2025, Vol. 52扩展功能
文章信息
- 黄子鸣, 刘明, 周露萍, 吴文捷
- HUANG Ziming, LIU Ming, ZHOU Luping, WU Wenjie
- 液滴微流控分析技术在细菌快速检测中的应用
- Application of droplet microfluidic analysis technology in rapid detection of bacteria
- 微生物学通报, 2025, 52(5): 2001-2017
- Microbiology China, 2025, 52(5): 2001-2017
- CSTR: 32113.14.j.MC.240687
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240687
-
文章历史
- 收稿日期: 2024-08-15
- 接受日期: 2024-12-06
- 网络首发日期: 2025-01-09
2. 中国科学院杭州医学研究所, 浙江 杭州 3100223;
3. 浙江省肿瘤医院, 浙江 杭州 310022
2. Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences, Hangzhou 310022, Zhejiang, China;
3. Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, Zhejiang, China
细菌广泛存在于食品药品生产[1]、环境监测监管[2]和临床医疗工作[3]等领域，对人类健康与安全构成多方面的威胁。细菌检测对食品药品和环境安全的维护，以及对感染性疾病的防控至关重要。近年来，随着细胞治疗技术的快速发展，对产品质量的快速检测也提出了更高的要求。《GMP附录-细胞治疗产品》中明确指出“细胞治疗产品的生产全过程应当尤其关注防止微生物污染”，而细菌检测则是细胞治疗产品放行的重要评价参数之一[4]。由于细胞治疗类产品有效期极短，精准快速地检测出可能存在的细菌是保证其临床用药的安全性和时效性的关键所在。目前，平皿计数法、多管发酵法、滤膜法等被视为“金标准”的传统细菌检测技术因操作复杂、耗时较长等已经越来越难以满足快速性、实时性、高灵敏度等方面的需求[5]。细菌快速检测技术也因此应运而生，成为国内外研究的热点。
液滴微流控分析技术是近年发展起来的高精度定量分析方法，在生物医学与食品营养等领域均有颇多应用[6-10]。这项技术的原理是在微流控平台上通过特定的方法生成数以万计的内含特定物质的液滴，并对液滴中所发生的物理、化学、生物过程或反应时所产生的信号进行识别判读，以区分阴性与阳性液滴，然后根据泊松分布原理进行计算，从而实现对目标检测物的绝对定量分析。与传统定量分析技术不同，液滴微流控分析技术无须依赖标准样品即可实现绝对定量分析，其在检测灵敏度和定量分析精度等方面也显著优于传统定量分析技术[11]。因此，液滴微流控分析技术的出现为细菌快速检测提供了新的方向和机遇。本文结合作者们的自身工作，对近年来液滴微流控分析技术在细菌检测中的应用进行了总结，并就其应用前景进行了展望。
1 液滴微流控分析技术简介液滴微流控技术是微流控技术领域的一个分支，该技术旨在将原本连续的流体转换成多个单独的、离散的微液滴，并对这些液滴进行操控。液滴微流控分析技术则是一种基于液滴微流控的分析技术，在操控液滴的基础上通过特定的方式对其进行分析。自He等[12]于2005年首次实现液滴式单细胞捕获至今，液滴微流控分析技术已在微生物培养、微生物检测与特征描述、抗生素敏感性测试、微生物相互作用以及微生物技术等众多微生物学相关领域得到了广泛的应用[8]。
液滴微流控分析过程中最主要的3个步骤包括目标物随机封装、孵育及信号检测(图 1)。液滴生成是实现目标物随机封装的关键，在该过程中大体积样本被离散成数千至数百万个微滴，根据泊松分布原理，使每个液滴至多包含1个目标物。液滴在微流控芯片中的生成和存在形式主要包括2种。一种是通过光刻技术制造微井/微笼等微结构，从而平行地形成液滴阵列[13-14]。但受限于微井/微笼的数量，导致可检测的体积较小，并且芯片结构复杂，加工较为困难；另一种是通过微通道及对界面特性的控制生成液滴并悬浮于不混溶的载液中[15]，该形式是一个连续过程，理论上不存在待测样本体积限制，但在处理大体积样本时耗时较长。常见的液滴生成结构包括T型结构、流动聚焦结构及共轴结构(图 2)，这类结构仅含单一生成模块，通量小，生成频率约1 000 Hz。液滴生成总频率与生成模块的数量直接相关，增加液滴生成模块是实现高通量的液滴生成的常用方法，例如可以并行多个流动聚焦结构或采用多层结构[16-17]。但这类芯片往往体积过大、芯片利用率偏低、加工成本较高。随着液滴生成结构的不断优化，阶梯乳化结构的提出实现了超高通量的液滴生成[18]。该结构能集成数百个液滴生成口，生成速率可达8.2 L/h，超高通量液滴生成让大体积样本的处理和检测成为可能[19]。
|
| 图 1 液滴微流控分析技术示意图 Figure 1 Schematic diagram of droplet microfluidic analysis technology. |
|
|
|
| 图 2 不同液滴生成结构示意图 Figure 2 Schematic diagram of different droplet formation structures. |
|
|
液滴孵育是信号产生的过程。常见的信号类型包括荧光、散射光、光谱、图像、电信号、质谱、核磁共振谱等，而检测速度、准确度、精密度和灵敏度等因素则受不同信号类型与检测方式的影响[20]。将待测样本处理成小体积液滴的过程中，各待测单元中背景信号强度显著降低，待测目标物浓度呈数量级的增高，从而提高了信噪比和检测灵敏度，并缩短了检测时间[21-22]。液滴大小也是影响检测的关键因素之一，其主要取决于液滴生成处的几何尺寸和两相流速[23]。大于数百纳升的液滴容易破裂，在连续流动液滴微流控分析中应用较少；而体积远小于1 pL的液滴尽管已经可以用现有技术生成且可以使信噪比和检测灵敏度显著提升，但亚微米的尺度会使光学显微镜成像的难度大幅增加[24]。除此之外，样本中待测目标物的浓度是影响检测信号的另一关键因素，根据泊松分布原理，较高的浓度，会增加单个液滴包裹多个目标物的概率，从而影响定量分析结果的准确性；而较低的浓度，则会增加空液滴的比例，延长了从开始检测到第一个阳性液滴的时间。若液滴的体积过小，则会降低检测系统的体积通量，从而延长整个检测的周转时间[21]。因此，液滴体积和待测样品体积之间的优化非常重要。在完成液滴孵育、信号达到检测阈值后即进入检测阶段，通过光学显微镜或其他设备进行阴性和阳性信号识别，完成定量分析过程。
综上所述，液滴微流控分析技术有以下4个优点：(1) 高通量，能同时进行数百万的生化反应；(2) 高灵敏度，飞升至纳升级液滴可显著降低各待测单元中的背景干扰，并提高待测目标物浓度；(3) 快速，能更快地产生信号；(4) 绝对定量，将单个标靶封装到液滴中进行定量分析而不依赖于标准样品[15]。
2 液滴微流控分析技术在细菌检测中的应用液滴微流控通常利用氟化油和表面活性剂作为液滴载体以使其稳定存在，这样既可创建一个防止液滴内容物与管壁非特异性吸附的界面，又可以提供液滴内容物间特异性结合的封闭反应体系[25-27]。这种体系稳定性和生物相容性为细菌检测提供了一种相对理想的外部环境。此外，液滴微流控分析技术可将单个细胞从庞大的混合体系中分离出来，通过缩小体积的方式实现单细胞信号(如代谢产物、分泌因子等)的快速累积，不但缩短了信号达到检测阈值的时间，还可以结合高速检测设备在短时间内实现数百万液滴的分析[7, 28-29]，从而为细菌的快速检测提供了可能。液滴微流控分析技术的细菌检测原理主要包括代谢增殖、核酸扩增和单细胞分析等，液滴中信号的检测方式主要包括一维(1D)、二维(2D)和三维(3D)检测等。
2.1 检测原理 2.1.1 基于代谢增殖的检测细菌在合适的条件下代谢增殖形成菌落形成单位(colony forming unit, CFU)，可用于粗略评估其数量。但这种传统方法面临2个困难。(1) 菌落的形成往往需要培养数天，耗时较长；(2) 该方法无法检测具有活性但无法培养(viable but non-culturable, VBNC)的细菌[30]。而液滴微流控分析技术通过统计阳性液滴数进行评估，而液滴中信号的产生一般只需培养几个小时，显著缩短了检测时间。刃天青是一种代谢标记试剂，能被活细菌代谢产生的还原剂[如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FADH)]还原为具有强红色荧光的试卤灵[31]。因此，液滴中的荧光强度与细菌的存在和代谢活动密切相关，细菌代谢越活跃，产生的还原剂越多，从而使荧光信号增强。因此，荧光强度可作为细菌活性的指示指标，可用于活细菌检测。刃天青结合液滴微流控分析技术最短能在1 h内检测到荧光信号，这意味着细菌只需复制几次便能使荧光信号达到检测阈值，其检测限(limit of detection, LOD)可达50 CFU/mL，低于常规的细菌检测方法[16, 22]。但刃天青/试卤灵作为非特异性染料，仅能反映细菌的整体代谢活动，无法直接区分不同菌属[16, 22, 31-32]。要实现特异性检测，通常需要结合选择性培养基特异性分子探针或基于核酸的检测技术，这些方法可在液滴微流控系统中增强检测的专一性。对于多种细菌的同时检测，液滴微流控技术通过生成独立液滴，实现多个样本的并行处理，结合不同条件下的荧光信号表现，可以实现多菌群的检测，而进一步结合特异性方法则可区分不同菌属。除了上述还原反应外，培养过程中诸如乙醇等代谢产物，以及pH值、氧分压等的变化，也可结合荧光指示剂作为阳性信号识别的依据[33-36]。不过这类方法受细菌生长繁殖条件和时间的限制，检测时间相对较长，操作较为烦琐。
