肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是在自然界中广泛存在的一种革兰氏阴性菌，为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)^[1]，主要存在于机体肠道、呼吸道以及自然界(土壤、污水)中^[2]。肺炎克雷伯菌作为一种人兽共患机会致病菌，多感染入侵免疫系统功能低下者或婴幼儿，引起肺炎、肠炎、脑膜炎、败血症等疾病^[3-6]，马红叶等^[7]从西安交通大学第一附属医院2014—2020年的临床病料中共分离肺炎克雷伯菌4 932株(ICU中分离1 328株)，主要感染部位为呼吸道、血液、泌尿系统，对常见抗菌药物耐药性严重，且耐药率呈现增长态势；诸多研究报道家养动物(猪、牛、羊和鸡)和水产养殖动物(大黄鱼和虾等)，由于遭受感染且难以防治，继而给养殖业造成了严重影响^[8-11]。另外，野生养殖动物(大熊猫和黑叶猴等)因有受到侵害的报道而备受人们关注^[12-15]。因此，对肺炎克雷伯菌的生物学特性研究具有重要的公共卫生学意义。

随着野生动物驯养技术的现代化、系统化和成熟化，具有较高药用、毛皮用和观赏用价值的特种经济动物，如狐狸、梅花鹿等呈现规模化人工养殖态势^[16]，而人兽共患病原微生物对驯养动物及养殖人员健康存在一定的潜在威胁，因此养殖过程中病原微生物的情况调查显得尤为重要。本研究旨在调查犀牛驯养场病原菌存在情况，对采集的犀牛粪便进行细菌分离鉴定、药物敏感性与耐药基因检测、动物致病性试验与毒力基因检测等研究，以期为该驯养场预防潜在流行致病菌和保障人员健康提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 样品

六份犀牛粪便样品采集于某犀牛规模化驯养场，样品存放于自封袋中并做好标记后置于−50 ℃保藏。成年昆明小鼠(Kunming mice, KM)购自昆明医科大学实验动物中心(实验动物伦理审查受理编号为YNASVI01-2024001)。

1.2 培养基、主要试剂及仪器

LB琼脂培养基、LB肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和SS琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；巧克力琼脂培养基：每100 mL含LB琼脂培养基90 mL，鸭全血10 mL。肠杆菌科细菌生化常规鉴定盒和革兰氏染色试剂盒，广东环凯微生物科技有限公司；抗生素药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司；2×San Taq PCR Mix，生工生物工程(上海)股份有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。PCR扩增仪，Applied Biosystems公司；凝胶成像紫外仪，上海天能科技有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.3 分离菌形态特征

使用灭菌接种环分别挑取6份犀牛粪便样品划线接种于巧克力琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h。挑取疑似菌落于巧克力琼脂培养基纯化培养后，将纯培养单菌落分别划线接种于巧克力琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂和LB琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱培养24 h后观察细菌生长状态，革兰氏染色后于显微镜下观察菌体形态特征。纯培养物置于50%甘油血清管中‒20 ℃保存备用。

1.4 分离菌的生化鉴定

分离菌株纯培养物按照肠杆菌科细菌生化常规鉴定盒使用说明书进行生化鉴定。

1.5 分离菌16S rRNA基因鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA，按照李廷翠等^[17]方法进行16S rRNA基因的PCR扩增、测序和拼接。获得16S rRNA基因序列通过BLAST进行比对，采用MEGA 11.0根据最大似然法(maximum likelihood method)构建系统发育树。

1.6 分离菌生长曲线的测定

将分离菌株纯培养物接种于LB肉汤培养基，37 ℃、150 r/min进行扩增培养。取10 μL培养液接种至另一支LB肉汤管中，37 ℃、150 r/min培养，每间隔1 h取菌液混匀后加入酶标板中测量其OD₆₀₀值。每次测量设置3个重复组并取平均值。利用GraphPad Prism 10.0软件以时间为横坐标，以OD₆₀₀值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。

1.7 分离菌的药物敏感性检测

采用K-B法测量分离菌株的药物敏感性。使用无菌生理盐水将培养基上纯培养物洗下制成菌悬液，使用灭菌玻璃珠均匀涂布于普通琼脂培养基，选用临床上常用的七大类19种抗生素药敏试纸贴于培养基表面，37 ℃恒温培养箱倒置培养过夜后对结果进行测读。按照美国临床和实验室标准协会药敏判定标准判定分离菌株对不同药物的敏感性^[18]。

1.8 肺炎克雷伯菌特异性khe基因检测

作为肺炎克雷伯菌的特异性基因，khe基因可用于疑似肺炎克雷伯菌的检测鉴定。根据王乐等^[19]研究合成肺炎克雷伯菌特异性khe基因引物，并按照其方法对分离菌株进行PCR验证，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.9 肺炎克雷伯菌荚膜血清型检测

