2023, Vol. 50扩展功能
文章信息
- 夏远舰, 杨小丽, 李海华, 赵博
- XIA Yuanjian, YANG Xiaoli, LI Haihua, ZHAO Bo
- 异养硝化-好氧反硝化菌Acinetobacter johnsonii sp. N26的脱氮性能及代谢途径
- Optimization of nitrogen removal performance and metabolic pathway of a heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacterial strain Acinetobacter johnsonii sp. N26
- 微生物学通报, 2023, 50(4): 1374-1395
- Microbiology China, 2023, 50(4): 1374-1395
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220732
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文章历史
- 收稿日期: 2022-08-05
- 接受日期: 2022-10-06
- 网络首发日期: 2022-11-14
生活污水和工农业废水中含氮物质的处理一直是城市污水处理中能耗最高、技术难度最大的关键环节，也是污水处理行业节能降耗、减少碳排放的关键，因此脱氮技术一直是水处理领域的热门研究内容[1]。目前一般采用物理法、化学法、生物法等来处理废水中的含氮物质，其中生物法由于处理成本相对较低，应用最为广泛[2]。传统的生物法一般需要经历2个步骤，即自养菌的好氧硝化过程和异养菌的厌氧反硝化过程[3]，这2个步骤对外界条件的需求不一致，致使完整脱氮过程难以在同一容器中进行，造成污水处理建设成本和资源消耗高等一系列问题[4-5]；并且由于自养硝化细菌生长缓慢、产能较低、世代时间长、在冬季难以维持较高的生物浓度，致使硝化效果不佳[6]。
传统生物法脱氮在现实应用中存在许多不足，因此需要探求一种高效、新型的方法，其中就包括分离筛选出新型脱氮菌种。该菌种的特性在于能挣脱传统生物脱氮理论的束缚，即在异养和自养、厌氧和好氧微生物之间，选择既符合生物科学基础，又能够满足实际工程需要的合适菌种，并在确定该菌种的种属的基础上研究其脱氮特性和脱氮机理[7]。Robertson等[8]在1983年从废水中发现了特殊菌种Paracoccus pantotrophus，与传统生物脱氮菌种不同的是，该菌种能够在硝化过程中利用外界碳源作为能量基础，并且可以同时完成好氧反硝化，因此提出了异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)的概念。此后，中外研究者依据这个概念筛选、分离出了众多HN-AD菌种，如Acinetobacter junii WZ17[9]、Acinetobacter junii YB[10]、Pseudomonas stutzeri T13[11]、Fusarium sp. A60[12]等。HN-AD菌种分布广泛，在细菌、真菌的多个种属均有发现，目前已鉴定出了20多个功能属，这些微生物以其对氨氮的高耐受性、高效的脱氮能力和较强的pH适应性而受到越来越多的关注[13]。它们不仅具有比自养硝化菌更快的生长速度，而且还可以利用碳源作为好氧条件下硝化-反硝化的能量和电子来源[14]。此外，HN-AD菌异养硝化的产物可以作为好氧反硝化的反应物，因此硝化-反硝化可以在同一容器内同步进行，从而使同步硝化-反硝化成为可能[15]；硝化产生的中间产物在短时间内作为反应物直接被反硝化，从根本上避免了硝酸盐和亚硝酸盐的积累带来的问题[16-17]。总而言之，HN-AD菌较适合应用于处理大规模水体氮元素的污染，具有节约处理时间、提高去除效率、节省建设成本等优点[18]。然而，异养硝化-好氧反硝化需要全程投加碳源，这也使得该方法面临物料成本增加和额外的COD污染等问题；并且不同菌种的脱氮性能和所需的施加条件不一，需要研究者在研究中总结；另外，研究者对这类微生物的研究仍处于初始阶段，而对于脱氮机理及理论的研究则更为少见，想要发挥此类菌种的最大优势，仍需要大量的研究来实现[19]。
为研究某一高效HN-AD菌的脱氮性能和代谢途径，作者首先对自然界一些潜在的具有硝化活性能力的菌种进行筛选，经过筛选认为其中一株在亲缘上最接近不动杆菌属的Acinetobacter johnsonii sp. N26最具备研究价值。本文主要研究Acinetobacter johnsonii sp. N26的异养硝化-好氧反硝化脱氮性能和代谢途径，活化菌种N26并对其进行功能基因鉴定，通过功能基因鉴定结果和氮平衡分析研究该菌种的代谢途径，揭示该菌种的氮代谢机理。