细菌增殖引起的散射光变化、渗透压变化、微波共振振幅和频率、电容(检测范围为86.5–8 650 CFU/droplet，LOD为63.66 CFU/droplet)、电阻抗、实时图像等免标记(label-free)信号也都可用于阳性液滴的识别[37-43]。Cui等[44]利用基于液滴浊度成像的数字标准板计数(digital standard plate count, dSPC)方法，在6 h内准确定量大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)样本，LOD为100 CFU/mL，计数结果与标准平板计数无显著性差异，检测耗时降至标准平板计数法的1/3。Hussain等[45]通过获取孵育过程中的散射光数据，并结合机器学习分类方法，在6 h (培养5 h，检测1 h)内完成铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的检测。另外，将日新月异的人工智能技术引入细菌检测过程中的信号处理步骤，有望消除人工判定时的主观因素并大大缩短读出时间，为实现快速检测提供了新思路。
基于代谢的检测方法虽然可实现细菌广谱检测，但在灵敏度、准确度、精密度及检测速度上仍不及荧光标记类方法。此外，另一个值得关注的问题是如何检测细菌的一个特殊形式——芽孢。其无代谢的深度休眠状态给基于代谢的快速检测技术带来了极大挑战[46]。目前较为常用的检测方式是先诱导芽孢萌发，再通过一些光学和电化学的手段监测其萌发过程[47-55]。
2.1.2 基于核酸扩增的检测液滴数字核酸扩增检测通过将样本DNA随机封装至液滴中，使每个液滴中包含或不包含一个目标分子(DNA模板)，之后将所有独立的液滴反应单元进行平行扩增后对每个液滴进行检测，通过荧光信号识别阳性液滴，最后依据泊松分布算法得出初始样本的核酸拷贝数，从而不再需标准曲线。基于液滴中核酸的扩增方法包括液滴数字化聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)与液滴数字化环介导等温扩增(droplet digital loop-mediated isothermal amplification, ddLAMP)等。
ddPCR具有检测时间短、灵敏度高等特点，在细菌检测方面已有诸多应用[56]。例如利用液滴微流控检测葡萄酒中生物胺的产生菌[57]；在2 h内同时完成污染饮用水样本中致病性大肠杆菌O157和单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的检测，LOD均低至10 CFU/mL[58]；在超过10万个正常的大肠杆菌K12细胞的高背景下，检测到罕见病原菌大肠杆菌O157:H7[59]。通过集成其他技术，还可以进一步提高ddPCR的检测速度和灵敏度。Abram等[60]集成一步式ddPCR检测与高通量3D粒子计数系统，可在1 h内以10 CFU/mL的灵敏度直接从全血样本中进行细菌检测，而不再需要血液培养或样本处理。相比之下，传统的实时PCR和ddPCR的检测限分别只能达到1 000 CFU/mL和50–100 CFU/mL。该系统被进一步证明能应用于抗生素耐药基因检测、新菌种发现和广谱细菌检测[60]。
加热循环过程在PCR中必不可少。此过程需要专门的仪器和较长的分析时间，从而限制了其在现场检测中的应用。而环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是在等温状态下对靶基因进行扩增，无须稳定的加热步骤，近年来被认为是一种有希望替代PCR的核酸检测技术[61-62]。相较于传统LAMP技术，结合了液滴的ddLAMP技术在灵敏度、检测速度和通量方面更具优势，也在多个领域的细菌检测中得到应用。如ddLAMP在用于多种食源性病原体检测时，LOD是传统LAMP方法的1/500[63]；在用于水样中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)检测时，LOD为1 000 CFU/mL，检测时间为1 h，证明了ddLAMP技术在水资源监测方面的巨大潜力[64]。ddLAMP技术也被用于牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica)的检测(靶向invA基因)，LOD为5 000 CFU/mL[61]；ddLAMP技术还可以用于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的检测，可在50 min内自动完成10个结核分枝杆菌样品的并行检测，LOD为10个细菌[65]。此外，在ddLAMP的基础上还可结合其他技术实现无标记检测。Teixeira等[66]将表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)与ddLAMP技术相结合，开发了一种基于液滴的食源性病原体检测光流体系统，该系统成功在超高温牛奶中检测到单核增生李斯特氏菌。
ddPCR和ddLAMP较传统的荧光定量PCR而言，还有一大优势是易于实现集成化，避免了传统仪器多级操作的缺点，从而降低了潜在环境污染(如气溶胶)的风险，并进一步提高了检测的准确度和精密度[67]。该技术同时减少了化学试剂和样品的消耗，提高了便携性与自动化。不过数字PCR所需的试剂和仪器都相对昂贵，在大规模使用时需考虑成本问题。
总而言之，虽然基于核酸扩增的液滴分析具有快速、高灵敏度等特点，但由于此类方法一般需要先通过裂解细菌提取细菌核酸，再采用特异性的引物探针进行PCR等扩增检测，即检测对象是核酸这类生物大分子而非细胞，因此更适合于核酸类病毒的定量检测[67]。如果要实现细菌定量检测则还需建立核酸拷贝数与细菌浓度的标准曲线。
2.1.3 基于单细胞分析检测单细胞分析是液滴微流控分析技术最大的特点和优势之一。将单个细菌细胞直接或与荧光探针共同封装在液滴中，通过酶促反应、免疫结合、核酸结合等形式产生荧光，根据荧光和/或散射光信号的改变来识别阳性液滴，实现初始样本中细菌的绝对定量。这种检测形式规避了传统检测的培养过程，显著缩短分析时间，尤其适用于较难培养的菌株，而在灵敏度和检测成本等方面也更具优势[16]。
酶是活细胞内极其重要的生物催化剂，部分酶可作为活细胞检测的生物标志物。β-葡萄糖醛酸苷酶和β-内酰胺酶是具有代表性的典型例子。β-葡萄糖醛酸苷酶荧光探针4-甲基伞形酮-β-d-葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-d- glucuronide, 4-MUG)和β-内酰胺酶荧光探针CDG-OMe结合液滴微流控可分别用于检测大肠杆菌和结核分枝杆菌，LOD均可达到10 CFU/mL[68-70]。但由于较强的特异性，使得这类探针只能检测单一类型的细菌。DNAzyme则是一种通过体外进化从随机文库中人工合成出来的具有催化活性的单链DNA寡核苷酸，能根据检测目标选择合成对应的DNAzyme，达到灵活检测的目的，在病原菌检测与疾病诊断方面有诸多应用[71-72]。Rauf等[73]设计了一种包含DNAzyme传感器、液滴微流控芯片与计算机视觉功能的大肠杆菌计数器；该DNAzyme传感器是包含了2个寡核苷酸FS1和EC1T的反作用DNAzyme探针，其中FS1寡核苷酸功能化了荧光团和淬灭剂；他们先将大肠杆菌加温破裂，使EC1T与原生胞内物质中的特定靶向物绑定；于是FS1在EC1T的催化下裂解，荧光团产生荧光信号；此方法对大肠杆菌的检测具有很高的特异性。Liu等[74]设计了一种用于检测病原细菌的类钩形DNAzyme活化的自催化生物传感器，这种创新方法巧妙地将识别元素DNAzyme与等温、无酶自催化的杂交链式反应和催化发夹自组装相结合，以实现强大的信号放大，该生物传感器在1.5×103−3.7×107 CFU/mL范围内对细菌表现出良好的线性响应，并且检测限达到了1.3×103 CFU/mL。另外，这种通用检测平台仅需对钩状连接器模块进行修改，即可识别包括大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)在内的各种病原细菌。DNAzyme技术的应用已经得到全面提升，在推动病原细菌检测和公共卫生监测方面具有巨大潜力。
液滴技术可以与免疫反应结合，应用于细菌检测。例如，Brian等[75]将荧光标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体与鼠伤寒沙门氏菌共同包裹到液滴中进行培养，荧光标记的抗体与细菌结合，使细菌表面的荧光强度增加；随着细菌的增殖，荧光信号进一步增强，通过成像检测，实现了无须清洗的检测方法；该方法的检测时间小于5 h，并且具有100%的特异性。Golberg等[76]和Schemberg等[77]则利用免疫磁珠复合物直接捕获样本中的细菌以实现浓缩，从而提高液滴包裹效率并减少液滴生成所需的时间；具体来说，首先通过抗体功能化的磁珠与样本中的细菌结合，达到捕获目的；然后基于磁分离技术去除残余溶液进行浓缩，接着将磁珠与荧光标记的抗体共同包裹到液滴中进行孵育，最后进行成像检测。此外，Chen等[78]利用液滴微流控系统将生成的海藻酸钠液滴引入含抗体和氯化钙的缓冲盐溶液中，在钙离子与海藻酸的酸基交联过程中，抗体被固定在海藻酸盐微球的多孔网络上，从而制备了抗体功能化的海藻酸盐微球；接着，将微球加入含有预先荧光标记细菌的溶液中进行特异性结合实验；结果表明，海藻酸钠微球的高比表面积提高了检测灵敏度。然而，类似于酶促反应，免疫结合的高特异性限制了检测方法的通用性，并且检测成本较高。因此，将酶促反应与免疫结合的液滴微流控分析技术更适用于特定致病菌或病原体的检测。
