2020年第47卷第7期文章目次

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    封面
    2020, 47(7).
    [摘要](175) [HTML](0) [PDF 2.61 M](265)
    摘要:
    2  
    目录
    2020, 47(7).
    [摘要](154) [HTML](0) [PDF 792.33 K](297)
    摘要:
    3  微生物酶工程:绿色生物制造的基石
    金城
    2020, 47(7):2001-2002. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.207007
    [摘要](477) [HTML](457) [PDF 486.79 K](459)
    摘要:
    酶工程是酶学与工程科学融合的综合性科学技术,新酶的发掘、对酶的结构与功能的认知及酶的改造是合成生物学、生物制造技术的重要科学与技术基础。在合成生物学的发展方兴未艾的今天,酶工程更是不可或缺的研究领域。
    4  酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性
    鲍玲娜,吴勇,林军,东圆珍,黄宗庆
    2020, 47(7):2003-2011. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200211
    [摘要](522) [HTML](330) [PDF 1.42 M](539)
    摘要:
    【背景】 Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25?42 °C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45 °C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0?10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH 9.0时稳定性最高;0.5?20.0 mmol/L浓度范围内的Mg2+对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg2+可使该酶酶活力提高约23%;Ba2+、Co2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu2+和Fe2+对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。
    5  来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析
    刘文婷,梁爱玲,刘卫东,商娜,郭瑞庭,张同存,郑迎迎
    2020, 47(7):2012-2020. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.191015
    [摘要](369) [HTML](186) [PDF 1.57 M](368)
    摘要:
    【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS 650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中RmZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/mL,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/mL。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7 kD符合,且发酵上清液蛋白纯度高。RmZHD的最适pH值为9.6,最适温度为45 °C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。
    6  6-羟基烟酸3-单加氧酶Ni cC的纯化与结晶
    郭丽华,唐鸿志,吴更
    2020, 47(7):2021-2027. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.191049
    [摘要](366) [HTML](219) [PDF 2.31 M](346)
    摘要:
    【背景】含氮杂环吡啶化合物是重要的环境污染物之一,在人体内长期积累会导致肿瘤/畸胎等疾病,利用微生物降解含氮杂环化合物是一种非常有效的途径。【目的】在大肠杆菌中克隆表达6-羟基烟酸3-单加氧酶基因nicC,纯化重组NicC蛋白并进行结晶条件的研究。【方法】以恶臭假单胞菌KT2440为模板对nicC基因进行PCR扩增,构建重组表达载体pET28a-nicC,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对NicC蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】成功构建重组质粒pET28a-nicC并纯化获得达到结晶纯度的NicC蛋白。通过结晶条件初筛和正交优化实验发现,NicC蛋白的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L CaCl2·2H2O,31% PEG4000,0.05 mol/L Tris-HCl ph 8.0,4 °C;SeMet-NicC蛋白和NicC与6-HNA共晶的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L CaCl2·2H2O,0.05 mol/L Tris-HCl ph 7.9,31% PEG3350,4 °C。【结论】NicC蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究为最终解析NicC蛋白三维结构提供了有利条件,为揭示吡啶环β位单加氧酶识别含吡啶环底物并催化底物的吡啶环上β位羟基化的分子机理奠定了基础。