本文的重点与难点在于，通过将表观的生长及脱氮表现与内在的功能基因及关键酶建立联系，构建菌种的脱氮路径，分析菌种的脱氮机理。赵天涛等[7]认为，目前关于HN-AD菌的研究主要集中在菌株的分离鉴定、脱氮影响因素和关键酶分析等方面，具体的脱氮机制尚缺乏系统清晰的认识和总结。Song等[20]认为，一些异养硝化-好氧反硝化菌种存在同时的短程硝化-反硝化行为，该表述为作者研究其脱氮途径提供了思路。异养硝化-好氧反硝化是一种具有广阔前途的脱氮方法，但目前仅停留在理论研究和实验测试阶段，优化其脱氮性能并揭示其脱氮途径，有助于为未来异养硝化-好氧反硝化的理论完善和实际应用提供参考[21-23]。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种实验菌种采集于河南省某养殖场羊粪堆肥，通过实验室的富集培养和菌株分离，鉴定为不动杆菌属，命名为Acinetobacter johnsonii sp. N26，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2022462。
1.1.2 培养基基础培养基(g/L)：蛋白胨10.00，牛肉膏3.00，氯化钠5.00，琼脂15.00，pH 7.3±0.1；富集培养基(g/L)：氯化铵0.10，乙酸钠1.34，另加维氏盐溶液50 mL，pH 7.0；氨氮培养基(g/L)：氯化铵0.19，丁二酸钠4.22，另加维氏盐溶液50 mL (初始氨氮浓度50 mg/L，C/N为15)，pH 7.0±0.2；硝酸盐氮培养基(g/L)：硝酸钠0.30，丁二酸钠4.22，另加维氏盐溶液50 mL (初始硝酸盐氮浓度50 mg/L，C/N为15)，pH 7.0±0.2。维氏盐溶液(g/L)：磷酸氢二钾5.00，七水硫酸镁2.50，氯化钠2.50，七水硫酸亚铁0.05，四水硫酸锰0.05。
以上培养基用250 mL锥形瓶装液100 mL，用高压灭菌锅于0.11 MPa灭菌20 min，用稀盐酸溶液和氢氧化钠溶液调整至需要的pH值，备用。
1.1.3 主要试剂和仪器化学试剂均为国产分析纯；PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Perfect Real Time)，TaKaRa公司；HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix (low Rox)，上海翊圣生物科技有限公司；PCR引物，苏州金唯智生物科技有限公司。水浴恒温振荡器，常州金坛旭日实验仪器厂；洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；基因扩增仪，杭州博日科技股份有限公司；荧光定量PCR仪，赛默飞世尔科技公司。
1.2 方法 1.2.1 生长与脱氮曲线的测定挑取N26单菌落接种于富集培养基中，用摇床30 ℃、120 r/min培养24 h，作为菌种活化液备用。将菌种活化液摇匀，按15%接种量接种至100 mL氨氮培养基和硝酸盐氮培养基中，30 ℃、120 r/min培养36 h，每3 h取样检测。以同类型的空白培养液作为空白对照，测定样品的OD600、氨氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮(浊液)和总氮(清液)的浓度，其中总氮(浊液)为直接取样后进行消解、测定，总氮(清液)为取样后用真空抽滤机过滤掉水中悬浮物和沉淀，然后进行消解、测定[24]。
1.2.2 脱氮性能的优化在上述培养基成分和实验操作的基础上，按照单因素试验的原理，分别改变氨氮培养基的氮源种类(尿素、氯化铵、硫酸铵、蛋白胨)；氨氮、硝酸盐氮培养基的碳源种类(无碳源、葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠)，温度(10、20、30、40、50 ℃)，接种量(1%、5%、10%、15%、20%、25%)，pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，C/N (0、5、10、15、20、25)，转速(0、30、60、90、120、150 r/min)，氮负荷(50、100、150、200、300、400、800 mg/L)，对菌种N26进行培养条件优化实验，摇床培养72 h，每12 h取样检测OD600以及氨氮、硝态氮的浓度，并计算氨氮、硝态氮相对0 h时的去除率。
1.2.3 功能基因的鉴定功能基因的鉴定委托复旦大学上海复达检测集团完成。用荧光定量PCR扩增的方法鉴定功能基因，检测的功能基因有amoA、narG、napA、nirS/nirK、nor、norB及nosZ等，分别采用amoA-F1/amoA-R1、narG-F1/narG-R1、napA-F3/napA-R3、nirS-F1/nirS-R1、nor-F1/nor-R1、norB-F1/norB-R1、nosZ-F1/nosZ-R1等作为扩增引物，引物序列如表 1所示。
