2024, Vol. 51扩展功能
文章信息
- 王敬敬, 徐松, 赵维, 侍浏洋, 王兴彪, 韩一凡, 张小霞, 黄志勇
- WANG Jingjing, XU Song, ZHAO Wei, SHI Liuyang, WANG Xingbiao, HAN Yifan, ZHANG Xiaoxia, HUANG Zhiyong
- 基于应用场景的微生物组工程化策略
- Microbiome engineering strategies in different application scenarios
- 微生物学通报, 2024, 51(12): 4909-4921
- Microbiology China, 2024, 51(12): 4909-4921
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.240514
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文章历史
- 收稿日期: 2024-06-26
- 接受日期: 2024-08-25
- 网络首发日期: 2024-09-12
2. 国家合成生物技术创新中心, 天津 300308
2. National Center of Technology Innovation for Synthetic Biology, Tianjin 300308, China
自然界中的微生物很少单独存在，通常多种微生物共同生存，形成微生物组，参与人类和动植物健康、地球生物化学循环等[1]。近年来，随着测序技术的迅猛发展，人们对微生物组的认识越来越深刻，其在保持人类和动植物健康、提高作物产量、治理环境污染、生产高值化合物等方面具有巨大的潜力[2-3]。
如何构建高效、稳定的微生物组，并通过工程化将其应用至各个领域仍然是当前研究的重点和难点。Lawson等[4]综述了2种微生物组构建策略，其中“自上而下”是指使用精心选择的环境变量(例如某些底物负载率、平均细胞保留时间和氧化还原条件等)，通过生态选择强制已有的微生物组(自然发生或接种)执行某种功能；而“自下而上”是指将2种以上不同功能的菌株组装成群落以执行某种功能。这些策略大大促进了微生物组的发展和应用[5-7]。
具体而言，微生物组的应用极为宽广，涉及工业、农业、环境、健康、能源等众多领域[8-9]，不同场景的应用需求差别巨大，相应的微生物组工程化构建策略也无法统一。本文拟根据不同应用场景，总结常用的微生物组工程化构建策略，并分析其特点和局限，以期为不同应用场景高效微生物组的构建、促进微生物组的产业应用提供借鉴。
1 微生物组工程化策略随着对微生物组的深入研究，人们逐渐意识到其工程化过程非常复杂，目前尚无适用所有应用需求的微生物组构建策略。必须以需求为导向，选择适合的构建策略，才可能获得匹配度高、功能性强、稳定性好的工程微生物组。本文根据需求将微生物组的应用场景分为封闭系统、半封闭系统和开放系统。通过分析3种系统中已有微生物组构建策略的特点及局限，结合实际应用的经验反馈，根据不同系统的特点，针对性地提出了微生物组的构建策略。
1.1 封闭系统下的微生物组工程化策略 1.1.1 封闭系统的环境特征封闭系统是指与外界环境无交流的系统，即微生物组不与外部环境发生物质和能量交换，如工业发酵等。由于封闭系统中的环境变量可人为控制，因此微生物组的功能和效率是关注重点。在工业发酵中，大多以高产为目标，利用微生物组将生物质转化为燃料、材料、化学品等。封闭系统还常用于探索物种相互作用的科学研究。
1.1.2 封闭系统现有构建微生物组策略分析目前基于封闭系统的微生物组构建大多采用“自下而上”的策略。较为常见的方法是通过基因工程改造微生物，将代谢途径分配到不同的微生物菌株中，从而减轻单个微生物的代谢负担[10]。较为经典的案例是Zhao等[11]研发的“Y型人工菌群”，包括一株能够优先利用葡萄糖高产丁醇的大肠杆菌(Escherichia coli) EB243和一株能够高效利用木糖高产丁醇的大肠杆菌(Escherichia coli) EB243X。“Y型人工菌群”可以混合糖为原料进行批式发酵，可生产约21 g/L丁醇，得率为理论值的85%，是目前报道利用混合糖生产丁醇的最高水平(图 1A)；在该例中，研究者重点关注细胞内部代谢途径、细胞间途径的整合，以及双菌比例的适应性调整，目标在于提高产量，增强菌群对发酵条件的适应性和稳定性，充分证明了利用同属种的工程菌构建微生物组的工业应用潜力[11]。Zhou等[12]则尝试了将细菌大肠杆菌(Escherichia coli) TaxE1与真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) TaxS1共培养高效生产含氧紫杉烷(图 1B)，研究者基于代谢接力的思路，将合成含氧紫杉烷的途径分为2个模块，分别在酿酒酵母和大肠杆菌中表达。