16S rRNA基因存在于所有细菌的基因组中，常作为细菌多样性分析的标准。Guan等[79]通过RNA探针-磁珠复合物识别细菌的16S rRNA基因，结合液滴微流控技术，无须逆转录和PCR扩增过程即可实现细菌的绝对定量检测；具体来说，他们首先让目标RNA与连接到磁珠上的DNA捕获探针杂交，然后再与酶标记的单链DNA检测探针杂交，为去除未结合的检测探针，每次杂交后都需对磁珠进行洗涤；带有杂交复合物的磁珠随后被封装到大量液滴中，与酶底物混合、孵育，并在单个集成微流控芯片中直接检测，从而实现了简便的数字检测，无须在仪器之间转移物料。相较于传统核酸探针，肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)等修饰核酸杂交更快、稳定性更好，结合液滴微流控能更快检测到病原体的16S rRNA[80]。Hsieh等[81]利用液滴微流控分析技术，结合荧光PNA探针进行了病原体鉴定和抗生素敏感性测试，该探针可识别近90%的尿路病原体，在30 min内完成最低处理尿液样本的尿路感染诊断，这是迄今为止最快的尿路感染诊断方法。相较于单链PNA探针，双链PNA (double stranded peptide nucleic acid, dsPNA)探针具有更高的荧光信号和更好的灵敏度与特异性。因为在单链情况下，探针通常为发卡结构或分子信标结构，未结合目标RNA时，探针的一端具有相邻的荧光团和淬灭剂，使荧光被淬灭；当与目标RNA结合后，发卡结构被打开，荧光团和淬灭剂之间的距离增加，导致荧光信号强度变化。而在双链情况下，探针由一条长链和一条短链杂交形成双链结构，未结合目标RNA时，荧光团和淬灭剂也相邻，荧光被淬灭；在目标RNA存在时，长链与目标RNA结合，短链被置换，导致荧光团与淬灭剂分离，显著增强荧光信号。此外，双链PNA探针因其形成的稳定杂交结构，具有更高的稳定性和亲和力，从而提供更高的灵敏度和特异性。Mach等[82]设计了一组dsPNA探针，结合液滴微流控技术实现了多种致病细菌[包括真细菌、肠杆菌科细菌和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)]的检测。不依赖于核酸扩增的核酸探针结合液滴微流控分析技术的分析方法具有高特异性、高灵敏性和检测速度快的特点，在细菌快速检测中有较好的应用前景。
单细胞拉曼光谱能反映细胞的复杂性质，包括基因表达、细胞组成、特征结构和代谢状态等[83-86]。而液滴的连续运动使液滴成分均匀混合，从而解决了颗粒不均匀分布而导致的SERS信号不均匀的问题[87]。将拉曼光谱与液滴微流控技术结合，可用于快速、无损、免标记的单细胞表征和鉴定。Lu等[88]将液滴微流控分析技术与SERS结合用于快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，在3.5 h内收集了58个金黄色葡萄球菌分离菌株的17 400个SERS光谱。但该方法的检测速度较低(约1.4 droplets/s)，通过基于磁珠的目标物富集可降低样本体积，进而缩短检测时间[89]。目前利用表面增强共振拉曼光谱(surface-enhanced resonance Raman spectroscopy, SERRS)能获得单个液滴的50多个光谱，获得单个光谱的时间缩至20 ms[90]。基于Surface-enhanced raman spectroscopy (SERS)的液滴微流体系统具有高灵敏度的优势，适用于细菌菌种的鉴定。
总体而言，液滴微流控分析技术与传统快速检测技术相比，检测速度更快，准确度、精密度和灵敏度更高。根据泊松分布原理，可实现每个液滴中至多包含1个细胞，具备绝对定量的能力。不同的检测手段各有利弊，由于实际菌种的复杂多样性，各种方法都有待进一步优化，在不同的研究背景下，可以选择不同的检测手段来达到研究目的(表 1)。简而言之，荧光标记类方法的信号强度高、具有较高的特异性与灵敏性，但通用性较差，通常只能检测对应的1种或几种细菌；免标记类方法虽然具有一定通用性，但信号强度较弱，检测时间较长或需长时间的培养过程。因此，一种细菌通用快速标记方法的开发是实现细菌快速检测的关键。肽聚糖存在于所有细菌的细胞壁中，是理想的通用性靶点。Hudak等[93]利用化学标记方法实现了对小鼠肠道微生物细胞壁的标记，但这种方法需要清洗，并不适合液滴微流控分析技术。若能实现免清洗标记，有望能解决该问题。此外，家蚕幼虫血浆(silkworm larvae plasma, SLP)也能在肽聚糖的作用下诱导生成黑色素，用于检测细菌[94]。虽然有研究表明黑色素的产生与细菌数量无明确相关性，但结合液滴微流控分析技术单细胞分析的特点，有望实现对广谱细菌的绝对定量[95]。
| 原理 Principle |
方法 Method |
检测时间 Detection time |
检测对象 Target |
检测限 Limit of detection (CFU/mL) |
特异性 Specificity |
优点 Advantage |
缺点 Disadvantage |
| 代谢活动 Metabolic activity |
刃天青 Resazurin |
1−5 h | Salmonella enterica [16]; Escherichia coli[22]; E. coli, Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis[32] | 50 | + | 通用性较佳，灵敏、精确 Generally applicable, sensitive, precision |
孵育时间较长、泄漏，仅限于特定的工程化菌种 Long incubation, leakage, limited to the specifically engineered strains |
| β-内酰胺酶荧光探针CDG-OMe Carbapenemase degradation-omethyl ester (CDG-OMe) |
未报道 Not reported |
Mycobacterium Smegmatis[68] | 10 | +++++ | |||
| 4-甲基伞形酮-β-d- 葡糖苷酸 (4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide, 4-MUG) |
未报道 Not reported |
E. coli[69] | 10 | ++++ | |||
| DNAzyme | 1.5−4.0 h | E. coli[91] | 1 | +++++ | |||
| 免疫结合 Immunobinding |
免疫磁珠 Immunology magnetic beads |
5−8 h | Salmonella enterica [75], E. coli[76] |
未报道 Not reported |
+++++ | 灵敏、精确 Sensitive, precision |
昂贵、仅限于特定的工程化菌种 Expensive, limited to the specifically engineered strains |
| 核酸扩增 Nucleic acid amplification |
PCR | 1−2 h | E. coli O157 and Listeria monocytogenes[58]; E. coli, Klebsiella spp. and pan-bacteria[60] |
10 | ++++ | 快速、灵敏 Rapid, sensitive |
半定量 Semiquantitative |
| 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) | 50 min−1 h | E. faecalis[64], Salmonella enterica [61], Mycobacterium tuberculosis[65] |
10−5 000 | ++++ | |||
| 核酸结合 Nucleic acid binding |
肽核酸 (peptide nucleic acid, PNA) |
30 min | E. coli[81] | 未报道 Not reported |
++++ | 快速、灵敏、精确 Rapid, sensitive, precision |
仅限于特定的工程化菌种 Limited to the specifically engineered strains |
| 免标记 Label-free |
光散射 Light-scattering |
1−6 h | E. coli[92], E. coli and Bacillus subtilis[44], Pseudomonas aeruginosa[45] |
100 | + | 通用性较佳Generally applicable | 信号强度较弱、孵育时间较长 Weak signal, long incubation |
| “+”表示特异性的程度，特异性越高，数量越多。 The number of “+” signs denotes the level of specificity, the more “+” signs, the higher the specificity. |
|||||||
液滴检测时的检测方式与通量也是影响细菌快速检测的重要因素。现有检测方法绝大多数依赖于光学检测，根据光学检测时液滴的排布方式可将检测方法分为1D、2D和3D检测(图 3)。
|
| 图 3 常见的光学检测示意图 Figure 3 Schematic diagram of common optical detection. |
|
|