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) |
| amoA-F1 | CCCTCATCATGGACACCGTC |
| amoA-R1 | CAGGAAGCCGGTGTAGTCAG |
| narG-F1 | TGTCCATGGTCTCCTACGCA |
| narG-R1 | TAGAAGCTCATGCAGACGCC |
| napA-F3 | AGAGAAAGAGGGCGCTTACG |
| napA-R3 | GGCGGGAGAACTGGACTAAC |
| nirS-F1 | TCAACAACCTGCAGGAGACC |
| nirS-R1 | CACCTTGTCGGACTGGTTGG |
| nor-F1 | CGAGTGGATTCCGATCCAGG |
| nor-R1 | CGATGAAGTACGGCACCTGA |
| norB-F1 | ACCCGCGACAAGTTCTACTG |
| norB-R1 | GCACCCATGATCAGTTCCCA |
| nosZ-F1 | TGTCGGTCTCCAAGTTGACG |
| nosZ-R1 | CTCACGATTGCATCATGGCG |
总RNA抽提：使用TaKaRa的试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit (perfect real time)进行总RNA的抽提。将经过前处理的样品进行相分离，然后将沉淀、洗涤后的RNA沉淀空气干燥5 min，加入适量DEPC处理水溶解RNA沉淀，用分光光度计测定RNA浓度和纯度。
反转录PCR反应体系：5×PrimeScript Buffer (for real time) 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，引物Oligo dT (50 μmol/L) 1 μL，Random 6 mers (100 μmol/L) 1 μL，总RNA样品1 μg，RNase Free dH2O补足20 μL。在37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，−20 ℃保存备用。
定量PCR反应体系：HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix (low Rox) 10 μL，Forward primer和Reverse primer (10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA (稀释比1:10) 2 μL，RNase Free ddH2O补足20 μL。定量PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，然后进行荧光采集。反应结束后，进行60−90 ℃熔解曲线分析。
1.3 分析方法NH4+-N的测定采用纳氏试剂分光光度法[25]；NO3−-N的测定采用紫外分光光度法[26]；NO2−-N的测定采用分光光度法[27]；TN的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[28]；OD600采用紫外分光光度计测定[29]。
2 结果与分析 2.1 生长曲线与脱氮曲线测定菌株N26在液体氨氮培养基和硝酸盐氮培养基中不同时刻的OD600，以及氨氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮的浓度，绘制菌株N26的生长曲线与脱氮曲线。其中总氮的测定分为总氮(清液)和总氮(浊液)两个部分，总氮(清液)的浓度是指水中可溶性含氮物质的浓度，总氮(浊液)的浓度是指水中所有含氮物质的浓度，浊液减去清液的差值约等于水中细胞体的含氮量。
