% BSA。

图 5 Teu-PolB的PCR缓冲液优化 Fig. 5 PCR optimization with Teu-PolB DNA polymerase. Effect of pH (A), MgCl2 (B), KCl (C), (NH4)2SO4 (D), Triton X-100 (E) and BSA (F) on PCR amplification of a 2 kb λDNA fragment with Teu-PolB DNA polymerase. Lane M contains DNA molecular size markers (1 kb DNA Ladder Dye Plus, TaKaRa # 3426A).

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以λDNA为模板，在最佳缓冲液中扩增2 kb片段，确定扩增灵敏度。分别在50 μL体系中加0.1、0.2、0.5、1、2和5 ng的λDNA，发现λDNA的量高于0.5 ng时，Teu-PolB均能有效地扩增出目的片段(图 6A)。DNA聚合酶(包括商用的PCR酶) 通常对盐敏感，并且活性随反应体系中NaCl浓度的增加而降低。为了研究Teu-PolB的耐盐性，在其他条件不变的情况下，分别在50 μL反应体系中另外加入0、30、60、90、120、150和180 mmol/L NaCl，扩增2 kb片段。由图 6B所示，在盐浓度为0–120 mmol/L的范围内，Teu-PolB均能扩增出目的片段，NaCl耐受性与来自Aeropyrum pernix的ApePolB3相当^[25]，明显强于商用Pfu DNA聚合酶(40 mmol/L)。对盐的高耐受性表明Teu-PolB可从高盐样品扩增目的片段。

图 6 Teu-PolB应用于PCR的灵敏度及耐盐性能的测定 Fig. 6 Determination of the sensitivity and salt tolerance of Teu-PolB in PCR. PCR was performed to amplify a 2 kb λDNA fragment using optimal reaction buffer with different amounts of λDNA (A) or different salt concentrations (B). Lane M contains DNA molecular size markers (1 kb DNA Ladder Dye Plus, TaKaRa # 3426A).

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在最适反应缓冲液中，选择65 ℃、68 ℃、70 ℃和72 ℃的延伸温度扩增2 kb和4 kb的λDNA片段。结果表明，4个延伸温度下均能扩增出相应的DNA片段，其中68 ℃时产物量相对最高，故最适延伸温度为68 ℃ (图 7A)。为了测试Teu-PolB的PCR扩增速率，选择不同延伸时间进行4 kb的λDNA片段扩增，反应条件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 0.5 min，60 ℃ 0.5 min，68 ℃ (2.0、2.5、3.0、3.5，4.0 min)，30个循环，72 ℃ 5 min。结果显示，延伸时间为2 min时就能成功扩增4 kb的λDNA片段，且扩增产物与延伸4 min时的产物条带亮度相当，故Teu-PolB的延伸速率为2 kb/min以上(图 7B)，高于Taq DNA酶的1 kb/min。

图 7 Teu-PolB的PCR最适延伸温度与延伸速率 Fig. 7 Determination of the optimum extension temperature and extension efficiency for Teu-PolB. (A) PCR was performed to amplify a 2 kb or 4 kb λDNA fragment using optimal reaction buffer. (B) PCR was performed to amplify a 4 kb λDNA fragment under optimum extension temperature and optimal reaction buffer. Lane M contains DNA molecular size markers (1 kb DNA Ladder Dye Plus, TaKaRa # 3426A).

图选项

选取商品化Taq、Pfu DNA聚合酶与Teu-PolB在不同λDNA浓度下(0.2、0.5、2.0、5.0 ng) 扩增4 kb片段，反应在最佳反应缓冲液或厂家提供的缓冲液中进行，以检测PCR反应性能。结果如图 8，相同时间内Taq DNA聚合酶的PCR扩增产量明显强于Teu-PolB和Pfu DNA聚合酶，Teu-PolB的扩增产量略高于Pfu DNA聚合酶。由于Pfu DNA聚合酶的保真度比Taq酶高8倍，因此本研究选取保真度高的Pfu DNA聚合酶和Teu-PolB对比PCR保真度。测序结果见表 3，在10个删除MCS序列的质粒中(来自DNA聚合酶扩增产物)，Teu-PolB扩增的片段只突变了4个核苷酸位点，保真度优于Pfu DNA聚合酶的5个核苷酸位点突变。

图 8 Teu-PolB与商品化Taq、Pfu DNA聚合酶的PCR延伸效果对比 Fig. 8 Comparison of PCR extension efficiency with Teu-PolB, Taq and Pfu DNA polymerases. PCR was performed to amplify a 4 kb λDNA fragment under optimal reaction buffer or the buffer supplied by the manufactures. Lane M contains DNA molecular size markers (1 kb DNA Ladder Dye Plus, TaKaRa # 3426A).

图选项

在本研究中，我们克隆、表达并纯化了Thermococcus eurythermalis A501的B家族DNA聚合酶，并对其酶学特性与PCR应用进行研究。结果表明，Teu-PolB同时具有DNA聚合酶和3′→5′核酸外切酶活性，与其他热球菌科的B家族DNA聚合酶类似。该酶在98 ℃时的半衰期约为2 h，耐热性优良，可应用于PCR扩增DNA。

合适的反应体系能够最大限度地发挥酶的活力，所以反应缓冲液组成是PCR高效扩增的关键条件之一。除此之外DNA模板浓度、延伸温度以及抑制剂等诸多因素也会影响到DNA聚合酶的催化能力。本研究发现缓冲液中pH值和Mg²⁺是影响Teu-PolB聚合酶活性的最重要因素。其中pH主要从模板状态和酶活性两个方面影响PCR反应^[26]。Teu-PolB的PCR最适pH为8.0。第二个关键因素是Mg²⁺，该离子是DNA聚合酶活性的依赖性离子，当反应体系中不添加MgCl₂时，PCR反应不能正常进行。在标准PCR反应中，Mg²⁺的浓度一般为0.5–2.5 mmol/L，Teu-PolB的最适Mg²⁺浓度为2.5 mmol/L。相较于现有的商品化DNA聚合酶，Teu-PolB的高耐热性、低模板量需求、高耐盐、高保真度和高扩增速率等特点更具吸引力。Teu-PolB的最适延伸温度为68 ℃，且可在模板量为0.5 ng λDNA下成功扩增出2 kb目的片段，盐耐度达到120 mmol/L的NaCl，保真度略高于Pfu DNA聚合酶且有较高的延伸速率，能以2 kb/min扩增出4 kb的目的片段，具有良好的应用潜力。