合成解秀梅等^[20]设计的7种肺炎克雷伯菌常见荚膜血清型引物，按照其扩增体系及条件用PCR方法对分离菌株进行荚膜血清型检测，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.10 分离菌耐药基因检测

参照文献[21-23]及上述1.7节药敏试验选用七大类抗生素并合成其相对应的16种耐药基因引物(表 1)，按照其PCR扩增条件对分离菌株进行耐药基因检测，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。所有引物均由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成。

1.11 分离菌毒力基因检测

参照文献[24]用PCR方法对分离菌株进行毒力基因检测，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。上述所有引物(表 2)由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成。

1.12 分离菌动物致病性试验

将20只小鼠随机分为1个对照组和3个实验组，每组各5只。实验组小鼠分别腹腔注射1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰ CFU/mL菌液，注射剂量为1 mL/只，对照组腹腔注射等剂量无菌生理盐水。各组标记后进行分笼饲养，每12 h观察小鼠精神状态和死亡情况，对死亡小鼠立即进行剖检观察并分离细菌进行鉴定，取肝脏、肺脏和肠组织固定于4%多聚甲醛中，以备制作病理组织切片。攻菌96 h后，采用颈椎脱臼法处死剩余小鼠并进行相同操作。

2 结果与分析 2.1 分离菌形态特征及镜检结果

从6份粪便样品中分离到一株肺炎克雷伯菌疑似菌株，分离率为16.67%。该菌株在巧克力琼脂、SS、LB培养基上生长为表面光滑、边缘整齐、形态均一的灰白色圆形单菌落；麦康凯培养基上生长为表面光滑、边缘整齐、形态均一的乳白色奶油状圆形单菌落；麦康凯和LB培养基上圆形单菌落大于巧克力琼脂和SS培养基，均呈现为黏液状且大多聚集在一起(图 1)。革兰氏染色镜检菌体形态为红色短杆状(图 2)。

2.2 分离菌生化鉴定结果

分离菌株生化鉴定结果显示，该菌能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖；蛋白胨水、MR试验、硫化氢、半固体琼脂试验呈阴性；VP试验、西檬氏柠檬酸盐、尿素试验呈阳性(表 3)，与肺炎克雷伯菌生化特性一致，初步判定该分离菌株为肺炎克雷伯菌。

2.3 分离菌16S rRNA基因鉴定结果

分离菌16S rRNA基因分别扩增出500、560、750 bp这3条目的片段，与预期结果一致，测序结果拼接后得到一条全长为1 466 bp的基因。系统发育树显示(图 3)，分离菌株与肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)亲缘关系较接近，处于同一分支；与产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)处于不同分支，因此，分离菌株鉴定为肺炎克雷伯菌，命名为YN-KPP-2023 (GenBank登录号为OR674184)。

2.4 肺炎克雷伯菌特异性khe基因检测结果

分离菌株特异性khe基因PCR扩增出一条大小为430 bp的目的条带，与肺炎克雷伯菌特异性khe基因条带大小一致(图 4)。

2.5 肺炎克雷伯菌荚膜血清型鉴定结果

分离菌株未鉴定出肺炎克雷伯菌的7种常见荚膜血清型(图 5)，可能分属其他荚膜血清型。

2.6 分离菌的生长曲线测定结果

分离菌株生长曲线测定结果显示，0‒1 h该菌株处于生长迟缓期，约1 h后进入对数生长期，约16 h后进入生长稳定期(图 6)。

2.7 分离菌药物敏感性检测结果

药物敏感性结果显示，该菌株对头孢噻肟、头孢他啶、头孢氨苄、氨苄西林等9种抗生素敏感；对阿莫西林、四环素、土霉素和氟苯尼考4种抗生素中度敏感；对强力霉素、多黏菌素B和杆菌肽等6种抗生素耐药(表 4)。

2.8 分离菌耐药基因检测结果

如图 7所示，16种耐药基因检测结果显示，该菌株携带bla_SHV、phoQ、pmrB、oqxA、nfsB、ermB这6种耐药基因，不携带其余10种耐药基因。

2.9 分离菌毒力基因检测结果

该菌株11种毒力基因PCR检测结果显示，共检出kfuBC、fimH、ureA、uge、wabG和wcaG这6种毒力基因，条带明亮单一且大小符合预期，未检测出其余5种毒力基因(图 8)。