由图 1A可见，以氨氮为唯一氮源时，初始OD600为0.075；在0−15 h，微生物进入对数生长期，N26菌株的数量迅速增加，15 h时OD600值为1.055；随后在15−24 h进入稳定期，OD600保持稳定，期间最大数值为1.085；在24−36 h进入衰亡期，细胞的分解代谢大于合成代谢，细菌死亡速度大于新生成的速度，整个群体出现负增长。氨氮浓度在0−9 h急剧下降，从0 h的50.253 mg/L下降到9 h的2.282 mg/L，最大去除速率为5.330 mg/(L·h)，9 h去除效率为95.5%；在此后的27 h，培养基中的氨氮浓度一直维持在1 mg/L以下的状态，36 h的氨氮去除率几乎达到100%。硝态氮(NO3−-N)从0 h到36 h一直保持浓度接近为零的状态，变化起伏不大。亚硝态氮(NO2−-N)在0−3 h内从0上升到13.187 mg/L随后逐渐降低，直到21 h几乎完全去除。总氮(清液)在0−12 h内从56.184 mg/L迅速下降到9.874 mg/L，去除速率为3.859 mg/(L·h)；随后在12−21 h去除速率降低，去除速率为0.848 mg/L；总氮(清液)在21 h去除率已经达到96.0%，36 h去除率则为98.4%，总氮(清液)的低残留率标志着在36 h氨氮、硝态氮、亚硝态氮等水中溶解态氮几乎被同步去除，并且该去除过程与菌体的快速生长保持同步。总氮(浊液)在0−36 h保持稳定下降的趋势，从0 h的56.188 mg/L下降到36 h的37.913 mg/L，去除速率为0.507 mg/(L·h)，去除效率为32.5%。
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| 图 1 以氨氮(A)、硝态氮(B)为氮源时菌株N26的生长和脱氮曲线 Figure 1 The growth and nitrogen removal curve of strain N26 when NH4+-N (A), NO3−-N (B) as nitrogen source. |
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由图 1B可见，以硝态氮为唯一氮源时，OD600初始为0.075，在0−15 h，微生物进入对数生长期，N26菌株的数量迅速增加，15 h时OD600值为1.025；在15−18 h进入短暂的稳定期，生长增速放缓，OD600从1.025增至1.085；随后在18−36 h进入衰亡期，整个微生物群体一直保持负增长的态势，最终在36 h的OD600为0.72。氨氮在36 h内浓度无明显变化，一直维持在接近为零的状态。硝态氮浓度的降低与菌株的快速生长保持同步，从0 h的50.418 mg/L迅速下降到15 h的3.210 mg/L，最大去除速率为3.147 mg/(L·h)，15 h去除效率为93.6%；在此后的21 h，硝态氮维持在3.000 mg/L以下的低浓度，36 h去除率几乎达到100%[30]。亚硝态氮在0−15 h内从0上升到14.918 mg/L，随后逐渐降低，直到30 h几乎完全去除。总氮(清液)在0−9 h迅速下降，去除速率为2.713 mg/L，这是因为随着菌株的快速增殖，其硝化-反硝化能力也处于最强的阶段，中间产物亚硝态氮被迅速反硝化去除；在9−15 h阶段，随着培养基中亚硝态氮的持续增加，总氮(清液)的降速放缓；随着亚硝态氮在15 h达到最大值后持续下降，总氮(清液)在15−36 h也加大了下降的趋势，直到降到36 h的1.939 mg/L，36 h去除率为96.1%。总氮(浊液)在0−36 h保持稳定下降的趋势，从0 h的50.802 mg/L下降到36 h的42.214 mg/L，去除速率为0.239 mg/(L·h)，去除效率为16.9%。
2.2 脱氮性能优化结果 2.2.1 不同氮源对脱氮性能的影响由于水体氮污染的初始污染因子主要是氨氮，因此选取尿素、氯化铵、硫酸铵及蛋白胨作为初始氮源，碳源统一为丁二酸钠，通过调整氮源投加量，使初始氨氮、总氮含量基本相同(蛋白胨的投加量为折算结果)。尿素、蛋白胨为常见的有机氮污染物，氯化铵、硫酸铵为常见的氨氮污染物，这4种含氮物质可基本代表水体氮污染的初始形态。由图 2可见，菌株N26在不同氮源中生长和脱氮情况各有异同。相同之处是：细菌数量均总体呈现先升高再降低的过程，菌株N26在0−36 h进入生长期，36 h后进入稳定期和衰亡期；在菌株生长的同时，氨氮的去除率也随之上升，72 h的氨氮去除率就接近100%。不同之处是：菌株N26以氯化铵为氮源时的生长情况最好，以尿素为氮源时的生长情况最差；菌株N26以氯化铵为氮源时的硝化能力最好，以蛋白胨为氮源时的硝化能力最差。菌株N26在尿素中的活性较低，可能是缺少代谢尿素的酶，而尿素则对菌株的生长有毒害作用；蛋白胨作为有机氮，要先经历氨化过程才能被转化为NH4+，这影响了菌株N26的脱氮代谢过程；在氮源种类均为氨氮的情况下，菌株在氯化铵的生长和脱氮效果优于硫酸铵。综合分析认为以氯化铵为氮源时，菌株N26的生长和脱氮能力达到最佳。
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| 图 2 氮源对菌株N26生长(A)及脱氮(B)的影响 Figure 2 Effects on strain N26 growth (A) and nitrogen removal (B) by nitrogen sources. |