大肠杆菌TaxE1利用葡萄糖生产杉二烯，杉二烯再被酿酒酵母氧化生成含氧紫杉烷。这不仅实现了在同一个生物反应器中稳定生产含氧紫杉烷，而且还实现了跨物种的微生物组构建。在更复杂的植物源天然产物合成中，Jones等[13]构建了包含4株菌的生物联合体，他们分别将15种酶和转录因子的过表达匹配到4个独立的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株模块上，通过分散代谢负担的方式，实现了花青素的生物全合成(图 1C)。还有很多通过基因改造和菌株共代谢实现目标产物提升的案例，大部分研究都集中在大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等模式微生物[14-16]。
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| 图 1 利用工程菌构建微生物组的案例 Figure 1 Examples of using engineered bacteria to construct microbiomes. A: "Y-shaped artificial bacterial colony" that produces butanol from glucose and xylose simultaneously[11]. B: Co-culture of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae to produce oxygenated taxanes[12]. C: De novo synthesis of anthocyanins by multiple bacterial strains[13]. A：同时利用葡萄糖和木糖产丁醇的“Y型人工菌群”[11]. B：利用大肠杆菌和酿酒酵母共培养生产含氧紫杉烷[12]. C：多菌联合从头合成花青素[13] |
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此外，还有一些研究利用具有不同生理生态功能的野生菌株合成特定功能的微生物组，例如一些研究利用嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)和嗜酸菌(Acidiphilum spp.)合成微生物组进行硫铁矿开采[17]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌在硫铁矿浸出中具有明显优势，但因其严格自养，环境中的有机物会抑制其生理活性。引入兼性营养型的嗜酸菌可以消除有机物对嗜酸氧化亚铁硫杆菌的抑制，从而显著提升硫铁矿的浸出效果[18]。另外，在厌氧环境下，利用梭菌作为初级生产者，硫酸盐还原菌作为次级生产者进行共同培养，可显著改变梭菌产乳酸的路径，提高氢气的产量[19]。因此，利用野生菌株间的代谢特征、生态互作等进行物种组合，形成互补优势，也可以构建具有某种高效功能的微生物组。
1.1.3 封闭系统中构建微生物组面临的挑战采用基因工程菌构建微生物组的主要挑战是工程菌的遗传不稳定、系统不稳定等[13, 20]。由工程菌株构建的微生物组在应用中往往存在复杂的系统性问题，比如通过不同代谢模块组合构建的工程菌株合成目标物，对于初始菌株比例的微量变动会高度敏感，导致协作菌株生产力的改变，规模化生产中可能会导致涉及补料批次、高细胞密度培养过程中许多不确定的因素。此外，多模块之间的连接，如果存在限制/瓶颈模块消耗途径中更高效模块的可用空间时，也会导致部分模块的所需生物量受限，从而影响层级扩大培养的效果[13]。而利用野生型微生物菌株进行微生物组构建，则需要巨大的菌种资源和文献支持，对野生菌株的生理生化特征和遗传性状均要有深刻的了解。采用传统的组学培养策略需要耗费巨大的人工、物力、时间。如何在数以万计的菌种资源中找到最优的组合是目前面临的一大难题。
1.1.4 封闭系统中构建微生物组的建议无论是利用基因工程菌还是野生菌构建微生物组，均应深入了解各个菌株的生理、生态功能，及物种间的相互作用，特别是物质、能量、信号交流等，才能构建高效稳定的微生物组。在微生物组构建中应用代谢网络模型将会促进对微生物组的认识，加深对物种间相互作用的理解。一种推荐的用于封闭系统微生物组构建的策略如下：首先，通过文献调研、数据库查找(如基因组数据库、蛋白数据库等)定位到符合目标的菌株种类，然后可以通过分离筛选、购买等方式获得原始菌株。在此基础上，利用半自动化模型构建软件(如ModelSEEd、CarveMe、RAVEN、MetaGEM)构建模型[21]，测试一些路径的改变对目标产物的影响，从而指导工程菌的构建。针对双菌或多菌组合，基于模型算法，可以模拟代谢交换、优化菌株组合，从而提升目标功能。一些专业的软件如SMETANA[22]、NECom[23]可进行不同菌种之间的代谢互作模拟，COMETS可进行菌群内不同物种生长过程的模拟[24]。利用这些生物计算工具，结合湿实验验证，可以更加精确地获取微生物之间的代谢互作关系，从而提升菌群性能。这些工具为寻找、分析、验证潜在的微生物菌种提供了强大的数据支持，助力封闭系统下的微生物组构建(图 2)。
