沙门氏菌是一种重要的人畜共患病病原菌和食源性病原菌，是危害养殖业和人类健康的主要病原菌之一。沙门氏菌血清型众多，不同血清型致病性及耐药性有一定差异。近年来由于抗菌药物在养殖业的广泛和不合理使用，使得沙门氏菌耐药水平逐年上升，且耐药谱也不断发生变化，沙门氏菌已诱发多种耐药机制^[1]。因此，研究我国禽源沙门氏菌的血清型及耐药性变化趋势，对我国开展沙门氏菌流行病学研究有重要意义。近几年全基因组测序技术迅猛发展，采用该技术可以简单、高效地筛选耐药基因并研究细菌的耐药性能力。

本研究调查辽宁省2022年市售禽肉中分离出的沙门氏菌污染状况及血清型分布、多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)和耐药状况，明确我省市售禽肉中沙门氏菌的优势血清型、耐药性及耐药基因携带情况，以期为我省禽源沙门氏菌的流行病学、耐药性研究及全基因组测序分析技术的应用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品

2022年采集辽宁省内市售禽肉(包括沈阳市40份、抚顺市20份、本溪市20份、铁岭市20份、阜新市20份、鞍山市15份、锦州市15份)共计150份样品，分离出53株沙门氏菌，其中包括103份生鲜禽肉分离出38株沙门氏菌和47份调理禽肉制品(生肉添加调理料)分离出15株沙门氏菌。药敏试验质控菌株选用大肠埃希菌ATCC 25922，保藏于辽宁省疾病预防控制中心微生物实验室。

1.1.2 主要试剂和仪器

沙门氏菌诊断血清，广州健仑生物科技有限公司；革兰阴性需氧菌药敏测试板，海口星佰科技有限公司；GN生化鉴定卡，生物梅里埃公司；细菌DNA提取试剂盒(磁珠法)，江苏硕世生物科技股份有限公司。VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统和麦氏比浊计，生物梅里埃公司；全自动核酸提取仪，江苏硕世生物科技股份有限公司。

1.1.3 培养基

沙门氏菌科玛嘉显色培养基，上海欣中生物有限公司；药敏接种培养液(纯水1 000 mL，营养肉汤培养基干粉21 g，氧化钙61.05 mg，氯化镁43.54 mg)，复星诊断科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株复核及血清学鉴定

将各市检出的53株沙门氏菌株进行复核检验。所有菌株经沙门氏菌显色平板初步鉴定，后经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪最终鉴定为沙门氏菌。采用玻片凝集法，根据国家标准GB 4789.4—2016^[2]和沙门氏菌诊断血清说明书，对沙门氏菌株进行O相凝集反应和H相血清诱导分型，参照Kauffman-White沙门氏抗原表鉴定沙门氏菌血清型。

1.2.2 药物敏感性试验

采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，实验用10类14种抗微生物药物包括氨苄西林(ampicillin, AMP)、氨苄西林/舒巴坦(ampicillin-Sulbactam, AMS)、头孢西丁(cefoxitin, CFX)、头孢唑啉(cefazolin, CFZ)、头孢噻肟(cefotaxime, CTX)、庆大霉素(gentamicin, GEN)、氯霉素(chloramphenicol, CHL)、四环素(tetracycline, TET)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、萘啶酸(nalidixic acid, NAL)、复方磺胺(compound sulfamethoxazole, SXT)、多黏菌素E (polymyxin E, CT)、头孢他啶/阿维巴坦(ceftazidime and avibactam sodium, CZA)和亚胺培南(imipenem, IPM)。将备检菌株经2次传代培养后，制作0.5麦氏浊度菌悬液，取60 μL加入含有12 mL药敏接种培养液的加样槽中，充分混匀，随后用8通道微量移液器依次取100 μL稀释菌液加入到除阴性对照孔外的95孔药敏板中，阴性对照孔加无菌肉汤培养液100 μL，将接种后的药敏板放置于36 ℃温箱培养16−18 h，实验结果参照美国临床和实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)^[3]制定的药敏试验执行标准进行判定。

1.2.3 全基因组测序及分析

将沙门氏菌阳性菌株提取的核酸送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行二代全基因组测序。将测序结果(ScienceDB数据库，DOI：10.57760/sciencedb.09123)与https://sppt.cfsa.net.cn:8207/bacsys/software网站数据库进行比对分析，分析后得到菌株相应的ST型别及相应的耐药基因，将全基因组序列导入BioNumerics 7.6软件构建最小生成树。