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通过改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的碳源种类(无碳源、葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠[31])，研究碳源对脱氮性能的影响。能否利用外界碳源是判别微生物为异养还是自养的标准，通过监测菌株N26分别在有、无碳源液体培养基中的生长和脱氮情况，判断其是否为异养微生物。在异养微生物的生长繁殖过程中，需要利用外界碳源为细胞的生长提供骨架和生命活动所需的能量，为微生物的正常生长繁殖提供物质基础。不同碳源的化学构成存在差异，因此微生物对碳源的利用程度也不同，选择最适碳源有利于使菌株的生长和脱氮达到最佳效果，缩短反应时间，节约投加成本。由图 3A和图 3B可见，菌株N26在含碳源的培养基中生长情况好于无碳源时，并且在氨氮中的生长情况总体上好于硝态氮，说明菌株N26利用外界碳源增殖并完成脱氮，是异养硝化过程[32]。在5种不同碳源的培养基中，菌株N26的生长均呈现快速增殖到保持稳定的趋势。在氨氮环境下，菌株N26利用葡萄糖作为碳源时生长情况最好，其次是丁二酸钠，利用乙酸钠时生长情况最差；在硝态氮环境下，菌株N26对葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠等碳源的利用情况相差不大，其中以丁二酸钠最好。结果表明，不同碳源对菌株N26生长的影响效果不同；其中葡萄糖和蔗糖为大分子有机碳源，丁二酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠为小分子有机碳源，菌株N26更倾向于利用小分子有机物作为碳源并展现高效的脱氮效率[33]。由图 4A和图 4B可见，菌株N26利用以上5种碳源对氨氮和硝态氮的72 h去除率均能达到79%以上，其中以利用丁二酸钠的效果最好，氨氮的24、48、72 h去除率分别为95.4%、99.6%、99.8%，几乎达到100%去除；硝态氮的24、36、72 h去除率分别为84.2%、90.4%、95.9%；在不添加碳源时，72 h的氨氮和硝态氮去除率仅为15.7%和4.2%。综合以上数据及分析，菌株N26在生长中的脱氮过程是异养硝化-反硝化过程，以丁二酸钠作为碳源时，菌株N26的生长及脱氮效果最好[34]。菌株N26在利用葡萄糖时生长迅速，但脱氮效果却不如丁二酸钠和柠檬酸钠的原因可能是：菌株利用葡萄糖将溶解态氮大量转化为胞内氮，胞内氮在菌体凋亡解体之后又重新被释放到水中；另一种可能是菌株利用大分子有机物所产生的代谢产物对氨氮的测定造成了一定干扰[35]。
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| 图 3 碳源对菌株N26生长的影响 Figure 3 Effects of growth on strain N26 by carbon sources. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 4 碳源对菌株N26脱氮的影响 Figure 4 Effects of nitrogen removal on strain N26 by carbon sources. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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温度对微生物的生理活性造成影响，在生物法处理含氮废水时，需要严格控制反应的温度，使其达到最佳效果。只改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的外界温度(10、20、30、40、50 ℃)，研究温度对脱氮性能的影响。由图 5A和图 5B可见，菌株N26在温度为20−40 ℃时生长情况较好，其中在氨氮环境下，40 ℃为最适生长温度，在硝态氮环境下，30 ℃为最适生长温度；当温度过低(10 ℃)和温度过高(50 ℃)时，菌株N26在氨氮和硝态氮环境下均无明显增殖。在同一温度下，菌株N26在氨氮环境下的生长情况比在硝态氮环境下更好。由图 6A可见，在温度为20−40 ℃时，菌株N26硝化能力较强，72 h氨氮去除率在98%以上，其中当温度为30−40 ℃时，24 h氨氮去除率即可达到89%，去除速率较快，20 ℃时则较为缓慢；当温度过低(10 ℃)和温度过高(50 ℃)时，菌株N26硝化能力变弱，10 ℃、50 ℃时72 h氨氮去除率分别仅为32.4%、4.9%。由图 6B可见，当温度为30 ℃时，菌株N26的反硝化效果最好，24、48、72 h硝态氮去除率分别为71.8%、78.8%、83.0%，当温度过低(10 ℃)和温度过高(50 ℃)时，菌株N26反硝化能力较弱，10 ℃、50 ℃时72 h硝态氮去除率分别仅为19.3%、4.8%。由于菌株N26的硝化和反硝化的最适温度不一，虽然40 ℃最适合硝化作用，但一定程度上也会抑制反硝化作用，而30 ℃时菌株N26的硝化能力与40 ℃时基本持平，因此认为30 ℃为菌株N26硝化和反硝化的最适温度。综合以上数据及分析，30 ℃是菌株N26生长和脱氮的最适温度。