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| 图 2 用于封闭系统微生物组构建策略的示意图 Figure 2 Schematic diagram of the closed system microbiome construction strategy. The strains used to construct the microbiome are selected through literature review, database search, etc., the strain resources are obtained through separation and screening, the strain characteristics and metabolic modeling are used to guide the synthesis of the microbiome, and a more efficient microbiome is obtained through optimization pathways such as interaction simulation[21-24]. 通过文献调阅、数据库查找等方式选定用于构建微生物组的菌株，通过分离筛选获得菌株资源，利用菌株特性和代谢建模指导合成微生物组，通过互作模拟等优化通路，获得更高效的微生物组[21-24] |
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半封闭系统是指与外界环境间歇、短暂、部分交流的系统，如肠道、沼气、固体酿造等系统。在半封闭系统中微生物组主要会受到土著环境(温度、土著微生物等)的影响，还会间歇、部分受到外界环境(温度、外源微生物等)的影响，但受干扰程度与开放系统相比影响较少。
1.2.2 半封闭系统中现有构建微生物组策略分析肠道微生物组或可作为半封闭系统微生物组的典型代表，因为其主要是受宿主本身的影响，并间歇性地受到外界因素(如饮食、药物等)的影响。肠道微生物组是人体内部的重要微生态系统[25]，由生存在人体消化系统中的超过数百种微生物共同构成。肠道微生物组平衡与健康状态对个体的整体健康具有深远影响，包括消化系统、免疫系统、神经系统等多个方面[26]。因此，当肠道微生物组失衡时，可能会导致一系列的健康问题，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等[27-28]。
随着合成生物学的发展，肠道微生物组人工构建的研究越来越多，这加深了人们对肠道微生物与健康关系及其科学特性的理解[3]。目前，肠道微生物组的构建采用两种策略构建，从“自下而上”的细胞间过程(如交叉喂养、同生和营养缺陷型)到“自上而下”的群落自组装过程(如群落结构和复原力)都是合成肠道微生物组的基本方法。大多数早期体外合成肠道微生物组大多采用“自下而上”的方式，选用的菌种数量少，更侧重于益生菌对其他肠道共生菌或病原体的抑制作用的研究[29-30]和应用，如市场上常见的益生菌剂制品“妈咪爱”、三联或五联益生菌等。2022年，Cheng等[31]构建了由119种细菌组成的复杂肠道微生物组，并成功移植到小鼠体内，揭示了微生物组与生命健康间的关联机制；在此研究中，通过分析人类微生物组计划(human microbiome project, HMP)产生的宏基因组数据，选出超过100种普遍存在于HMP受试者肠道内的微生物菌种，在体外构建了一个由104种细菌组成的hCom1微生物组。hCom1具有良好的稳定性，其中98%的物种能够在无菌小鼠肠道内长期定殖；为了更好地模拟天然肠道菌群，研究人员进一步将人类粪便中的微生物引入到定殖hCom1小鼠的肠道内，发现多种新的细菌物种成功定殖并填补了空缺的生态位，成功构建了包含119种细菌物种的hCom2合成微生物组。hCom2与小鼠天然微生物组一样，能够抵御大肠杆菌引发的感染，是一种理想的肠道微生物组研究模型[31]；该研究成功构建了一个组成明确、高度复杂(含有119个菌株)且更能有效地反映人类肠道菌群作用的人工合成微生物组。近年来，利用“自上而下”策略构建肠道微生物组的代表技术是粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)。目前全球已有多个使用FMT帮助患者恢复肠道功能的成功报道[32-33]。