2.10 分离菌小鼠致病性试验结果

实验组小鼠攻菌4 h后表现为精神萎靡、被毛耸立、食欲不振，12 h开始发生死亡，不同剂量组各时间点小鼠存活情况见图 9。死亡小鼠剖检后均可见肝脏瘀血肿大，部分肝脏呈现为黄褐色，肺脏出血、萎缩，肠胃鼓气。组织病理切片结果(图 10)显示，肝细胞发生颗粒变性、水泡变性和脂肪变性，肝索结构不清晰，胞体肿胀变形，胞核居中，胞质疏松且空泡化，可见嗜酸性颗粒；肺泡壁轻度增厚，肺泡大小不一，肺泡间隔增宽，肺泡壁和血管周围可见粒细胞小灶性浸润，支气管内偶见嗜酸性絮状物，肺泡腔内有局灶性出血灶，可见少量红细胞；小肠少量肠绒毛上皮与固有层分离，间隙增大，肠腺数量丰富，排列密集，有少量粒细胞浸润；而对照组均正常。

3 讨论与结论

肺炎克雷伯菌于1893年由Friendiander从患有大叶性肺炎患者肺脏组织中分离得到，分为肺炎、鼻炎和鼻硬结3个亚种^[25]。近年来，养殖动物感染肺炎克雷伯菌问题随养殖规模化、集约化发展逐渐浮现^{[8, 15]}。为调查某犀牛驯养场病原菌存在情况，本研究将随机采集到的6份犀牛粪便进行细菌分离培养，并从中得到一株肺炎克雷伯菌，分离率为16.67% (1/6)。相关研究表明，肺炎克雷伯菌在临床上感染养殖动物所引起的症状除肺炎外，还可能引起腹泻^[26-27]。侯铭源等^[26]从河北省某市患有呼吸道疾病的80份病牛肺脏、鼻拭子样本中分离得到10株肺炎克雷伯菌，分离率为12.5% (10/80)；左伟等^[27]从西藏不同地区采集的60份腹泻藏猪新鲜粪便样品中分离到3株肺炎克雷伯菌，分离率为5% (3/60)；陈强等^[28]从吉林省某水貂养殖场送检的6只患肺炎病死水貂病料样品中分离得到6株肺炎克雷伯菌，分离率为100%。不同养殖场肺炎克雷伯菌分离率不一样，可能与养殖场所处位置、动物的易感性和饲养管理方式不同有关。对本次分离的肺炎克雷伯菌进行实验室相关研究有利于预防和控制该疾病的发生及流行。

目前常用抗生素来治疗细菌性疾病，不合理使用经常导致菌株产生耐药性，从而降低临床治疗效果，所以了解菌株的药物敏感性有利于临床用药的选择。本研究从耐药基因鉴定和药物敏感性试验初步探讨分离菌株的耐药情况。分离菌株呈多重耐药，耐药表型对四环素类、多肽类、大环内酯类中的6种抗生素产生了耐药，其中，对实验中多肽类和大环内酯类抗生素耐药率高达100%。药敏试验结果提示β-内酰胺类和喹诺酮类抗生素可作为驯养场的治疗备选药，并应避免因抗生素的不合理使用而导致的耐药菌株的出现。王哲红等^[29]从某规模化奶牛场分离得到的肺炎克雷伯菌对头孢菌素类抗菌药耐药，对大环内酯类和多肽类抗菌药敏感，与本研究相反，分析其原因可能是不同菌株之间的差异和不同地区用药差异所致。分离菌株检测出β-内酰胺类bla_SHV、喹诺酮类oqxA、硝基呋喃类nfsB、大环内酯类ermB和多肽类phoQ、pmrB这6种耐药基因，四环素类和氯霉素类均未检测出，与多黏菌素B、阿奇霉素、红霉素及罗红霉素的耐药表型结果一致，与强力霉素的耐药表型以及β-内酰胺类、喹诺酮类和硝基呋喃类的敏感表型结果不一致，判断其可能存在除耐药基因外的其他机制介导的耐药表型，以及其他耐药基因介导的抗生素耐药性或存在部分基因不表现出耐药表型的情况。

毒力基因在病原菌入侵感染宿主的能力、感染的过程以及感染的程度中起重要作用。分离菌株毒力基因检测结果与范培超等^[30]的报道基本一致，均检测出了铁摄取相关和促进菌毛黏附的fimH基因，影响尿素酶合成的ureA、uge基因，以及介导脂多糖合成的wabG基因，也符合相关研究中1型菌毛fimH是肺炎克雷伯菌中最常检测到的毒力因子的研究结果^[31]。另外，分离株不排除携带除此之外的其他毒力基因，这些毒力基因或许协同增强了该菌株的致病力和侵袭力，这可能与小鼠接种感染致死以及组织器官损伤有关，也提示驯养场中可能存在肺炎克雷伯菌感染犀牛的风险，应引起高度重视。

本研究成功从犀牛驯养场粪便样品中分离到一株肺炎克雷伯菌，该菌株具有多重耐药性和一定的致病性，对犀牛构成潜在威胁，但其耐药和致病机制仍需深入研究。