DING Jiabo, Tel: 86-10-61255327; E-mail:
布鲁氏菌可经口、皮肤、黏膜和呼吸道感染人和动物。小鼠是布鲁氏菌研究中最常用的模型动物。
建立牛种布鲁氏菌2308不同途径和剂量感染BALB/c小鼠的模型,为布鲁氏菌小鼠感染试验提供参考。
用101−105 CFU这5个不同感染剂量,分别经注射、口服和点眼方式感染BALB/c小鼠。在感染后不同时间点采集小鼠血清,检测IgG、IgM、IgA抗体含量、脾脏重量及脾脏含菌量,评价布鲁氏菌经不同途径感染BALB/c小鼠的效果。
10 CFU是注射感染BALB/c小鼠的最小感染剂量;105 CFU是口服感染BALB/c小鼠的最小感染剂量。101−105 CFU这5个不同感染剂量经点眼途径均未能成功感染BALB/c小鼠。在105 CFU感染剂量下,口服与注射感染组小鼠每克脾脏平均含菌量分别为105.673 CFU/g和105.009 CFU/g,无显著差异(
建立了牛种布鲁氏菌2308通过不同途径感染BALB/c小鼠的模型。
The study aimed to establish the BALB/c mice model infected by
The BALB/c mice were infected with 5 different doses of 101−105 CFU by injection, mouth and eye droppings respectively. The serum samples were collected at different time points after infection in order to detect IgG, IgM and IgA antibodies. Combined with the results of spleen weight and bacteria content, we evaluated the effect of BALB/c mice model infected with
The results showed that 10 CFU was the minimum infection dose for injection, and 105 CFU was the minimum infection dose for oral administration. The BALB/c mice could not be successfully infected with 5 different doses of 101−105 CFU by eye droppings. At 105 CFU infection dose, the average bacteria content per gram spleen of mice in oral and injection groups was 105.673 CFU/g and 105.009 CFU/g respectively, and there was no significant difference between them (
This study established the BALB/c mice model infected
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁氏菌引起的一种变态反应性人畜共患传染病,对畜牧业生产和人类健康危害严重。有统计资料表明,全球每年约有50万人感染布病[
在构建布鲁氏菌感染模型方面,啮齿类动物尤其是小鼠是常用的试验模型[
牛种布鲁氏菌2308 (CVCC788)由国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室保存;TSA和TSB培养基均购自BD公司;HRP标记山羊抗鼠IgG、IgM、IgA均购自Sigma公司;4−6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有涉及布鲁氏菌活菌的试验操作均在生物安全3级实验室内完成。
将牛种布鲁氏菌菌株2308接种至TSB培养基,37 ℃、180 r/min条件下培养24 h。用生理盐水稀释培养菌液至106、107、108这3个不同的稀释度,每个稀释度取100 μL涂布在TSA平板上,在37 ℃培养3 d,取TSA平板进行计数。选择合适稀释度的平板计数(一般选择单个菌落数40−200个的平板)并计算菌液的细菌含量。