2 结果与分析 2.1 市售禽肉中沙门氏菌的污染状况

2022年共采集并检测来自辽宁省内市售禽肉150份样品，其中53份检出沙门氏菌，阳性率为35.3% (53/150)，本溪市检出率最高为35.8% (19/53)，铁岭市检出率为17.0% (9/53)，沈阳市检出率为15.1% (8/53)，鞍山市、锦州市、抚顺市检出率均为9.4% (各5/53)，阜新市检出率为3.8% (2/53)。

2.2 血清型分布

本研究中53株沙门氏菌分属11个血清型，其中肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)检出率最高为58.5% (31/53)，其他血清型按占比由高到低依次为肯塔基沙门氏菌(Salmonella Kentucky) (17.0%, 9/53)、印第安纳沙门氏菌(Salmonella Indiana) (7.5%, 4/53)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) (3.8%, 2/53)、波茨坦沙门氏菌(Salmonella Potsdam) (1.9%, 1/53)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis) (1.9%, 1/53)、萨奥沙门氏菌(Salmonella Sao) (1.9%, 1/53)、门登沙门氏菌(Salmonella Menden) (1.9%, 1/53)、阿贡纳沙门氏菌(Salmonella Agona) (1.9%, 1/53)、里定沙门氏菌(Salmonella Reading) (1.9%, 1/53)、布伦登卢普沙门氏菌(Salmonella Brendonlup) (1.9%, 1/53)。

2.3 药敏试验结果

对53株沙门氏菌进行14种抗微生物药物耐药试验，结果显示，沙门氏菌对萘啶酸(NAL)、氨苄西林(AMP)、四环素(TET)的耐药率较高，分别为92.5% (49/53)、71.7% (38/53)、45.3% (24/53)，对亚胺培南(IPM)的耐药率为0.0% (表 1)。仅有1株沙门氏菌对所有测试药物均敏感。有35株沙门氏菌分离株耐3种及3种以上药物，共产生25种多重耐药谱，总耐药率为66.0% (35/53)，其中1株沙门氏菌最多，具有12种药物抗性。

2.4 MLST分型结果

基于全基因组测序结果，53株沙门氏菌根据7种管家基因的序列被分为10个ST型别，分别为ST11 (58.5%, 31/53)、ST198 (17.0%, 9/53)、ST17 (7.5%, 4/53)、ST19 (3.8%, 2/53)、ST2039 (1.9%, 1/53)、ST32 (1.9%, 1/53)、ST413 (1.9%, 1/53)、ST13 (1.9%, 1/53)、ST321 (1.9%, 1/53)和ST22 (1.9%, 1/53)，1株菌为未分型菌株。将全基因组序列导入BioNumerics 7.6软件构建最小生成树(图 1)。

2.5 沙门氏菌耐药基因检测结果

53株沙门氏菌对耐药基因的携带率见表 2。经全基因组测序分析出7类24种耐药基因，包括5种氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-Ⅱd, StrB, aac(3)-IVa, aac(6′)-Iaa, aph(3′)-Ia]，3种β-内酰胺类耐药基因(bla_TEM-1B, bla_OXA-1, TEM)，3种苯丙醇类耐药基因(catB, ƒloR, cmlA1)，2种四环素类耐药基因(tetA, tetC)，4种喹诺酮类耐药基因[oqxA, oqxB, qnrS1, aac(6′)-Ib-cr]，3种磺胺类耐药基因[Sul1, Sul2, Sul3]，4种青霉素类耐药基因(bla_TEM-141, bla_TEM-1B, bla_CTX-M-55, bla_OXA-1)。其中tetC携带率最高为45.3% (24/53)，其次为tetA携带率为41.5% (22/53)，携带率最低的耐药基因为cmlA1，仅有1株占比1.9% (1/53)。7类抗生素耐药表型和耐药基因型的符合率为66.7%−100%，四环素类符合率为100%。

2.6 相关性分析

2.6.1 血清型与ST型相关性分析

53株沙门氏菌包括11种血清型，分别对应10种ST型(表 3)，其中萨奥沙门氏菌对应的ST型未进一步分型。

2.6.2 血清型和耐药性相关性分析

本研究的53株沙门氏菌耐药结果显示，血清型与耐药性存在一定关联。萨奥沙门氏菌对所试抗生素均敏感；检出的9株肯塔基沙门氏菌多重耐药谱为6重到11重，其中耐10种抗生素菌株占比最多为55.6% (5/9)，对AMP、GEN、NAL这3种抗生素耐药率均为100% (9/9)，耐药状况最为严重；肠炎沙门氏菌对NAL耐药率为100% (31/31)。