    7  沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质
    马俊文,江正强,李晨霞,闫巧娟
    2020, 47(7):2028-2039. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190862
    [摘要](319) [HTML](302) [PDF 2.20 M](345)
    摘要:
    【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体pET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40 °C,在pH 5.0?10.5和35 °C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。
    8  新型苏云金芽孢杆菌(−)γ-内酰胺酶基因的克隆与表达
    孙康,鲁明杰,于爽,迟乃玉
    2020, 47(7):2040-2049. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200018
    [摘要](355) [HTML](267) [PDF 1.41 M](345)
    摘要:
    【背景】γ-内酰胺是一种重要的医药中间体,其自身具备手性不利于药物合成,通过γ-内酰胺酶选择性拆分可实现光学纯γ-内酰胺的制备。【目的】挖掘来源苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的γ-内酰胺酶基因,探索光学纯γ-内酰胺的制备工艺。【方法】通过“acetamidase/formamidase”关键词检索苏云金芽孢杆菌基因组,对检索出的两条序列进行异源表达,而后通过高效液相色谱法检测重组菌对γ-内酰胺的降解情况,确定克隆的基因是否为γ-内酰胺酶基因。利用构建的重组菌进行5 L发酵、底物拆分、产物回收的生产应用尝试。【结果】构建的skA2重组菌株具有(?)γ-内酰胺酶活性,其在小规模制备生产中表现良好。【结论】 A基因是一段未经报道的(?)γ-内酰胺酶基因,丰富了生产者的酶工具箱。构建的skA2菌株可以满足工业制备(+)γ-内酰胺的生产需求,为合成光学纯药物奠定坚实基础。
    9  嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质
    刘洋,彭惠,张汆,董艺凝,孙星,罗侠,蔡华,赵维萍
    2020, 47(7):2050-2059. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200031
    [摘要](395) [HTML](244) [PDF 11.99 M](353)
    摘要:
    【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量为52 kD,在70 °C和pH 6.5条件下表现出最佳活性;以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG)为底物时的比酶活为223.7±5.3 U/mg;Km为9.3±1.2 mmol/L,Vmax为270.3±4.3 μmol/(min·mg);Bgl52偏好性水解β-1,4糖苷键的底物;Fe2+和Mg2+对酶的激活作用明显,Co2+、Cu2+和SDS可抑制其活性;Bgl52是少有的几种葡萄糖和木糖激活型β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中外源添加0.2 mol/L葡萄糖时可提升活力至2.84倍,外源添加0.4 mol/L木糖时可提升活力至3.24倍,同时Bgl52在生理条件下基本不受产物的反馈抑制。【结论】利用嗜热微生物基因组中蕴藏的遗传信息资源,通过现代生物技术方法,可以从中挖掘到酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,为其在纤维素降解等工业领域的应用奠定基础。
    10  源于解淀粉芽胞杆菌酚酸脱羧酶的克隆与表达
    夏瑛,李良,董孝元,巩园园,方尚玲,陈茂彬,李琴
    2020, 47(7):2060-2071. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200264
    [摘要](342) [HTML](233) [PDF 5.85 M](350)
    摘要:
    【背景】酚酸脱羧酶催化分解酚酸产生的4-乙烯基酚类物质可用于食品添加剂及香精香料行业,而酚酸脱羧酶的表达水平相对较低,因此,高水平的酚酸脱羧酶是工业规模生产4-乙烯基酚类物质的先决条件。【目的】克隆解淀粉芽胞杆菌的酚酸脱羧酶基因,实现在大肠杆菌中的高效异源表达,分析酚酸脱羧酶的底物特异性,并对其表达条件进行优化。【方法】通过PCR技术获得酚酸脱羧酶的基因,构建重组基因工程菌,将测序结果与其他酚酸脱羧酶序列进行比对,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白。将重组酚酸脱羧酶与4种不同的底物进行反应,设计响应面试验对诱导条件进行优化。【结果】酚酸脱羧酶对对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸的比酶活比率为:100:23.33:15.39:10.51。结合与其他酚酸脱羧酶比对结果发现酚酸脱羧酶家族的C末端区域氨基酸序列的变异率最高,这与酚酸脱羧酶的底物特异性和催化机制有关。通过单因素和响应面试验得到酚酸脱羧酶诱导表达的最佳条件为:2×YT培养基,诱导温度30 °C,接种量1.78%,诱导时机3.8 h,IPTG 1.25 mmol/L,诱导时间18 h,此时预测酶活和实际酶活分别为47.61 IU/mL和47.55 IU/mL。【结论】应用响应面法优化酚酸脱羧酶的诱导表达是可行的,本试验为以后生产稳定、高产的酚酸脱羧酶以及了解其催化机理提供了重要的理论基础。