在1D检测方式中，液滴逐一通过检测区，呈线性排布，该检测过程为连续过程，检测通量较小，一次只能检测单个液滴，其检测速度与流速、信号捕获效率相关。为了提高检测的灵敏度，可将检测区流道变窄，使得液滴在经过检测区时变为扁球形，以增加单个液滴的曝光时间[22, 68, 81-82]。虽然1D检测具有较高的准确度，但其流量相对较小，检测耗时也相对较长。对于2D检测方式，需先将生成的液滴富集至检测区，再进行信号检测，最后根据泊松分布原理计算出初始浓度。该类检测方法多用于PCR与LAMP中，为防止多层液滴对检测结果的影响，检测区的液滴需要以单层、同一平面排布。此要求可以通过通道尺寸设计或借助液滴密度来实现[96]。该检测方式多结合图像处理软件进行分析，具有方便快捷的特点，但由于只是检测部分液滴，因此准确度和精密度较低[16, 44, 58]。3D检测方式实际上是一种3D粒子计数器，能在几分钟内从毫升体积样本中检测出单个荧光粒子。具体而言，液滴被包含在一个封闭的圆柱形试管中，试管可以水平旋转和垂直平移来满足扫描计数要求，扫描计数基于模式识别(而非荧光强度)。该方法可完成大体积样本的检测，检测通量高(约0.1 mL/min)，大约每秒能检测10万个液滴[91]。这3种检测方式各有利弊，而3D检测方式有较好的临床应用前景(表 2)。
| Item | 方法 Method |
检测速度 Detection speed (Hz) |
检测限 Limit of detection (CFU/mL) |
精度 Accuracy |
检测对象 Detection object |
| 1D | 刃天青Resazurin[22] | 1 000 | 50 | +++++ | 所有液滴 All droplets |
| CDG-OMe[68] | 10 | ||||
| LAMP[65] | 10 | ||||
| 2D | 刃天青Resazurin[16] | 10 000 | 50 | +++ | 部分液滴 Partial droplets |
| PCR[58] | 10 | ||||
| LAMP[61, 63-64] | 1 000 | ||||
| 光散射Light-scattering[44] | 100 | ||||
| 3D | DNAzyme[91] | 100 000 | 1 | +++++ | 所有液滴 All droplets |
| PCR[60] | 10 | ||||
| “+”表示精密的程度，精度越高，数量越多。 The number of “+” signs denotes the level of accuracy, the more “+” signs, the higher the accuracy. |
|||||
随着食品、药品、环境安全和临床检验领域的飞速发展，传统技术已无法满足细菌快速检测的需求。液滴微流控分析技术虽然已在细菌快速检测中展现出了巨大的潜力，但未来仍需解决或优化4个主要问题：(1) 突破待测样本量的限制。临床样本体积多为毫升级，对于样本输入量在微升级的液滴微流控分析体系来说是一个巨大的挑战。(2) 信号检测的及时性与精准性仍需进一步提高。(3) 需要寻找新的细菌通用的特异性标记/免标记方法，在简单样本前处理甚至无需样本前处理的条件下实现细菌的快速标记[97]。(4) 将检测系统集成，使之便捷化、可携带，最终商业化。
前2个问题属于工程学范畴，一个解决问题的思路是预先刨除确定不含细菌的那部分流体，不但可以减少待测流体的量，而且可以使含菌流体中的菌浓度升高，增强检测信号。因此，一个较为可行的方法是在检测前将细菌进行局部富集。而专门用于操控电中性生物颗粒的介电电泳(dielectrophoresis, DEP)技术则是一个有效的工具[98-102]。例如，可以先用合适场强、频率的DEP对待测流体进行预处理，在电极附近将细菌俘获[103]，再用合适的液滴形成法形成液滴，这样可以显著降低空液滴的比例。除了DEP外，其他例如免疫磁珠俘获等技术也都可以达到类似效果[104]。第3个问题则更偏向于理学范畴，如何寻找新的生物标识物进行检测则是基础研究人员需要积极思考的问题。至于最后一个问题，则需要来自公共卫生、微生物、微加工、电子信息及科研成果/专利产业化等领域的专家学者们通力合作、共同探讨[105-106]。
除此之外，在液滴生成和检测技术方面，引入数字微流控(digital microfluidics, DMF)技术也不失为一种可行的方法[107-108]。液滴微流控与传统的连续流体微流控(continuous-flow microfluidics)均属于管道式微流控，而数字微流控则是利用静电力驱动离散的液滴。因为离散的液滴只能停留在特定的位置上(即驱动电极的上方)，换言之在每个特定位置上液滴只存在“有”或“无” 2种状态(对应“1”或“0”)，因而得其“数字(digital)”之名。DMF具有液滴运输、分割、合并等功能，双极板结构DMF还具有液滴生成的功能。如果将DEP技术与液滴分割技术合用，先用DEP使细菌在液滴一侧附近，再将液滴分割，即可实现细菌浓度的翻倍[109]。在这之后可以联用干式被动分配与湿式被动分配技术，使菌含量扩增，实现片上孵育[110-111]。最后使用合适的光学或电化学检测方法，即可显著提高信号强度(图 4)。但是DMF芯片加工相对复杂，目前基于DMF的微生物研究工作尚不多见，可能是未来发展的一个新方向[112-118]。
|
| 图 4 干式被动分配与湿式被动分配示意图 Figure 4 Schematic diagram of dry passive dispersion and wet passive dispersion. A: Drive the droplet a containing bacteria to the hydrophobic site; B: Pause the droplet at the hydrophobic site (a pair of sensing electrodes) for a period of time; C: Drive droplet a away from the hydrophobic site, leaving a small droplet b, in which the bacteria attach to the surface of the hydrophobic site; D: Drive the culture medium droplet c to the hydrophobic site; E: Pause droplet c at the hydrophobic point for a period of time, allowing the culture medium in droplet c to fully mix with the water in small droplet b; F: Drive droplet c away from the hydrophobic site, and the solution in small droplet b is largely replaced by the culture medium in droplet c, allowing bacteria to grow and proliferate, thus achieving the incubation process and signal strength amplification. Steps A–C are termed as dry passive dispersion, and steps D–F are termed as wet passive dispersion. Since the surface of the sensing electrodes on the chip is not covered by a hydrophobic layer, a local hydrophilic site is therefore formed, which can be used both for bacteria attachment and electrochemical detection. A：将含菌液滴a驱动至疏水点；B：在疏水点(一对传感电极)停留一段时间；C：将液滴a驱动离开疏水点，留下小液滴b，其内的细菌附于疏水点表面；D：将培养液液滴c驱动至疏水处；E：在疏水处停留一段时间，待液滴c中的培养液与小液滴b中的水充分混合；F：将液滴c驱动离开疏水点，小液滴b中的水溶液基本被液滴c中的培养液所替换，细菌繁殖扩增，实现孵育过程，信号强度扩增。A−C为干式被动分配，D−F为湿式被动分配。因芯片上的传感电极表面无疏水层覆盖，可形成局部亲水处，既可用于细菌的附着，也可用于电化学检测。 |
|
|
我们相信液滴微流控分析技术的不断完善与发展将为水环境监测、食品安全检测、制药微生物风险控制、细胞基因药物无菌检测、临床医学微生物检验等多个领域的研究与应用带来新的希望。
作者贡献声明
黄子鸣、刘明、周露萍：文献查阅，论文初稿撰写；吴文捷：文献查阅，论文指导与修改。
作者利益冲突公开声明
作者声明绝无任何可能会影响本文所报告工作的已知经济利益或个人关系。
| [1] |
ADAMS MR, McCLURE PJ, MOSS MO. Food Microbiology[M]. 5th edition. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2024.
|
| [2] |
REINEKE W, SCHLÖMANN M. Environmental Microbiology[M]. 3rd ed. Berlin: Springer, 2017.
|
| [3] |
MURRAY PR, ROSENTHAL KS, PFALLER MA. Murray's Basic Medical Microbiology: Foundations and Clinical Cases[M]. 2nd edition. Philadelphia: Elsevier, 2023.