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| 图 5 温度对菌株N26生长的影响 Figure 5 Effects of growth on strain N26 by temperature. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 6 温度对菌株N26脱氮的影响 Figure 6 Effects of nitrogen removal on strain N26 by temperature. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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通过只改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的接种量(1%、5%、10%、15%、20%、25%)，研究接种量对脱氮性能的影响。由图 7A和图 7B可见，随着接种量的增加，菌株N26的密度总体呈现先上升再降低的趋势，当接种量为15%时，菌株N26在氨氮和硝态氮的环境下生长效果最好；当接种量为20%时，由于菌株N26初始浓度过高，造成溶解氧和营养物质不足使细菌生长缓慢。在同一接种量时，菌株N26在氨氮环境下的生长情况比在硝态氮环境下更好。由图 8A可见，当接种量在5%−20%之间时，菌株N26硝化能力基本持平，12 h氨氮去除率68.3%−80.2%之间，24 h氨氮去除率最低为接种5%时的89.2%，最高为接种15%时的98.9%；当接种量为1%时，菌株N26硝化速率缓慢，24、72 h氨氮去除率分别为35.2%、83.2%。由图 8B可见，随着接种量的增加，菌株N26的反硝化能力总体上呈现先上升后下降的趋势，当接种量在15%时，反硝化能力最强，12、24、48 h硝态氮的去除率分别为64.6%、87.9%、91.1%；当接种量为1%时，菌株N26反硝化速率缓慢，24、72 h硝态氮去除率分别为32.8%、70.9%。综合以上数据及分析，15%是菌株N26生长和脱氮的最佳接种量。
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| 图 7 接种量对菌株N26生长的影响 Figure 7 Effects of growth on strain N26 by inoculation volume. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 8 接种量对菌株N26脱氮的影响 Figure 8 Effects of nitrogen removal on strain N26 by inoculation volume. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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通过只改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，研究pH对脱氮性能的影响。由图 9A、9B可见，在同一时刻，当外界环境的pH值从4.0上升到10.0时，菌株N26在氨氮和硝态氮环境下的生长情况均呈现先上升后降低的趋势，其中在氨氮环境下pH 8.0时生长情况最好，在硝态氮环境下pH 9.0时生长情况最好。由图 10A、10B可见，pH < 7.0或pH 10.0时，菌株N26的硝化和反硝化能力较差；在氨氮环境下pH 8.0时硝化能力最强，12、24、48 h氨氮去除率分别为87.3%、98.7%、99.6%；在硝态氮环境下pH 9.0时反硝化能力最强，12、24、48 h硝态氮去除率分别为56.2%、83.7%、98.9%。由图 11A、11B可见，当初始pH值在4.0−10.0之间时，经过72 h的硝化和反硝化作用，外界环境的pH值均变为8.7−8.9左右(硝态氮环境下pH 4.0时除外)，因此认为菌株N26适于在弱碱环境中生长。在酸性环境下，菌株N26的活性较低，环境pH变化缓慢，但随着菌株数量的缓慢增长，菌体代谢产生的碱性物质缓慢提升水体环境的pH，当整体环境达到偏碱性时，菌株N26的生长速率明显上升。综合以上数据及分析，8.0−9.0是菌株N26生长和脱氮的最佳pH区间。