    11  土壤中高产蛋白酶菌株产酶条件及酶学性质
    曹慧,张腾月,赵龙妹,李源,杨佳萌,张朋振,任世威,张会会
    2020, 47(7):2072-2081. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200135
    [摘要](367) [HTML](395) [PDF 1.92 M](422)
    摘要:
    【背景】微生物蛋白酶已经成为工业用蛋白酶的主要来源,筛选具有特殊环境适应性的微生物成为生物酶资源的开发热点。【目的】通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选、优化及相关特性研究,寻找新的蛋白酶资源,为高原菌种资源利用提供科学依据。【方法】采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定,利用单因素试验和正交试验对菌株进行发酵条件优化及酶学性质的探究。【结果】筛选出一株高产蛋白酶菌株XC2,经鉴定菌株XC2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC2最优产酶条件:可溶性淀粉4.0%,牛肉膏1.0%,K+ 0.6%,培养温度34 °C、初始pH 7.0、接种量2.0%的条件下200 r/min振荡培养13 h,所产蛋白酶活力最高为638.5 U/mL。XC2所产蛋白酶最适反应温度60 °C,最适pH 9.0;40?50 °C、pH 8.0?10.0条件下酶活稳定性较高;Mn2+对酶活力有明显激活作用,而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+对酶活力有明显抑制作用。【结论】枯草芽孢杆菌XC2有较强的产碱性蛋白酶的能力,具有较好的应用前景。
    12  共价交联捕获聚酮合成中的酮基还原酶和酰基载体蛋白结构域的瞬时复合物
    徐徐,郑舰艇
    2020, 47(7):2082-2093. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200348
    [摘要](312) [HTML](320) [PDF 3.55 M](358)
    摘要:
    【背景】在模块化聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)的催化过程中,催化结构域与同源酰基载体蛋白(acyl-carrier protein,ACP)之间的蛋白质-蛋白质相互作用起重要作用,但这种瞬时可逆的相互作用难以捕捉分析。【目的】获得ACP和酮基还原酶(ketoreductase,KR)相互作用的蛋白复合物。【方法】在KR和ACP之间的linker上插入烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶切位点,通过双功能马来酰亚胺试剂BMH将KR和ACP共价交联,随后TEV酶切检测交联结果。调整反应条件,使交联效率最大化。根据KR-ACP交联复合物与体系内其他蛋白标签和分子量的差异,通过亲和层析和凝胶过滤等纯化手段,获得纯度较高的KR-ACP稳定交联复合物。【结果】单独表达的KR和ACP结构域交联不成功,融合表达的KR+ACP双结构域可以有效交联,结合使用亲和层析和凝胶过滤等纯化手段成功获得纯度较高的复合物。该策略可运用于多个KR和ACP的共价交联。【结论】建立了捕获并纯化KR和ACP瞬时相互作用复合物的有效方法,为后期晶体结构的解析、KR与ACP相互作用机理的揭示及参与相互作用关键氨基酸的鉴定提供了实验基础。
    13  有机磷降解酶在重组大肠杆菌中的表达及一步纯化固定化
    周丽亚,欧阳亚萍,薛赛光,姜艳军
    2020, 47(7):2094-2105. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200193
    [摘要](395) [HTML](286) [PDF 2.98 M](353)
    摘要:
    【背景】有机磷化合物作为一类广谱杀虫剂,因其用量大、毒性强且不易降解,在自然界中的残留已对环境造成了严重污染。【目的】有机磷降解酶(organophosphohydrolase,OpdA)可降解多种有机磷化合物,探究其被固定到NiCo2O4载体上后用于有机磷化合物的降解效果。【方法】构建含组氨酸标签(histidine tag,His-tag)的OpdA,以pET-28a(+)为载体,Escherichia coli Rosetta(DE3)为宿主细胞,在终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导下表达His-tagged OpdA。采用一步纯化固定化方法,实现固定化酶(OpdA@NiCo2O4)的制备。【结果】采用水热处理和煅烧制备了含过渡金属离子的NiCo2O4,利用过渡金属离子对酶分子表面组氨酸咪唑基的配位作用,实现了发酵粗酶液中His-tagged OpdA的一步纯化固定化,在优化条件下获得了高稳定性的OpdA@NiCo2O4;然后将其用于有机磷化合物的降解,在NaBH4存在条件下,通过级联反应和降解条件优化,实现了有机磷化合物的高效降解。【结论】该研究不但实现了重组酶的一步分离纯化和固定化,也为有机磷化合物的降解提供了一条安全、高效、环保的新途径。
    14  理性设计提高酯合成催化反应脂肪酶的热稳定性
    温露文,徐岩,喻晓蔚
    2020, 47(7):2106-2118. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190819
    [摘要](326) [HTML](289) [PDF 1.62 M](431)
    摘要:
    【背景】南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctica lipase B,CALB)具有优异的酯合成活性,是在非水相催化中应用极为广泛的工业用酶。【目的】在保留CALB优秀催化性能的基础上,提高CALB的热稳定性。【方法】采用预测软件PoPMuSiC和FoldX计算CALB潜在热稳定性突变位点,并根据氨基酸残基的空间位置进一步筛选。利用重叠延伸PCR技术在基因calb中引入10个单点突变,于毕赤酵母GS115中表达。【结果】点突变A146G、A151P、L278M均能有效提高CALB的热稳定性。在单点突变的基础上,组合突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的热稳定性得到进一步提高。与野生型相比,突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的最适反应温度均提高了5 °C,Tm值分别提高了3.3 °C和4.2 °C。此外,合成己酸乙酯的酶促反应动力学分析表明,相比于野生型,突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P对己酸和乙醇均具有更高的亲和力,且对己酸的催化效率kcatA/KmA是野生型的4.1倍。通过分子动力学模拟,从分子水平阐明了突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P热稳定性提高的机制。【结论】本研究采用的理性设计策略对提高CALB的热稳定性是行之有效的,该策略可作为其他工业用酶提高热稳定性的参考。
    15  内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力
    程新宽,陈曦,冯进辉,吴洽庆,朱敦明
    2020, 47(7):2119-2127. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200110
    [摘要](273) [HTML](288) [PDF 2.18 M](345)
    摘要:
    【背景】高效实现D-氨基酸的生物合成一直是人们关注的热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,DAPDH)能够直接催化2-酮酸和氨合成D-氨基酸。【目的】提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,并解释其催化机制。【方法】以来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacterium thermophilum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)为模板,在前期结构分析结合被选择位点突变结果的基础上,确定对H227位进行定点饱和突变,并以D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-谷氨酸为底物进行筛选。【结果】获得突变体H227Q和H227N。突变体H227Q对丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-酮戊二酸的比活力比野生型分别提高了10.9、11.5、8.6和7.6倍。动力学参数表明,突变体H227Q同时提高了酶对底物的亲和力及催化常数,使其对丙酮酸的催化效率(kcat/Km)相较于野生型提高了9.4倍。利用分子模拟技术分析突变体H227Q与产物氨基酸之间的相互作用表明,227位的谷氨酰胺通过与氨基酸的羧酸形成氢键,使得氨基酸产物Cα上的氢和辅酶烟酰胺环C4原子之间的距离缩短。【结论】利用定向进化技术提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,有助于开发新型的高效生物催化剂,这些工作也为下一步继续进行更具挑战性的D-氨基酸研究提供了基础。
    16  定向引入N-糖基化位点改进黑曲霉β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性
    吴凤梅,周燕霞,姚冬生,谢春芳
    2020, 47(7):2128-2139. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200187
    [摘要](348) [HTML](321) [PDF 7.69 M](393)
    摘要:
    【背景】木聚糖是生物圈中仅次于纤维素的第二大多糖,其结构复杂,完全降解需要多种木聚糖酶协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶,已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中,由于真菌木聚糖酶的热稳定性较差,限制了其在工业中的应用。【目的】提高来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的β-1,4-内切木聚糖酶(xynB)热稳定性。【方法】采用氨基酸虚拟突变技术对xynB定向引入一个N-糖基化位点,将虚拟突变后筛选获得的候选突变体和野生型在毕赤酵母SMD1168中表达,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和稳定性分析。【结果】经虚拟突变和筛选获得5个候选突变体,在毕赤酵母SMD1168中成功表达了4个突变体,其中3个突变体发生了糖基化。突变体和野生型酶均表现出宽范围的酸碱耐受性,且突变体xynBA92N/D94T在pH 4.0–11.0条件下的稳定性明显优于野生型;糖基化突变体xynBA92N/D94T、xynBG66N/A68T和xynBG66F/D67N/G69T在温度为60–80 °C时热稳定性明显高于野生型,xynBG66N/A68T在80 °C保温30 min后的残留酶活比野生型提高了约30%。【结论】本研究方法可为其他来源木聚糖酶和其他工业酶的热稳定分子改造提供参考。