|
| [4] |
National Medical Products Administration. Good Manufacturing Practice for Drugs - Appendix for Cell Therapy Products (Draft for Comments)[EB/OL]. (2022-01-06) [2023-04-29]. https://www.nmpa.gov.cn/directory/web/nmpa/images/1641459325244001478.docx (in Chinese). 国家药品监督管理局. 药品生产质量管理规范-细胞治疗产品附录(征求意见稿)[EB/OL]. (2022-01-06) [2023-04-29]. https://www.nmpa.gov.cn/directory/web/nmpa/images/1641459325244001478.docx. |
| [5] |
Ministry of Ecology and Environment of the Peopleʼs Republic of China. Announcement on the Release of Five National Environmental Protection Standards, including "Water Quality - Determination of Fecal Coliform Bacteria by Membrane Filtration"[EB/OL]. (2018-12-27) [2023-04-29]. https://www.mee.gov.cn/xxgk2018/xxgk/xxgk01/201901/t20190102_688215.html (in Chinese). 中华人民共和国生态环境部. 关于发布《水质粪大肠菌群的测定滤膜法》等五项国家环境保护标准的公告[EB/OL]. (2018-12-27) [2023-04-29]. https://www.mee.gov.cn/xxgk2018/xxgk/xxgk01/201901/t20190102_688215.html. |
| [6] |
CHEN ZK, KHEIRI S, YOUNG EWK, KUMACHEVA E. Trends in droplet microfluidics: from droplet generation to biomedical applications[J]. Langmuir, 2022, 38(20): 6233-6248. DOI:10.1021/acs.langmuir.2c00491 |
| [7] |
JIANG ZQ, SHI HR, TANG XY, QIN JL. Recent advances in droplet microfluidics for single-cell analysis[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2023, 159: 116932. DOI:10.1016/j.trac.2023.116932 |
| [8] |
HE ZY, WU H, YAN XH, LIU W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology[J]. Chinese Chemical Letters, 2022, 33(4): 1729-1742. DOI:10.1016/j.cclet.2021.08.059 |
| [9] |
MATUŁA K, RIVELLO F, HUCK WTS. Single-cell analysis using droplet microfluidics[J]. Advanced Biosystems, 2020, 4(1): e1900188. DOI:10.1002/adbi.201900188 |
| [10] |
SCHROEN K, BERTON-CARABIN C, RENARD D, MARQUIS M, BOIRE A, COCHEREAU R, AMINE C, MARZE S. Droplet microfluidics for food and nutrition applications[J]. Micromachines, 2021, 12(8): 863. DOI:10.3390/mi12080863 |
| [11] |
HE HY, HUANG EQ, LI ZJ, SHU BW, XU BL, LIU DY. Droplet digital microfluidic assay for rapid bacterium quantitation[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2020, 48(7): 855-862. (in Chinese) 何浩延, 黄恩奇, 黎柱均, 舒博文, 徐邦牢, 刘大渔. 微流控芯片液滴数字化分析用于快速定量检测细菌[J]. 分析化学, 2020, 48(7): 855-862. |
| [12] |
HE MY, SCOTT EDGAR J, JEFFRIES GDM, LORENZ RM, PATRICK SHELBY J, CHIU DT. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets[J]. Analytical Chemistry, 2005, 77(6): 1539-1544. DOI:10.1021/ac0480850 |
| [13] |
WANG J, DU L, HAN YW, ZHANG DW, JING DL. Advancing in situ single-cell microbiological analysis through a microwell droplet array with a gradual open sidewall[J]. Lab on a Chip, 2023, 23(24): 5165-5172. DOI:10.1039/D3LC00590A |
| [14] |
XU JG, HUANG MS, WANG HF, FANG Q. Forming a large-scale droplet array in a microcage array chip for high-throughput screening[J]. Analytical Chemistry, 2019, 91(16): 10757-10763. DOI:10.1021/acs.analchem.9b02288 |
| [15] |
HAN WB, CHEN XY. A review on microdroplet generation in microfluidics[J]. Journal of the Brazilian Society of Mechanical Sciences and Engineering, 2021, 43(5): 247. DOI:10.1007/s40430-021-02971-0 |
| [16] |
AN XS, ZUO P, YE BC. A single cell droplet microfluidic system for quantitative determination of food-borne pathogens[J]. Talanta, 2020, 209: 120571. DOI:10.1016/j.talanta.2019.120571 |
| [17] |
NAWAR S, STOLAROFF JK, YE CW, WU HY, NGUYEN DT, XIN F, WEITZ DA. Parallelizable microfluidic dropmakers with multilayer geometry for the generation of double emulsions[J]. Lab on a Chip, 2020, 20(1): 147-154. DOI:10.1039/C9LC00966C |
| [18] |
SHI Z, LAI XC, SUN CT, ZHANG XG, ZHANG L, PU ZH, WANG RD, YU HX, LI DC. Step emulsification in microfluidic droplet generation: mechanisms and structures[J]. Chemical Communications, 2020, 56(64): 9056-9066. DOI:10.1039/D0CC03628E |
| [19] |
GELIN P, BIHI I, ZIEMECKA I, THIENPONT B, CHRISTIAENS J, HELLEMANS K, MAES D, de MALSCHE W. Microfluidic device for high-throughput production of monodisperse droplets[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2020, 59(28): 12784-12791. |
| [20] |
LIU WW, ZHU Y. "Development and application of analytical detection techniques for droplet-based microfluidics": a review[J]. Analytica Chimica Acta, 2020, 1113: 66-84. DOI:10.1016/j.aca.2020.03.011 |
| [21] |
KAUSHIK AM, HSIEH K, WANG TH. Droplet microfluidics for high-sensitivity and high-throughput detection and screening of disease biomarkers[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology, 2018, 10(6): e1522. DOI:10.1002/wnan.1522 |
| [22] |
KAUSHIK AM, HSIEH K, CHEN LB, SHIN DJ, LIAO JC, WANG TH. Accelerating bacterial growth detection and antimicrobial susceptibility assessment in integrated picoliter droplet platform[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 97: 260-266. DOI:10.1016/j.bios.2017.06.006 |
| [23] |
LASHKARIPOUR A, RODRIGUEZ C, ORTIZ L, DENSMORE D. Performance tuning of microfluidic flow-focusing droplet generators[J]. Lab on a Chip, 2019, 19(6): 1041-1053. DOI:10.1039/C8LC01253A |
| [24] |
ROSENFELD L, LIN T, DERDA R, TANG SKY. Review and analysis of performance metrics of droplet microfluidics systems[J]. Microfluidics and Nanofluidics, 2014, 16(5): 921-939. DOI:10.1007/s10404-013-1310-x |
| [25] |
KREUTZ JE, LI L, SPENCER ROACH L, HATAKEYAMA T, ISMAGILOV RF. Laterally mobile, functionalized self-assembled monolayers at the fluorous-aqueous interface in a plug-based microfluidic system: characterization and testing with membrane protein crystallization[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(17): 6042-6043. DOI:10.1021/ja808697e |
| [26] |
LICHTENBERG JY, LING Y, KIM S. Non-specific adsorption reduction methods in biosensing[J]. Sensors, 2019, 19(11): 2488. DOI:10.3390/s19112488 |
| [27] |
RASHID S, WARD-BOND J, KRUPIN O, BERINI P. Non-specific adsorption of protein to microfluidic materials[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2021, 208: 112138. DOI:10.1016/j.colsurfb.2021.112138 |
| [28] |
NING RZ, FAN JH, KONG L, JIANG X, QIAN Y, DU T, ZHANG GJ, WU WW. Recent developments of droplets-based microfluidics for bacterial analysis[J]. Chinese Chemical Letters, 2022, 33(5): 2243-2252. DOI:10.1016/j.cclet.2021.08.096 |
| [29] |
HENGOJU S, TOVAR M, MAN DKW, BUCHHEIM S, ROSENBAUM MA. Droplet microfluidics for microbial biotechnology[M]//Microfluidics in Biotechnology. Cham: Springer International Publishing, 2020: 129-157.