根据计算的细菌含量,用生理盐水10倍比稀释菌液,稀释至102−108 CFU/mL,共7个不同稀释度。取102−106 CFU/mL 5个稀释度腹股沟皮下注射小鼠,每只小鼠注射0.1 mL;取103−107 CFU/mL 5个稀释度经口服感染小鼠,每只小鼠口服10 μL;取104−108 CFU/mL 5个稀释度经点眼感染小鼠,每只小鼠点眼1 μL;即不同感染途径每组小鼠的感染量均分别为1×101、1×102、1×103、1×104、1×105 CFU/只。每个感染途径不同感染剂量组小鼠各5只,同时设立阴性对照小鼠5只。
在布鲁氏菌感染的2、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别采用颌下静脉采血法采集全部小鼠的静脉血,分离血清。用本实验室建立的iELISA方法检测小鼠体内IgG、IgM、IgA抗体水平。具体方法为:用裂解的布鲁氏菌全菌蛋白包被96孔ELISA板,1.5 μg/孔。用含2%牛血清白蛋白的PBS 4 ℃封闭过夜,洗板后−20 ℃保存备用。检测小鼠血清时,用PBS将小鼠血清作1:50倍稀释。将稀释好的小鼠血清分别加入到ELISA板中,100 μL/孔。加样结束后,37 ℃作用30 min。取出反应板,弃去反应液,每孔加入300 μL磷酸盐吐温缓冲液(Phosphate-Buffered Saline with Tween-20,PBST),洗涤3次,最后1次甩干或拍干。将HRP标记山羊抗鼠IgG、IgM、IgA分别用PBS作1:10 000稀释后,每孔加入100 μL,37 ℃作用30 min。洗涤3次,甩干。将底物显色液立即加入到ELISA反应板中,100 μL/孔,室温避光显色15 min后每孔加50 μL终止液(1 mol/L H2SO4)终止反应。反应终止后,15 min内用酶标仪测定
在布鲁氏菌感染的第84天采集小鼠血清后,将小鼠剖杀,无菌采集其脾脏、称重。取脾脏放入研磨器中,按其重量加入生理盐水(每0.01 g加入100 μL生理盐水),然后再进行10、100、1 000、10 000倍稀释,取每个稀释度的稀释液100 μL涂布TSA平板,37 ℃培养3 d,取TSA平板进行计数、菌落形态观察[
各试验组在2308感染实验小鼠后2、7、14、21、28、42、56、70、84 d分别采集血清,经iELISA测定的IgG、IgM、IgA抗体结果见
牛种布鲁氏菌2308注射感染组小鼠抗体平均S/N值曲线
The average S/N curve of antibody in mice infected with
牛种布鲁氏菌2308口服感染组小鼠抗体平均S/N值曲线
The average S/N curve of antibody in mice infected with
牛种布鲁氏菌2308点眼感染组小鼠抗体平均S/N值曲线
The average S/N curve of antibody in mice infected with
口服感染组,仅105 CFU感染剂量组全部小鼠检测到IgG、IgM抗体阳性,104 CFU感染剂量组只有2只小鼠检测到IgG、IgM抗体阳性,其余各感染组均检测为阴性(
点眼感染组,101−105 CFU各感染剂量组均未检测到IgG、IgM、IgA抗体阳性(
在牛种布鲁氏菌2308感染第84天,剖杀小鼠,测定脾脏重量和含菌量,观察菌落形态,并对脾脏分离细菌进行AMOS-PCR鉴定,结果见
AMOS-PCR鉴定
AMOS-PCR identification
牛种布鲁氏菌2308感染BALB/c小鼠的脾脏重量
The spleen weight of BALB/c mice infected with
牛种布鲁氏菌2308感染BALB/c小鼠的脾脏含菌量
The bacterial content in spleen of BALB/c mice infected with
点眼感染组,101−105 CFU各感染剂量组小鼠脾脏平均重量分别为0.088、0.079、0.080、0.080、0.079 g,与阴性对照小鼠脾脏平均重量0.077 g没有显著差异(
口服感染组,101−103 CFU各感染剂量组均未分离到布鲁氏菌,小鼠脾脏平均重量分别为0.078、0.082、0.087 g,与点眼感染组、阴性对照组小鼠脾脏平均重量没有显著差异(
注射感染组,101−105 CFU各感染剂量组全部小鼠脾脏均分离到布鲁氏菌,脾脏平均重量分别为0.210、0.190、0.152、0.189、0.165 g,各组小鼠脾脏平均含菌量分别为105.212、105.184、104.782、105.117、105.009 CFU/g,其中101−104 CFU各感染剂量脾脏平均重量均显著高于同剂量口服感染和点眼感染组(