    17  费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵
    马红丽,付晓平,郑雯,徐健勇,郑宏臣,宋诙
    2020, 47(7):2140-2150. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200176
    [摘要](263) [HTML](217) [PDF 3.79 M](293)
    摘要:
    【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103% (体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24 °C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10 (pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。
    18  重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖
    吴昊,黄嘉苇,张文立,沐万孟
    2020, 47(7):2151-2160. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200226
    [摘要](306) [HTML](359) [PDF 2.26 M](326)
    摘要:
    【背景】D-甘露糖的酶促转化方法已受到相当大的关注。【目的】研究D-葡萄糖异构酶(D-glucose isomerase,D-GIase)和D-来苏糖异构酶(D-lyxose isomerase,D-LIase)共表达于大肠杆菌细胞生产D-甘露糖的工艺条件。【方法】将D-GIase和D-LIase基因片段合成后酶切连接到载体pCDFDuet-1上,构建pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,通过摇瓶培养得到产D-GIase和D-LIase的菌体,测定该共表达细胞体系的反应条件。【结果】添加1 mmol/L Co2+,共表达体系酶的最适温度和pH分别为70 °C和6.0。以浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖,平衡后D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L,相应的转化率分别为13.8%、12.7%、12.5%,D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50?37.5?12.5。【结论】 D-GIase和D-LIase在大肠杆菌细胞中组成的共表达体系通过一锅法可利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。
    19  纳米材料固定化酶的研究进展
    董文玥,姚培圆,吴洽庆
    2020, 47(7):2161-2176. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200318
    [摘要](450) [HTML](750) [PDF 1.35 M](522)
    摘要:
    近年来,纳米技术为酶固定化提供了多种纳米级材料,纳米材料固定化酶不仅具有高的酶负载量,而且具有良好的酶稳定性。本文基于纳米材料固定化酶,对纳米材料的种类进行了总结,分析了纳米材料对固定化酶性能的影响,并介绍了纳米级固定化方法及纳米材料固定化酶在生物转化、生物传感器、生物燃料电池等领域的应用。
    20  多孔纳米材料固定化酶研究进展
    姚稼灏,薛雅鞠,赵永亮,纪秀玲,任保增,黄玉红
    2020, 47(7):2177-2192. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200351
    [摘要](390) [HTML](543) [PDF 9.09 M](431)
    摘要:
    酶是一种天然生物催化剂,有催化效率高、底物选择性强和绿色环保等优点,但酶结构不稳定且重复利用率低,制约了其产业化应用。随着技术的发展,酶的固定化可以提高酶的活性和稳定性,为生物酶的工程化应用带来了新的机遇。多孔纳米材料具有比表面积大、孔隙率高、机械和化学性能稳定等特点和优异的成本效益,是理想的固定化酶载体。本文综述了近些年来金属有机框架、共价有机框架和多孔微球等纳米材料固定化酶的研究进展和应用,重点介绍了载体固定酶的方式,并总结了每种载体的特点,最后讨论了多孔纳米材料固定化酶面临的挑战和发展趋势。
    21  酶作为治疗性药物的研究进展
    时清华,秦斌,游松
    2020, 47(7):2193-2206. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200238
    [摘要](458) [HTML](1412) [PDF 815.45 K](484)
    摘要:
    酶制剂作为药物已成为生物制药领域的一个热点。世界各国药典中含有越来越多的酶制剂,其中大部分已成为治疗各种重大疾病的有效药物。酶对底物具有很高的亲和力和特异性,而且能催化多种目标分子转化为所需产物,这两种特性使得酶可作为一种特殊药物执行小分子无法进行的治疗性生物化学反应。利用生物技术开发新的酶类药物,采用化学修饰的手段降低治疗酶的免疫原性及提高其相对稳定性,是目前探索酶类药物的研究方向。本文系统地概述了国内外酶作为治疗性药物的最新研究进展及展望。
    22  内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然手性D-氨基酸的研究进展
    程新宽,殷利眷,任思羽,彭磊,姚远,马龙
    2020, 47(7):2207-2217. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200160