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| 图 9 pH对菌株N26生长的影响 Figure 9 Effects of growth on strain N26 by pH. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 10 pH对菌株N26脱氮的影响 Figure 10 Effects of nitrogen removal on strain N26 by pH. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 11 不同初始pH下，环境pH随着脱氮进程的变化情况 Figure 11 The change of pH with nitrogen removal process under different initial pH. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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C/N是指培养基中碳的总含量与氮的总含量的比值，是生物法处理含氮废水的重要指标，选择合适的C/N有利于微生物发挥最大功效[36]。通过只改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的C/N (0、5、10、15、20、25)，研究C/N对脱氮性能的影响。由图 12A、12B可见，随着C/N的上升，菌株N26在氨氮和硝态氮中的生长情况均呈现先上升后下降的趋势；当C/N在15−25之间时，菌株N26的生长情况较为接近，C/N为25时出现了细菌凋亡速率较快的情况，分析认为有以下3种可能：(1) C/N过高抑制了相关还原酶的活；(2) C/N过高为其他菌种的生长提供了充足碳源，抑制了菌株N26的增殖，Pan等[37]的报道认为，随着环境中碳源的过剩，其他异养细菌的丰度随着C/N的增加而增加；(3) C/N过高造成中间产物的累积，刘天琪等[21]对Pseudomonas ADN-42的报道与之类似；当C/N≤10时，菌株N26的生长速度较为缓慢，最终的菌液密度也比较低，无碳源时则细菌几乎无增殖。因此认为过高或过低的C/N均不利于菌株N26的生长，较适宜的C/N为15−20。由图 13A、13B可见，随着C/N的上升，菌株N26的硝化和反硝化能力逐渐提升，并在C/N为15−25维持稳定；C/N为15时，氨氮环境下12、24、48 h氨氮去除率分别为86.5%、96.4%、98.3%，硝态氮环境下12、24、48 h硝态氮去除率分别为60.3%、80.3%、87.3%；C/N为10时，72 h氨氮和硝态氮去除率分别为96.3%、64.9%，氨氮虽然接近100%去除，但水中的硝态氮仍维持较高的水平。无碳源时硝态氮出现反向增加的情况，分析认为是细菌的凋亡分解，菌体内的含氮物质进入水中而影响硝酸盐氮的浓度测定[4]。综合以上数据及分析，菌株N26生长和脱氮的最佳C/N区间为15−20，由于C/N的上升会带来成本增加和残留COD等问题，因此认为菌株N26生长和脱氮的最佳C/N等于15。
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| 图 12 C/N对菌株N26生长的影响 Figure 12 Effects of growth on strain N26 by C/N. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 13 C/N对菌株N26脱氮的影响 Figure 13 Effects of nitrogen removal on strain N26 by C/N. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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通过只改变氨氮培养基、硝酸盐氮培养基的外部摇床转速(0、30、60、90、120、150 r/min)，研究转速对脱氮性能的影响。在0−150 r/min的转速区间内，摇床转速与摇瓶的溶解氧浓度呈正相关(图 14)。由图 15A和图 15B可见，转速为0时，水中溶解氧(dissolved oxygen, DO)对应含量为4.9 mg/L，此时菌株N26的生长处于被抑制状态；随着DO的上升，菌株N26的生长情况逐渐变好，证明菌株N26的生长是好氧过程。