上述结果表明,以点眼感染方式,101−105 CFU剂量均未能成功感染BALB/c小鼠。以口服感染方式,104 CFU剂量只能感染部分小鼠,105 CFU剂量可成功感染全部小鼠,所以105 CFU是牛种布鲁氏菌2308口服感染BALB/c小鼠的最小感染剂量。以注射感染方式,101−105 CFU剂量均能成功感染全部小鼠,所以101 CFU是牛种布鲁氏菌2308注射感染(腹股沟皮下注射) BALB/c小鼠的最小感染剂量。
布病是由胞内寄生的布鲁氏菌感染而引起,动物感染后主要导致流产和不孕,人类通常是因为接触受感染的动物或动物产品而感染该病,可引起发热、关节炎、心内膜炎和脑膜炎[
本研究用101−105 CFU这5个不同剂量分别通过注射、口服和点眼3种方式进行小鼠感染试验。结果在点眼感染方式中,即便是试验的最高剂量(105 CFU/只)也未能实现成功感染。105 CFU感染组小鼠脾脏平均重量为0.079 g,与阴性对照小鼠脾脏平均重量0.077 g没有显著差异(
本研究结果表明,不同感染途径的最小感染剂量差异显著。对于注射感染,仅101 CFU就能成功感染全部试验小鼠,而口服方式则需要10 000倍的注射剂量(105 CFU)才可成功感染全部小鼠,点眼方式则需要更高的剂量。以105 CFU剂量通过注射或者口服均可实行感染,而且不同途径感染小鼠的每克脾脏平均含菌量并无显著差异(
不同感染时间小鼠体内抗体测定结果表明,在105 CFU感染剂量下,注射感染方式和口服感染方式小鼠体内IgG抗体的滴度随感染时间增加持续升高,但口服感染方式IgG抗体在感染后84 d达到的峰值是注射感染方式的1.9倍,同时口服感染组有2只小鼠在感染28 d后持续检测到IgA抗体阳性,而注射感染各剂量组均未检测到IgA抗体阳性,说明不同感染方式刺激机体产生的抗体类型有所不同,而口服感染方式可刺激小鼠产生更强的体液免疫反应。由于IgA虽然可以结合抗原,但不能激活补体的经典途径,因此不像IgG那样能发挥许多的生物效应,但近年的研究发现,循环免疫复合物的抗体中有相当比例的IgA,因而认为血清型IgA以无炎症形式清除了大量抗原,以防止这些抗原诱导的炎症或自身免疫,是维持机体内环境稳定有益的免疫效应。但在布鲁氏菌相关抗体亚型研究中少有关于血清型IgA的研究报道。本研究从口服感染组的2只小鼠血清中持续检测到布鲁氏菌特异性IgA抗体,表明血清型IgA在布鲁氏菌感染的特定个体中存在免疫调节作用。已有的研究表明通过消化道或呼吸道进行人工感染/免疫,局部可产生大量的分泌型IgA (SIgA),在局部免疫反应中发挥重要作用,是机体黏膜表面的一个重要防御因素。因此本研究通过口服方式成功感染的小鼠是否在口腔黏膜存在局部高浓度的SIgA抗体及其抗感染的作用值得进一步研究。
本研究的结果表明,在相同感染剂量下,口服方式比注射方式可刺激小鼠机体产生更强的免疫反应。然而在临床上,家畜布病的发生大多不是通过注射感染,通过舔食患病动物的流产物而引起感染是重要的传播方式,据报道患病动物的流产物中布鲁氏菌含量可高达1013 CFU/g,因此极易在群体中形成感染[
本实验室前期在布鲁氏菌天然宿主牛上建立了牛种布鲁氏菌2308注射感染模型并持续监测了IgG、IgM抗体变化规律,与本研究建立的小鼠注射感染模型IgG、IgM抗体变化规律相比较,两者IgG抗体的滴度均随感染时间增加持续升高,而注射感染牛的IgM抗体滴度在感染30 d达到峰值,随后很快下降,90 d后检测为阴性[
本研究成功建立了牛种布鲁氏菌2308经注射、口服途径感染BALB/c小鼠的模型。101 CFU是注射感染(腹股沟皮下注射) BALB/c小鼠的最小感染剂量;105 CFU是口服感染BALB/c小鼠的最小感染剂量。尽管注射感染方式最敏感,但由于其不是临床家畜感染布鲁氏菌的主要途径,而且小鼠脾脏重量、脾脏含菌量、抗体变化规律结果表明口服方式比注射方式可刺激小鼠机体产生更强免疫反应,因此在布病研究中口服感染小鼠模型更适用。本研究虽然未能成功建立点眼途径感染BALB/c小鼠的模型,但研究结果表明105 CFU的感染剂量不能经点眼途径成功形成感染,未来在点眼途径感染BALB/c小鼠模型的建立中应使用更高的感染剂量。本研究为布鲁氏菌感染小鼠模型的构建与应用提供了参考依据。
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