    [摘要](298) [HTML](277) [PDF 1.31 M](380)
    摘要:
    内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶不对称合成非天然的手性D-氨基酸是目前生物催化领域的研究热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶具有优良的立体选择性,利用其进行酶催化不对称合成光学纯的手性D-氨基酸,被广泛用于医药、食品、化妆品、精细化学品等领域。为了促进生物催化法在合成手性D-氨基酸方向的进一步发展,本文对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化合成D-氨基酸的现状进行了综述。重点介绍了Corynebacterium glutamicum、Ureibacillus thermosphaericus、Symbiobacterium thermophilum来源的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶在新酶的挖掘、催化性能、晶体结构解析、分子改造、功能与催化机制、合成D-氨基酸新途径等方面的研究进展,并对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的未来研究方向及策略进行了展望。本综述将进一步加深人们对内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的认识,也为具有挑战性的生物合成任务提供信息借鉴。
    23  甾体微生物转化反应关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶的研究进展
    贾红晨,李芳,郑鑫铃,崔慧林,骆健美,申雁冰,王敏,田妥,丁安鹏
    2020, 47(7):2218-2235. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200240
    [摘要](272) [HTML](295) [PDF 3.12 M](382)
    摘要:
    3-甾酮-Δ1-脱氢酶是甾体化合物微生物代谢的关键酶,负责催化3-酮基类甾体化合物A环上的C1,2位脱氢反应。其不仅在甾体母核的早期降解途径中发挥重要作用,而且能通过A环C1,2位上双键的导入显著提高甾体化合物的生理活性。本文详细阐述了3-甾酮-Δ1-脱氢酶在微生物中的种属分布和序列特征、酶的生物学特性、生理作用、催化机理以及分子改造等,为深入研究该酶在甾体生物转化领域中的应用提供重要参考。
    24  谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究概述
    孙磊,王苑,柏映国,罗会颖,姚斌,涂涛
    2020, 47(7):2236-2244. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190879
    [摘要](412) [HTML](769) [PDF 7.19 M](386)
    摘要:
    谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化l-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。γ-氨基丁酸在人体中作为一种抑制性神经递质,具有重要的生理功能,可以被广泛应用于食品和制药工业中。本文就谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究进展进行概述。
    25  细胞色素P450酶的结构、功能与应用研究进展
    宋展,高鑫,吴冕,路福平,秦慧民
    2020, 47(7):2245-2254. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200302
    [摘要](544) [HTML](1591) [PDF 1.75 M](545)
    摘要:
    细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)酶是广泛存在于微生物、动植物及人体中与膜结合的血红蛋白类酶,具有氧化、环氧化、羟化、去甲基化等多种生物催化活性。CYP酶在药物、类固醇、脂溶性维生素和许多其他类型化学物质的代谢中具有重要作用,其在异源物质的解毒、药物相互作用和内分泌功能等领域的研究是热点问题。本综述对CYP的结构、功能、临床应用与开发前景进行了概述,并对其最新的研究现状和发展前景进行探讨。
    26  羧酸还原酶的研究进展
    石焜,郁惠蕾,许建和
    2020, 47(7):2255-2265. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200254
    [摘要](323) [HTML](1303) [PDF 2.65 M](426)
    摘要:
    羧酸还原酶(carboxylic acid reductases,CARs)可以催化羧酸还原为相应的醛,反应条件温和、拥有广阔的底物范围且副反应较少。本文旨在综述近年来羧酸还原酶系统发育、结构与催化机理、蛋白质工程和固定化工程等方面的研究成果,揭示其作为重要工具酶在生物转化及合成生物学中的应用前景。
    27  细菌磷酸转移酶系统(PTS)的组成与功能研究进展
    刘倩钰,吴丽雯,牛建军,赵西林
    2020, 47(7):2266-2277. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200134
    [摘要](487) [HTML](2507) [PDF 1.61 M](575)
    摘要:
    细菌磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)-磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)广泛存在于细菌、真菌和一些古细菌中,但不存在于动植物中。PTS由酶I (EI)、组氨酸磷酸载体蛋白(HPr或NPr)和酶II复合物等磷酸转移酶组成,既具有催化转运功能,又具有非常广泛的调节功能。PTS主要是通过磷酸级联反应将各种糖及其衍生物进行磷酸化然后运输到胞内。其不仅参与碳、氮中心代谢,调节铁、钾稳态,调控某些病原体的毒力,还能介导应激反应。在这些不同的调节过程中,信号由PTS组分的磷酸化状态提供,而该磷酸化状态根据PTS底物的可用性和细胞代谢状态的变化而变化。本文对细菌中磷酸转移酶系统的组成和调控网络进行综述,以期为PTS的整体调控机制及其对细菌整体代谢影响的研究提供参考依据。
    28  高效木聚糖降解酶系定制的新进展与挑战
    吴秀芸,戴琳,张舒,尚伟昊,余俊红,黄小平,王禄山
    2020, 47(7):2278-2289. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200316
    [摘要](337) [HTML](337) [PDF 1.29 M](450)
    摘要:
    木聚糖是植物细胞壁中含量最丰富的非纤维素多糖,大约占陆地生物质资源的20%?35%。不同物种来源的木聚糖结构因取代方式不同而具有广泛的异质性,这对生物质资源向生物燃料和其他高值产品高效转化提出了重大挑战。因此,需要开发由不同类型酶组成的最佳混合物以有效糖化木聚糖类底物。但是针对特定类型的底物设计高效降解酶系十分困难,应考虑底物的类型、底物的组成和物理性质、多糖的聚合度以及不同降解酶组分的生化性质等。本文从不同植物木聚糖的结构异质性与合成复杂性方面展示了其抗降解屏障,同时介绍了木聚糖主链降解酶系及侧链降解酶系的多样性以及协同降解作用,综述了复杂生境中微生物种群产生的混合酶系、降解菌株产生的高效酶系,以及基于特定木聚糖底物改造并定制简化高效的酶系统。随着不同种类木聚糖精细结构和木聚糖降解酶底物特异性的深入研究,针对特定底物类型进行绿色高效木聚糖酶系定制,加速木聚糖类底物的降解,从而实现木质纤维素资源的绿色高值化利用。
    29  β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能研究进展
    李娜,张蕊,黄遵锡,周峻沛
    2020, 47(7):2290-2299. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200201
    [摘要](256) [HTML](337) [PDF 891.65 K](333)
    摘要:
    β-木糖苷酶是木聚糖酶酶系的一种酶,其功能主要是降解半纤维素中最常见及含量最高的组分——木聚糖。近些年,研究人员发现一些微生物来源的β-木糖苷酶具有生物活性物质转化功能,可通过转糖基作用形成带有木糖基的生物活性物质,也可通过水解作用将带有木糖基的物质,如三七皂苷R1和R2、黄芪甲苷IV (astragaloside IV,ASI)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetyltaxol,XDT)和花青素转化为生物活性物质,因此,这些β-木糖苷酶在食品和医药等领域具有巨大的潜在应用价值。此外,研究人员揭示了β-木糖苷酶在生物活性物质转化功能方面的一些机制。本文主要介绍了β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能、酶来源、家族分类、转化机制及应用,以期为β-木糖苷酶的进一步开发利用提供参考。
    30  木聚糖酶与XIP型木聚糖酶抑制蛋白相互作用分子机制的研究进展
    刘新育,谢夏,朱东东,陈红歌
    2020, 47(7):2300-2308. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200059
    [摘要](243) [HTML](245) [PDF 15.26 M](314)
    摘要:
    Xylanase inhibitor protein (XIP)型木聚糖酶抑制蛋白对大部分GH10、GH11家族的真菌木聚糖酶具有抑制作用,但是却不能抑制细菌来源和植物自身所产生的木聚糖酶。XIP型木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶的抑制作用主要是通过模拟底物接触酶的活性位点,迅速阻塞底物进入活性位点区域的通道。然而,在对XIP型木聚糖酶抑制蛋白具有抗性的GH10和GH11木聚糖酶晶体结构中,连接二级结构的loop构象严重阻碍了XIP型木聚糖酶抑制蛋白的抑制功能。与对XIP型木聚糖酶抑制蛋白敏感的木聚糖酶相比,氨基酸残基的插入突变导致抗性木聚糖酶的loop具有明显的凸出构象;而在GH11家族抗性木聚糖酶中,“拇指”结构中部分氨基酸的替换致使XIP型木聚糖酶抑制蛋白与“拇指”结构无法形成稳固的氢键和疏水建,从而削弱XIP的抑制作用。
    31  来源于真菌AA9家族裂解性多糖单加氧酶的研究进展
    郭宵,安亚静,柴成程,蒋露莹,路福平,刘夫锋,戴玉杰
    2020, 47(7):2309-2320. DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200317
    [摘要](343) [HTML](371) [PDF 1.37 M](435)
    摘要:
    AA9家族的裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)广泛存在于真菌中,由于其能作用于木质纤维素的结晶多糖,从而使其在生物转化生物质方面发挥重要的作用。本文首先综述了AA9家族LPMO的结构特点、催化机制、结构与功能之间的关系,其次阐述了AA9家族LPMO的微生物表达与调控,最后简单介绍了AA9家族LPMO在转化木质纤维素中的应用。

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