重组人源SNX7蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及磷脂结合特异性分析
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国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2012CB917200) 资助。


Expression, purification and phosphoinositide binding specifity of recombinant human SNX7 expressed in Escherichia coli
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National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB917200).

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    摘要:

    Sorting nexins (SNXs)是一类含有SNX-PX结构域,并在细胞内吞和内体分选运输过程中发挥重要调节作用的蛋白。SNX7是SNXs家族中的一员,含有PX结构域和BAR结构域,属于SNX-PX-BAR亚家族。斑马鱼实验表明,SNX7是在肝脏中大量表达的抗凋亡蛋白,并在胚胎肝脏的发育中发挥关键作用。为了从蛋白水平对SNX7进行研究,首先将编码人源PX-BARSNX7 (SNX7的一个片段,包含PX和BAR结构域)的cDNA片段插入到原核表达载体p28a中,再将重组质粒转化到大肠杆菌Rosseta 2 (DE3) 中诱导表达,并用亲和层析、离子交换和分子筛层析对PX-BARSNX7进行了纯化。Western blotting结果表明,亲和层析、离子交换和分子筛层析纯化后获得了高纯度的PX-BARSNX7蛋白。动态光散射实验显示PX-BARSNX7蛋白均一性良好。磷脂结合实验表明,PX-BARSNX7具有较为广泛的磷脂酰肌醇结合能力,能够与PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3结合。

    Abstract:

    Sorting nexins (SNXs) are a large group of proteins that contain Phox (PX)domain and involve in regulating endocytosis and endosome sorting. SNX7, a member of SNXs family, contains a PX domain and a BAR domain. In zebrafish, SNX7 is a liver-enriched anti-apoptotic protein and indispensible for the liver development. A fragment of SNX7 cDNA (px-barsnx7), encoding the PX domain and the BAR domain, was inserted into the expressing vector p28a, transformed into E. coli Rosseta 2 (DE3), and then induced by isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG). After affinity, ion exchange and gel filtration purification, the purity of PX-BARSNX7 reached over 95%. Dynamic light scattering (DLS) experiment indicated that PX-BARSNX7 was homogeneous in solution. Lipid overlay assay showed that PX-BARSNX7 can bind to PtdIns(5)P, PtdIns(4,5)P2 and PtdIns(3,4,5)P3.

    参考文献
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    引证文献
引用本文

冯站,许婷婷,徐进新. 重组人源SNX7蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及磷脂结合特异性分析[J]. 生物工程学报, 2014, 30(9): 1436-1445

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  • 收稿日期:2013-11-25
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  • 在线发布日期: 2014-09-02
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