|
| [30] |
DONG K, PAN HX, YANG D, RAO L, ZHAO L, WANG YT, LIAO XJ. Induction, detection, formation, and resuscitation of viable but non-culturable state microorganisms[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2020, 19(1): 149-183. DOI:10.1111/1541-4337.12513 |
| [31] |
CHEN JL, STEELE TWJ, STUCKEY DC. Metabolic reduction of resazurin; location within the cell for cytotoxicity assays[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2018, 115(2): 351-358. DOI:10.1002/bit.26475 |
| [32] |
KAO YT, KAMINSKI TS, POSTEK W, GUZOWSKI J, MAKUCH K, RUSZCZAK A, von STETTEN F, ZENGERLE R, GARSTECKI P. Gravity-driven microfluidic assay for digital enumeration of bacteria and for antibiotic susceptibility testing[J]. Lab on a Chip, 2020, 20(1): 54-63. DOI:10.1039/C9LC00684B |
| [33] |
ABALDE-CELA S, GOULD A, LIU X, KAZAMIA E, SMITH AG, ABELL C. High-throughput detection of ethanol-producing cyanobacteria in a microdroplet platform[J]. Journal of the Royal Society, Interface, 2015, 12(106): 20150216. DOI:10.1098/rsif.2015.0216 |
| [34] |
FUNFAK A, HARTUNG R, CAO JL, MARTIN K, WIESMÜLLER KH, WOLFBEIS OS, KÖHLER JM. Highly resolved dose-response functions for drug-modulated bacteria cultivation obtained by fluorometric and photometric flow-through sensing in microsegmented flow[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2009, 142(1): 66-72. DOI:10.1016/j.snb.2009.07.017 |
| [35] |
FUNFAK A, CAO JL, WOLFBEIS OS, MARTIN K, KÖHLER JM. Monitoring cell cultivation in microfluidic segments by optical pH sensing with a micro flow-through fluorometer using dye-doped polymer particles[J]. Microchimica Acta, 2009, 164(3): 279-286. |
| [36] |
CAO JL, NAGL S, KOTHE E, KÖHLER JM. Oxygen sensor nanoparticles for monitoring bacterial growth and characterization of dose-response functions in microfluidic screenings[J]. Microchimica Acta, 2015, 182(1): 385-394. |
| [37] |
POSTEK W, GARSTECKI P. Droplet microfluidics for high-throughput analysis of antibiotic susceptibility in bacterial cells and populations[J]. Accounts of Chemical Research, 2022, 55(5): 605-615. DOI:10.1021/acs.accounts.1c00729 |
| [38] |
PACOCHA N, BOGUSŁAWSKI J, HORKA M, MAKUCH K, LIŻEWSKI K, WOJTKOWSKI M, GARSTECKI P. High-throughput monitoring of bacterial cell density in nanoliter droplets: label-free detection of unmodified gram-positive and gram-negative bacteria[J]. Analytical Chemistry, 2021, 93(2): 843-850. DOI:10.1021/acs.analchem.0c03408 |
| [39] |
HOFMANN TW, HÄNSELMANN S, JANIESCH JW, RADEMACHER A, BÖHM CHJ. Applying microdroplets as sensors for label-free detection of chemical reactions[J]. Lab on a Chip, 2012, 12(5): 916-922. DOI:10.1039/c2lc20971c |
| [40] |
NARANG R, MOHAMMADI S, ASHANI MM, SADABADI H, HEJAZI H, ZARIFI MH, SANATI-NEZHAD A. Sensitive, real-time and non-intrusive detection of concentration and growth of pathogenic bacteria using microfluidic-microwave ring resonator biosensor[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 15807. DOI:10.1038/s41598-018-34001-w |
| [41] |
DUARTE LC, FIGUEREDO F, RIBEIRO LEB, CORTÓN E, COLTRO WKT. Label-free counting of Escherichia coli cells in nanoliter droplets using 3D printed microfluidic devices with integrated contactless conductivity detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2019, 1071: 36-43. DOI:10.1016/j.aca.2019.04.045 |
| [42] |
CAO JL, PLIQUETT U, YANG L, WIEDEMEIER S, CAHILL B, MICHAEL KÖHLER J. Contactless optical and impedimetric sensing for droplet-based dose-response investigations of microorganisms[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022, 372: 132688. DOI:10.1016/j.snb.2022.132688 |
| [43] |
ZANG E, BRANDES S, TOVAR M, MARTIN K, MECH F, HORBERT P, HENKEL T, FIGGE MT, ROTH M. Real-time image processing for label-free enrichment of Actinobacteria cultivated in picolitre droplets[J]. Lab on a Chip, 2013, 13(18): 3707-3713. DOI:10.1039/c3lc50572c |
| [44] |
CUI XN, REN LH, SHAN YF, WANG XX, YANG ZL, LI CY, XU J, MA B. Smartphone-based rapid quantification of viable bacteria by single-cell microdroplet turbidity imaging[J]. The Analyst, 2018, 143(14): 3309-3316. DOI:10.1039/C8AN00456K |
| [45] |
HUSSAIN M, ZOU J, LIU XL, CHEN RG, TANG SM, HUANG ZL, ZHUANG JL, ZHANG LJ, TANG YJ. Pseudomonas aeruginosa detection based on droplets incubation using an integrated microfluidic chip, laser spectroscopy, and machine learning[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2023, 288: 122206. DOI:10.1016/j.saa.2022.122206 |
| [46] |
CHRISTIE G, SETLOW P. Bacillus spore germination: Knowns, unknowns and what we need to learn[J]. Cellular Signalling, 2020, 74: 109729. DOI:10.1016/j.cellsig.2020.109729 |
| [47] |
LIU SL, WU WJ, YUNG PT. Effect of sonic stimulation on Bacillus endospore germination[J]. FEMS Microbiology Letters, 2016, 363(1): fnv217. DOI:10.1093/femsle/fnv217 |
| [48] |
WU WJ, LIU SL, YUNG PT. Realization of conductometry on a digital microfluidic platform for real-time monitoring of Bacillus atrophaeus endospore germination[J]. IEEE Sensors Journal, 2016, 16(8): 2244-2250. DOI:10.1109/JSEN.2016.2521411 |
| [49] |
WU WJ, LIU SL, YUNG PT. Effect of static magnetic field on endospore germination[J]. Bioelectromagnetics, 2017, 38(2): 121-127. DOI:10.1002/bem.22017 |
| [50] |
CHANG J, WU W J. Effect of deuterium oxide on Bacillus atrophaeus spore germination[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2021, 48(10): 1196-1203. |
| [51] |
WU WJ, CHANG JH. Inactivation of vegetative cells, germinated spores, and dormant spores of Bacillus atrophaeus by pulsed electric field with fixed energy input[J]. Journal of Food Process Engineering, 2022, 45(2): e13959. DOI:10.1111/jfpe.13959 |
| [52] |
QIU X, CHANG JH, JIN Y, WU WJ. Pulsed electric field treatments with nonlethal field strength alter the properties of bacterial spores[J]. Journal of Food Protection, 2022, 85(7): 1053-1060. DOI:10.4315/JFP-21-447 |
| [53] |
WU WJ, CHANG JH. Effect of oxygen on the germination and culturability of Bacillus atrophaeus spores[J]. International Microbiology, 2022, 25(2): 353-363. DOI:10.1007/s10123-021-00229-2 |
| [54] |
AWASTI N, ANAND S. A fluorescence spectroscopic method for rapid detection of bacterial endospores: Proof of concept[J]. JDS Communications, 2022, 3(2): 97-100. DOI:10.3168/jdsc.2021-0170 |
| [55] |
ZHAO FY, HE SB, HUANG JJ, XUE CF, DENG MF, NIU Q, YAN XM. Bacillus detection and analysis based on nano-flow cytometry detection technology. Proceedings of the 11th National Conference on Chemical Biology[C]. Guangzhou, 2019 (in Chinese). 赵凡毓, 何盛斌, 黄晶晶, 薛乘风, 邓敏芳, 牛倩, 颜晓梅. 基于纳米流式检测技术的芽孢检测和分析. 第十一届全国化学生物学学术会议论文集[C]. 广州, 2019. |
| [56] |
XU DF, ZHANG WF, LI HM, LI N, LIN JM. Advances in droplet digital polymerase chain reaction on microfluidic chips[J]. Lab on a Chip, 2023, 23(5): 1258-1278. DOI:10.1039/D2LC00814A |
| [57] |
SCIANCALEPORE AG, MELE E, ARCADIO V, REDDAVIDE F, GRIECO F, SPANO G, LUCAS P, MITA G, PISIGNANO D. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines[J]. Food Microbiology, 2013, 35(1): 10-14. DOI:10.1016/j.fm.2013.02.010 |
| [58] |
BIAN XJ, JING FX, LI G, FAN XY, JIA CP, ZHOU HB, JIN QH, ZHAO JL. A microfluidic droplet digital PCR for simultaneous detection of pathogenic Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 74: 770-777. DOI:10.1016/j.bios.2015.07.016 |
| [59] |