3 讨论与结论

本研究显示，2022年辽宁省内市售禽肉总检出率为35.3% (53/150)。傅祎欣等^[4]报道显示2020年福建禽肉中沙门氏菌检出率为22.5%；胡凤清等^[5]报道显示南平市生禽肉沙门氏菌检出率为31.0%；陈培超等^[6]报道显示2019–2020年上海市嘉定区禽肉沙门氏菌检出率为20.5%；于明明等^[7]报道了2019年潍坊市生禽肉沙门氏菌检出率为16.4%。综上数据显示，辽宁省市售生禽肉中沙门氏菌的污染处于较高水平，可进一步研究生禽的饲养、屠宰及禽肉的加工、流通、售卖环节过程中存在的问题，有利于发现降低禽肉中沙门氏菌污染的方法。

沙门氏菌血清型分布广泛，种类繁多。本研究的53株沙门氏菌经血清鉴定分析共得到11个血清型，其中以肠炎沙门氏菌为优势血清型。这与赵建梅等^[8]报道的肠炎沙门氏菌是我国部分地区禽源沙门氏菌的优势血清型基本一致，也与畅晓晖等^[9]报道的北京地区肠炎沙门氏菌大多属于鸡源基本一致。由此可知，我国禽类中沙门氏菌流行的血清型多以肠炎沙门氏菌为主。本研究结果表明血清型与ST型具有较强的相关性，每种血清型对应一种ST型，这一结果与曲梅等^[10]的研究结果基本一致。因此，MLST方法可用于食品、动物或人群中沙门氏菌的血清型预测。

本研究选取10类14种抗生素进行耐药实验，结果显示，沙门氏菌中共产生25种多重耐药谱，整体耐药率为66.0% (35/53)，菌株均有不同程度耐药，一些菌株多重耐药问题严重，说明辽宁省地区市售禽肉中沙门氏菌耐药情况不容乐观。其中萘啶酸耐药率最高为92.5% (49/53)、氨苄西林耐药次之为71.7% (38/53)，这与广东省广州市鸡源沙门氏菌对萘啶酸和氨苄西林耐药率结果相似^[11]，也与李兵兵等^[12]、李欣等^[13]结果相似。沙门氏菌感染临床推荐用药为喹诺酮类和三代头孢类^[14]，但本研究中对一代喹诺酮类耐药为92.5% (49/53)，三代喹诺酮类耐药率为26.4% (14/53)，中介率也达47.2% (25/53)，提示本地区临床用药慎重选用喹诺酮类药物。最敏感药物为亚胺培南，耐药率为0，这与多地区研究结果相似^{[6, 15]}，分析原因可能与其在体内稳定性差，很少用于养殖业有关。多黏菌素已在2018年被禁止用于动物饲料添加剂，但本次研究中多黏菌素耐药率为20.8% (11/53)，提示多地区还要加强对饲料添加剂的监管。

耐药基因是细菌产生耐药性的机制之一，本研究的53株分离株中，经全基因组测序结果分析到氨基糖苷类、β-内酰胺类、苯丙醇类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、青霉素类7类抗生素耐药基因，其优势耐药基因分别为StrB、TEM、ƒloR、tetC、qnrS1、Sul2、blaTEM-141。七类耐药基因检出情况与耐药表型除喹诺酮类的符合率都在66.7%−100%，其中四环素的符合率最高为100%，说明耐药表型与耐药基因型存在密切关系，但又存在差异。喹诺酮类抗生素中萘啶酸表型耐药检出49株，基因耐药仅检出11株，分析其原因耐药表型的形成是一个复杂过程，是多因素多途径共同作用的结果^[10]。

综上所述，2022年辽宁省市售禽肉中沙门氏菌呈现出检出率高、血清型分布广泛、耐药问题严重的现象。本实验采用常规检测方法和全基因组测序分析方法对辽宁省内市售禽肉沙门氏菌耐药性进行分析研究，各耐药基因在沙门氏菌中的表达及作用机制还需要进一步研究。耐药问题应引起各部门高度重视，加强卫生监督的同时规范抗生素使用并采取防范措施，以减少食源性沙门氏菌的耐药性，保障食品安全。