1.2.3 半封闭系统中构建微生物组面临的挑战尽管粪菌移植、悉生小鼠等实验方法为微生物组的工程化构建提供了有力的支持，半封闭系统下肠道微生物组的构建仍存在一定局限性。例如粪菌移植方法所使用的菌群样本虽然最大程度地反映了人类肠道菌群的真实情况，但其物种组成不明，难以剖析具体发挥作用的微生物。此外，粪菌移植的方法存在一定的风险性，虽然国际和国内都已有操作指南，但尚无规范的国家法律法规[34]。关于构建人工合成微生物群落的方法研究虽然组成明确，但是复杂度低(通常少于20个菌株)，无法反映不同肠道微生物之间复杂多变的互作关系。上述局限性在一定程度上阻碍了合成肠道微生物组的应用，因此，当前亟须开发物种组成明确且具有更高复杂度的人工合成微生物群落和菌群网络数据模型，以便更好地推动肠道微生物组合成领域的发展。
1.2.4 半封闭系统中构建微生物组的建议确保人工构建肠道菌群的安全性和稳定性是一个复杂且关键的问题。为了构建安全、高效地用于粪菌移植的肠道微生物组，首先要严格筛选健康供体，确保它们的肠道菌群健康、无病原体和潜在的有害微生物，人工构建肠道菌群的组成和功能需要综合运用供体筛选、合成生物学方法、益生菌和益生元的补充、饮食调整、药物干预等多种策略和方法；其次要选择安全有效的菌群移植方法，避免使用可能增加感染风险的途径，在移植过程中，确保操作的无菌性和环境的清洁度，以减少外部污染的可能性；此外在菌群移植后，对患者进行定期的肠道菌群监测，包括菌群组成、功能活性等。未来应将多组学、代谢网络模型等结合到肠道微生物组生态系统设计中，如利用AGORA[21]、microbeMASST (https://masst.gnps2.org/microbemasst/)等工具[35]，将微生物组信息转化为治疗方法。肠道微生物组人工构建是一个充满挑战和机遇的领域。随着技术的不断进步和研究的深入，相信我们将会更好地理解肠道微生物组的功能和机制，并开发出更加安全、有效的治疗方法来应对与肠道微生物组失衡相关的各种疾病。
1.3 开放系统下的工程化策略 1.3.1 开放系统的环境特征开放系统是指与外界环境始终保持交流的系统，往往是自然条件下的系统，如土壤、水体等。在开放系统中微生物组的应用不仅会持续受到外界环境(温度、降水等)的影响和干扰，还会持续与土著和空气微生物相互作用。这就要求工程微生物组必须具备极强的稳定性和抗干扰能力，对效率要求相对较低(作用时间可为几天或更长时间)。
1.3.2 开放系统中现有构建微生物组策略分析在开放系统中，“自下而上”和“自上而下”构建微生物组的策略均有大量应用。采用“自下而上”策略构建的微生物组大多应用于农业种植，如Begum等[36]将具有解磷功能的丛枝菌根真菌变形球囊霉(Glomus versiforme)和植物根际促生菌甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)联合接种，通过提高抗氧化和矿物质营养代谢，改善干旱胁迫下烟草的生长和光合作用。Zhou等[37]通过比较病害组和健康组番茄根际微生物组的差异，明确了健康组显著富集的细菌和真菌物种，筛选并合成了跨界的微生物组，可高效防控番茄的枯萎病。此外，也有一些研究采用“自下而上”的策略构建用于污水处理的微生物组，如He等[38]利用脱氮菌鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)合成的微生物组可高效去除水体中的硝态氮。这些微生物组使用后，大多会定殖于土壤、水体等环境中，并与土著和外界环境互作，改善土壤、水体等环境及其中的微生物群落结构和功能，富集有益菌，抑制有害菌，从而促进作物生长，加速污染物降解等。虽然很多研究强调在“自下而上”合成微生物组时，应选择无拮抗作用的物种进行构建，但最近也有报道，物种间的拮抗作用可能不会影响合成微生物组在开放系统的应用效果[39-40]。
采用“自上而下”策略构建的微生物组应用在污染物降解、去除中的报道较多。如Xu等[41]利用农药阿特拉津富集驯化土壤中的微生物，获得了可高效降解阿特拉津的微生物组。Lin等[42]利用高温高浓度氨废水从活性污泥中富集驯化了微生物组，在50 ℃时表现出优异的脱氮和化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)去除能力。朋婷婷等[43]利用磁性纳米粒子介导分离技术(nanoparticle-mediated isolation, MMI)获得能够高效降解转化3, 3′, 4, 4′-四氯联苯的微生物组。此外，也有一些研究采用“自上而下”的策略构建用于农业种植的微生物组，如Panke-Buisse等[44]利用人工选择的方法连续选择早或晚开花的拟南芥根际微生物组接种下一代拟南芥种子，实现对拟南芥开花时间的控制。
将“自上而下”和“自下而上”相结合的方法主要是利用富集驯化等方法获得高效微生物组，再利用微生物组学技术明确关键物种，通过培养组学获得关键物种，进而再合成高效的微生物组。如Ruan等[45]以除草剂为底物，从自然土壤中富集驯化了除草剂降解微生物组，并从中鉴定了关键物种。利用培养组学技术获得了这些关键物种，并利用代谢网络模型从中选择了适配的物种，合成了生物修复增强的微生物组。