ZHU Z, ZHANG WH, LENG XF, ZHANG MX, GUAN ZC, LU JQ, YANG CJ. Highly sensitive and quantitative detection of rare pathogens through agarose droplet microfluidic emulsion PCR at the single-cell level[J]. Lab on a Chip, 2012, 12(20): 3907-3913. DOI:10.1039/c2lc40461c |
| [60] |
ABRAM TJ, CHERUKURY H, OU CY, VU T, TOLEDANO M, LI YY, GRUNWALD JT, TOOSKY MN, TIFREA DF, SLEPENKIN A, CHONG J, KONG LS, del POZO DV, LA KT, LABANIEH L, ZIMAK J, SHEN B, HUANG SS, GRATTON E, PETERSON EM, et al. Rapid bacterial detection and antibiotic susceptibility testing in whole blood using one-step, high throughput blood digital PCR[J]. Lab on a Chip, 2020, 20(3): 477-489. DOI:10.1039/C9LC01212E |
| [61] |
AZIZI M, ZAFERANI M, CHEONG SH, ABBASPOURRAD A. Pathogenic bacteria detection using RNA-based loop-mediated isothermal- amplification-assisted nucleic acid amplification via droplet microfluidics[J]. ACS Sensors, 2019, 4(4): 841-848. DOI:10.1021/acssensors.8b01206 |
| [62] |
YUAN H, TIAN JX, CHAO YC, CHIEN YS, LUO RH, GUO JY, LI SS, CHOU YJ, SHUM HC, CHEN CF. Hand-powered microfluidics for parallel droplet digital loop-mediated isothermal amplification assays[J]. ACS Sensors, 2021, 6(8): 2868-2874. DOI:10.1021/acssensors.1c00184 |
| [63] |
YUAN H, CHAO YC, LI SS, TANG MYH, HUANG Y, CHE Y, WONG AST, ZHANG T, SHUM HC. Picoinjection-enabled multitarget loop-mediated isothermal amplification for detection of foodborne pathogens[J]. Analytical Chemistry, 2018, 90(22): 13173-13177. DOI:10.1021/acs.analchem.8b03673 |
| [64] |
GOWDA HN, KIDO H, WU XY, SHOVAL O, LEE A, LORENZANA A, MADOU M, HOFFMANN M, JIANG SC. Development of a proof-of-concept microfluidic portable pathogen analysis system for water quality monitoring[J]. Science of the Total Environment, 2022, 813: 152556. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.152556 |
| [65] |
LIU DY, LIANG GT, ZHANG Q, CHEN B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(9): 4698-4704. DOI:10.1021/ac400412m |
| [66] |
TEIXEIRA A, PARIS JL, ROUMANI F, DIÉGUEZ L, PRADO M, ESPIÑA B, ABALDE-CELA S, GARRIDO-MAESTU A, RODRIGUEZ-LORENZO L. Multifuntional gold nanoparticles for the SERS detection of pathogens combined with a LAMP-in-microdroplets approach[J]. Materials, 2020, 13(8): 1934. DOI:10.3390/ma13081934 |
| [67] |
JIANG YY, MANZ A, WU WM. Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification[J]. Analytica Chimica Acta, 2020, 1125: 50-56. DOI:10.1016/j.aca.2020.05.044 |
| [68] |
LYU FJ, XU MQ, CHENG YF, XIE JH, RAO JH, TANG SKY. Quantitative detection of cells expressing BlaC using droplet-based microfluidics for use in the diagnosis of tuberculosis[J]. Biomicrofluidics, 2015, 9(4): 044120. DOI:10.1063/1.4928879 |
| [69] |
BYRNES SA, PHILLIPS EA, HUYNH T, WEIGL BH, NICHOLS KP. Polydisperse emulsion digital assay to enhance time to detection and extend dynamic range in bacterial cultures enabled by a statistical framework[J]. The Analyst, 2018, 143(12): 2828-2836. DOI:10.1039/C8AN00029H |
| [70] |
MARCOUX PR, DUPOY M, MATHEY R, NOVELLI-ROUSSEAU A, HERAN V, MORALES S, RIVERA F, JOLY PL, MOY JP, MALLARD F. Micro-confinement of bacteria into w/o emulsion droplets for rapid detection and enumeration[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2011, 377(1/2/3): 54-62. |
| [71] |
MA XY, DING W, WANG C, WU HJ, TIAN XP, LYU MS, WANG SJ. DNAzyme biosensors for the detection of pathogenic bacteria[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2021, 331: 129422. DOI:10.1016/j.snb.2020.129422 |
| [72] |
PANDEY R, LU Y, McCONNELL EM, OSMAN E, SCOTT A, GU J, HOARE T, SOLEYMANI L, LI YF. Electrochemical DNAzyme-based biosensors for disease diagnosis[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2023, 224: 114983. DOI:10.1016/j.bios.2022.114983 |
| [73] |
RAUF S, TASHKANDI N, de OLIVEIRA FILHO JI, OVIEDO-OSORNIO CI, DANISH MS, HONG PY, SALAMA KN. Digital E. coli counter: a microfluidics and computer vision-based DNAzyme method for the isolation and specific detection of E. coli from water samples[J]. Biosensors, 2022, 12(1): 34. DOI:10.3390/bios12010034 |
| [74] |
LIU YQ, SHI YL, WANG SY, LIU SJ, SHANG M, ZHAO BY, LIU HH, YANG CY, WANG FA, KWOK CK, WANG HM. Hook-like DNAzyme-activated autocatalytic biosensor for the universal detection of pathogenic bacteria[J]. Analytical Chemistry, 2024, 96(29): 11951-11958. DOI:10.1021/acs.analchem.4c01757 |
| [75] |
BRIAN HARMON J, GRAY HK, YOUNG CC, SCHWAB KJ. Microfluidic droplet application for bacterial surveillance in fresh-cut produce wash waters[J]. PLoS One, 2020, 15(6): e0233239. DOI:10.1371/journal.pone.0233239 |
| [76] |
GOLBERG A, LINSHIZ G, KRAVETS I, STAWSKI N, HILLSON NJ, YARMUSH ML, MARKS RS, KONRY T. Cloud-enabled microscopy and droplet microfluidic platform for specific detection of Escherichia coli in water[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e86341. DOI:10.1371/journal.pone.0086341 |
| [77] |
SCHEMBERG J, GRODRIAN A, RÖMER R, GASTROCK G, LEMKE K. Online optical detection of food contaminants in microdroplets[J]. Engineering in Life Sciences, 2009, 9(5): 391-397. DOI:10.1002/elsc.200800127 |
| [78] |
CHEN WY, KIM JH, ZHANG D, LEE KH, CANGELOSI GA, SOELBERG SD, FURLONG CE, CHUNG JH, SHEN AQ. Microfluidic one-step synthesis of alginate microspheres immobilized with antibodies[J]. Journal of the Royal Society, Interface, 2013, 10(88): 20130566. DOI:10.1098/rsif.2013.0566 |
| [79] |
GUAN WH, CHEN LB, RANE TD, WANG TH. Droplet digital enzyme-linked oligonucleotide hybridization assay for absolute RNA quantification[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 13795. DOI:10.1038/srep13795 |
| [80] |
RANE TD, ZEC HC, PULEO C, LEE AP, WANG TH. Droplet microfluidics for amplification-free genetic detection of single cells[J]. Lab on a Chip, 2012, 12(18): 3341-3347. DOI:10.1039/c2lc40537g |
| [81] |
HSIEH K, MACH KE, ZHANG PF, LIAO JC, WANG TH. Combating antimicrobial resistance via single-cell diagnostic technologies powered by droplet microfluidics[J]. Accounts of Chemical Research, 2022, 55(2): 123-133. DOI:10.1021/acs.accounts.1c00462 |
| [82] |
MACH KE, KAUSHIK AM, HSIEH K, WONG PK, WANG TH, LIAO JC. Optimizing peptide nucleic acid probes for hybridization-based detection and identification of bacterial pathogens[J]. The Analyst, 2019, 144(5): 1565-1574. DOI:10.1039/C8AN02194E |
| [83] |
WANG DQ, HE PS, WANG ZJ, LI GY, MAJED N, GU AZ. Advances in single cell Raman spectroscopy technologies for biological and environmental applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2020, 64: 218-229. DOI:10.1016/j.copbio.2020.06.011 |
| [84] |
REBROSOVA K, SAMEK O, KIZOVSKY M, BERNATOVA S, HOLA V, RUZICKA F. Raman spectroscopy: a novel method for identification and characterization of microbes on a single-cell level in clinical settings[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022, 12: 866463. DOI:10.3389/fcimb.2022.866463 |
| [85] |
JAYAN H, PU HB, SUN DW. Recent developments in Raman spectral analysis of microbial single cells: Techniques and applications[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2022, 62(16): 4294-4308. DOI:10.1080/10408398.2021.1945534 |
| [86] |
PEZZOTTI G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology[J]. Journal of Raman Spectroscopy, 2021, 52(12): 2348-2443. DOI:10.1002/jrs.6204 |
| [87] |
MÄRZ A, HENKEL T, CIALLA D, SCHMITT M, POPP J. Droplet formation via flow-through microdevices in Raman and surface enhanced Raman spectroscopy: concepts and applications[J]. Lab on a Chip, 2011, 11(21): 3584-3592. DOI:10.1039/c1lc20638a |
| [88] |
LU XN, SAMUELSON DR, XU YH, ZHANG HW, WANG S, RASCO BA, XU J, KONKEL ME. Detecting and tracking nosocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus using a microfluidic SERS biosensor[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(4): 2320-2327. DOI:10.1021/ac303279u |
| [89] |
CHOI N, LEE J, KO J, JEON JH, RHIE GE, DEMELLO AJ, CHOO J. Integrated SERS-based microdroplet platform for the automated immunoassay of F1 antigens in Yersinia pestis[J]. Analytical Chemistry, 2017, 89(16): 8413-8420. DOI:10.1021/acs.analchem.7b01822 |
| [90] |
KALANTARIFARD A, SAATEH A, ELBUKEN C. Label-free sensing in microdroplet-based microfluidic systems[J]. Chemosensors, 2018, 6(2): 23. DOI:10.3390/chemosensors6020023 |
| [91] |
KANG DK, MONSUR ALI M, ZHANG KX, HUANG SS, PETERSON E, DIGMAN MA, GRATTON E, ZHAO WA. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection[J]. Nature Communications, 2014, 5: 5427. DOI:10.1038/ncomms6427 |
| [92] |
KEAYS MC, O'BRIEN M, HUSSAIN A, KIELY PA, DALTON T. Rapid identification of antibiotic resistance using droplet microfluidics[J]. Bioengineered, 2016, 7(2): 79-87. DOI:10.1080/21655979.2016.1156824 |
| [93] |
HUDAK JE, ALVAREZ D, SKELLY A, von ANDRIAN UH, KASPER DL. Illuminating vital surface molecules of symbionts in health and disease[J]. Nature Microbiology, 2017, 2: 17099. DOI:10.1038/nmicrobiol.2017.99 |
| [94] |
TSUCHIYA M, ASAHI N, SUZUOKI F, ASHIDA M, MATSUURA S. Detection of peptidoglycan and beta-glucan with silkworm larvae plasma test[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 1996, 15(2/3): 129-134. |
| [95] |
MA M, RICE TA, PERCOPO CM, ROSENBERG HF. Silkworm larvae plasma (SLP) assay for detection of bacteria: False positives secondary to inflammation in vivo[J]. Journal of Microbiological Methods, 2017, 132: 9-13. DOI:10.1016/j.mimet.2016.11.009 |
| [96] |
GUAN ZC, ZOU Y, ZHANG MX, LV JQ, SHEN HL, YANG PY, ZHANG HM, ZHU Z, YANG CJ. A highly parallel microfluidic droplet method enabling single-molecule counting for digital enzyme detection[J]. Biomicrofluidics, 2014, 8(1): 014110. DOI:10.1063/1.4866766 |
| [97] |
ZHAO M, LIU M, ZHOU LP, XU L, HUANG ZM, HUANG YX. An automatic microbial staining and slide preparation device: CN115962995B[P]. 2023-07-04 (in Chinese). 赵明, 刘明, 周露萍, 许良, 黄子鸣, 黄宇翔. 一种全自动微生物染色制片装置: CN115962995B[P]. 2023-07-04. |
| [98] |
SARNO B, HEINECK D, HELLER MJ, IBSEN SD. Dielectrophoresis: developments and applications from 2010 to 2020[J]. Electrophoresis, 2021, 42(5): 539-564. DOI:10.1002/elps.202000156 |
| [99] |
MOHD MAIDIN NN, BUYONG MR, A RAHIM R, MOHAMED MA. Dielectrophoresis applications in biomedical field and future perspectives in biomedical technology[J]. Electrophoresis, 2021, 42(20): 2033-2059. DOI:10.1002/elps.202100043 |
| [100] |
WU WJ, CHANG JH, JIN Y. Method and manufacturing method for bacillus germination mechanism research device based on dielectrophoresis: CN113198553A[P]. 2021-08-03 (in Chinese). 吴文捷, 常金辉, 金涌. 一种基于介电电泳的芽孢萌发机理研究装置的使用方法及制造方法: CN113198553A[P]. 2021-08-03. |
| [101] |
WU WJ. Bacillus purification device based on dielectrophoresis: CN206828511U[P]. 2018-01-02 (in Chinese). 吴文捷. 一种基于介电电泳的芽孢纯化装置: CN206828511U[P]. 2018-01-02. |
| [102] |
WU WJ, CHANG JH, JIN Y. Bacillus germination mechanism research device based on dielectrophoresis: CN202110432095.4[P]. 2021-08-03 (in Chinese). 吴文捷, 常金辉, 金涌. 一种基于介电电泳的芽孢萌发机理研究装置: CN202110432095.4[P]. 2021-08-03. |
| [103] |
JUNG T, YUN YR, BAE J, YANG S. Rapid bacteria-detection platform based on magnetophoretic concentration, dielectrophoretic separation, and impedimetric detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2021, 1173: 338696. DOI:10.1016/j.aca.2021.338696 |
| [104] |
WANG ZL, CAI R, GAO ZP, YUAN YH, YUE TL. Immunomagnetic separation: an effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2020, 19(6): 3802-3824. DOI:10.1111/1541-4337.12656 |
| [105] |
ZHAO M, XU L, ZHOU LP, LIU M. A rapid microbial detection device: CN202310273611.2[P]. 2023-04-21 (in Chinese). 赵明, 许良, 周露萍, 刘明. 一种微生物快速检测装置: CN202310273611.2[P]. 2023-04-21. |
| [106] |
AL-ABBOODI OA, RAWAS-QALAJI M, HUSSAIN Z. A review of patents in the field of microfluidics[M]//Microfluidics in Pharmaceutical Sciences. Cham: Springer Nature Switzerland, 2024: 421-452.
|
| [107] |
XU X, CAI LF, LIANG SS, ZHANG QN, LIN SY, LI MY, YANG QZ, LI C, HAN ZY, YANG CY. Digital microfluidics for biological analysis and applications[J]. Lab on a Chip, 2023, 23(5): 1169-1191. DOI:10.1039/D2LC00756H |
| [108] |
WANG AY, FENG X, HE GY, XIAO Y, ZHONG T, YU X. Recent advances in digital microfluidic chips for food safety analysis: preparation, mechanism and application[J]. Trends in Food Science & Technology, 2023, 134: 136-148. |
| [109] |
HUANG PW, WANG TT, LIN SW, CHANG YC, FAN SK. Dielectrophoretic cell concentrator on EWOD-based chips[C]//2006 1st IEEE International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems. January 18-21, 2006, Zhuhai, China. IEEE, 2006: 1418-1421.
|
| [110] |
LAMANNA J, SCOTT EY, EDWARDS HS, DEAN CHAMBERLAIN M, DRYDEN MDM, PENG JX, MAIR B, LEE A, CHAN C, SKLAVOUNOS AA, HEFFERNAN A, ABBAS F, LAM C, OLSON ME, MOFFAT J, WHEELER AR. Digital microfluidic isolation of single cells for-omics[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 5632. DOI:10.1038/s41467-020-19394-5 |
| [111] |
LI BB, SCOTT EY, DEAN CHAMBERLAIN M, DUONG BTV, ZHANG SL, DONE SJ, WHEELER AR. Cell invasion in digital microfluidic microgel systems[J]. Science Advances, 2020, 6(29): eaba9589. DOI:10.1126/sciadv.aba9589 |
| [112] |
LU LY, ZHANG HM, LIN FH, ZHOU LJ, ZHU Z, YANG CY. Sensitive and automated detection of bacteria by CRISPR/Cas12a-assisted amplification with digital microfluidics[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2023, 381: 133409. DOI:10.1016/j.snb.2023.133409 |
| [113] |
COUDRON L, McDONNELL MB, MUNRO I, McCLUSKEY DK, JOHNSTON ID, TAN CKL, TRACEY MC. Fully integrated digital microfluidics platform for automated immunoassay; A versatile tool for rapid, specific detection of a wide range of pathogens[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2019, 128: 52-60. DOI:10.1016/j.bios.2018.12.014 |
| [114] |
NEMR CR, SKLAVOUNOS AA, WHEELER AR, KELLEY SO. Digital microfluidics as an emerging tool for bacterial protocols[J]. SLAS Technology, 2023, 28(1): 2-15. DOI:10.1016/j.slast.2022.10.001 |
| [115] |
WU JY, ZHANG ML, HUANG JL, GUAN JX, HU CX, SHI MD, HU SY, WANG SR, MA HB. Enhanced absorbance detection system for online bacterial monitoring in digital microfluidics[J]. The Analyst, 2023, 148(19): 4659-4667. DOI:10.1039/D3AN01049J |
| [116] |
TEWARI KUMAR P, DECROP D, SAFDAR S, PASSARIS I, KOKALJ T, PUERS R, AERTSEN A, SPASIC D, LAMMERTYN J. Digital microfluidics for single bacteria capture and selective retrieval using optical tweezers[J]. Micromachines, 2020, 11(3): 308. DOI:10.3390/mi11030308 |
| [117] |
LIU YG, JERALDO P, MENDES-SOARES H, MASTERS T, ASANGBA AE, NELSON H, PATEL R, CHIA N, WALTHER-ANTONIO M. Amplification of femtograms of bacterial DNA within 3 h using a digital microfluidics platform for MinION sequencing[J]. ACS Omega, 2021, 6(39): 25642-25651. DOI:10.1021/acsomega.1c03683 |
| [118] |
QUAN H, WANG SY, XI XG, ZHANG YC, DING Y, LI YB, LIN JH, LIU YJ. Deep learning enhanced multiplex detection of viable foodborne pathogens in digital microfluidic chip[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2024, 245: 115837. DOI:10.1016/j.bios.2023.115837 |