1.3.3 开放系统中构建微生物组面临的挑战由于开放系统中存在持续波动性的物质和能量交换，以及与外部微生物的代谢产物交换，因此构建功能长期稳定的微生物组仍是未来研究的核心目标。通常“自下而上”构建的微生物组缺乏足够的稳定性，如Rawat等[46]利用3株解磷菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，分散泛菌(Pantoea dispersa)和葡萄球菌(Staphylococcus spp.)构建的微生物组在2018年使得水稻产量提升了50.58%，但2019年的产量仅提高了35.64%。而“自上而下”构建的微生物组，其稳定性一般优于“自下而上”构建的微生物组。例如同样是产沼气的微生物组，采用“自上而下”策略的稳定性更优异[47]。另外，如何快速构建适用于特定开放环境的微生物组也是未来研究的重要目标。利用“自上而下”构建微生物组方面，初始微生物组的选择，微生物组的富集、筛选方法等仍需进一步明确相关的方法。利用“自下而上”合成微生物组方面，如何选择适配物种进行合理的组装，以实现协同效果仍是本领域亟待突破的难点。此外，利用“自上而下”和“自下而上”构建的微生物组都含有2个以上的菌株，“自上而下”构建的微生物组中还包含很多不可培养物种，因此在保持功能稳定性的前提下如何进行连续扩大培养一直是其规模化应用的瓶颈。
1.3.4 开放系统中构建微生物组的建议针对用于开放系统微生物组稳定性的问题，首先在构建微生物组时应参考实际应用场景的环境条件波动情况，将环境条件波动应用于高效微生物组的筛选中；其次，深入研究微生物组中物种间的高阶相互作用及群落结构和功能对环境条件波动的响应，可为稳定微生物组的构建奠定坚实的理论基础。对于“自下而上”合成微生物组方向，可选择功能互补的物种进行构建，也可通过比较微生物组靶向选择富集物种进行构建。在物种选择时应充分考虑安全性。此外，利用代谢网络模型预测技术可实现物种选择的科学性和效率，也可模拟不同环境因子干扰对微生物组稳定性的影响，因此可大力推动稳定微生物组的理性高效合成。对于“自上而下”构建用于开放环境的微生物组，可综合利用富集驯化、人工选择、磁性选择等构建用于开放环境的功能微生物组，并利用多组学、数学建模等对其进行解析和优化。在微生物组的作用机理指导下，可通过控制代谢底物、环境因子、时空秩序等实现微生物组的共培养，从而推动其的规模化应用。此外，针对物种较少的微生物组也可采取单菌发酵，使用时再混合的方法。总之，对于用于开放系统的微生物组，建议综合采用“自上而下”和“自下而上”相结合的策略构建高效、稳定的功能微生物组，优化共培养发酵技术，以实现功能微生物组的规模化应用。
2 展望根据应用场景的差异，我们针对封闭系统、半封闭系统及开放系统提出并实践不同的微生物群落构建策略，每种微生物组构建都需要根据特定的条件和需求，做到提高效率与系统稳定的平衡，且每一种系统都面临着不同的挑战和机遇(图 3)。
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| 图 3 不同应用场景微生物组构建策略的侧重与平衡 Figure 3 Emphasis and balance of microbiome construction strategies in different application scenarios. |
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对于封闭系统，应以精细化管理和控制为主要发展方向。由于封闭系统与外界无交流，效率可以成为首要考虑的因素，通过深入理解微生物间相互关系并通过精确控制微生物种群比例以提升群落效能，并有望在固液培养、内环境条件调节等方面取得新突破。此外如何选择功能菌种以及构思菌种的合成方式以利于形成共代谢或者接力代谢并具有稳定的功能也是一个发展方向与重大挑战。
对于半封闭系统和开放系统的微生物群落构建策略则更为复杂。由于这2种系统都存在着与外界环境的物质和能量交换，需求复杂性与微生物群落稳定性之间的矛盾更大。构建策略上不仅要求微生物群落有稳定性，也需要有适应性，以应对环境的持续变化和菌群复杂性带来的挑战。在这种情况下，稳定性会居于更重要的位置，并且也要重点考虑生物安全，避免由于过度改造对周边环境造成干扰。因而开发多元的新材料载体以截留合成微生物组、稳定菌群功能，同时如何利用自然界中的土著菌来实现预期目标也是未来的发展方向之一。
总而言之，未来的微生物组工程将需要更加深入地理解菌种间的内在关系，发展更加精确的构建组装策略，以适应不同场景的应用需求。
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