菌株N26生长的最适转速为120 r/min，对应的DO含量为7.2 mg/L，Chen等[23]报道的Agrobacterium sp. LAD9最适DO范围为7−8 mg/L，与之类似。当转速从120 r/min上升到150 r/min时，菌株N26的生长出现了放缓甚至减弱的情况，分析认为水中DO饱和使细菌生长放缓或转速过大产生的较大剪切力使菌体受到物理损害。由图 16A、16B可见，转速为0时，水中DO含量较低，菌株N26的硝化和反硝化能力较弱，随着DO含量的上升，硝化和反硝化能力得到提高，证明菌株N26的脱氮是好氧硝化-反硝化过程。由于转速过高时细菌的生长放缓或减弱，因此相应转速下去除氨氮和硝态氮的能力也受到抑制。转速为120 r/min时，氨氮环境下12、24、48 h氨氮去除率分别为75.2%、89.2%、98.1%，硝态氮环境下12、24、48 h硝态氮去除率分别为38.6%、65.0%、83.0%；转速上升到150 r/min，同一时刻氨氮去除率下降，硝态氮去除率小幅度提高[38]。综合以上数据及分析，菌株N26在生长中的脱氮过程是异养硝化-好氧反硝化过程，120 r/min是菌株N26生长和脱氮的最佳转速，对应的DO含量约为7.2 mg/L。
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| 图 14 摇床转速与DO的关系 Figure 14 Relationship between rotating rate and DO. |
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| 图 15 转速对菌株N26生长的影响 Figure 15 Effects of growth on strain N26 by rotating rate. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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| 图 16 转速对菌株N26脱氮的影响 Figure 16 Effects of nitrogen removal on strain N26 by rotating rate. A：氨氮. B：硝态氮 A: NH4+-N. B: NO3−-N. |
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通过只改变氨氮培养基的氮负荷(50、100、150、200、300、400、800 mg/L)，研究菌株N26的最适氮负荷。由图 17A可见，低氨氮环境下，随着初始氨氮浓度上升，菌株N26的生长情况逐渐变好，氨氮浓度≥200 mg/L时，菌种密度已趋于饱和；高氨氮环境下抑制菌株N26的生长，细菌活性降低。由图 17B可见，当初始氨氮浓度分别为50、100、150、200 mg/L时，菌株N26脱氮效率较高，12 h氨氮去除率分别为75.3%、67.2%、59.7%、49.4%，24 h氨氮去除率分别为94.9%、91.8%、88.6%、64.6%，72 h氨氮去除率均在95%以上；24 h氨氮去除速率分别为1.981、3.799、5.516、5.328 mg/(L·h)。当初始氨氮浓度≥300 mg/L时，氨氮去除速率较为缓慢，当初始氨氮浓度分别为300、400、800 mg/L时，12 h氨氮去除率分别为37.9%、21.0%、3.1%，24 h氨氮去除率分别为56.6%、34.0%、5.8%；72 h氨氮去除率分别为73.1%、53.0%、18.2%，24 h氨氮去除速率分别为7.083、5.640、1.931 mg/(L·h)。由此可以看出，菌株N26适宜在低氨氮的环境下生存，当氨氮浓度过高时，菌株N26的生长和硝化能力未得到提升。实验表明，菌株N26在低氨氮浓度(≤300 mg/L)条件下有较高的氨氮去除率，且能在高氨氮浓度(800 mg/L)环境生长脱氮，但高浓度氨氮会抑制菌株N26的生长速率和脱氮效率[39]。
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| 图 17 氮负荷对菌株N26生长(A)及脱氮(B)的影响 Figure 17 Effects on strain N26 growth (A) and nitrogen removal (B) by nitrogen load. |
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研究菌株N26的脱氮途径是开发其脱氮性能的重要一环，该环节主要通过表观的氮平衡分析和微观的功能基因鉴定来实现。在生物法处理含氮废水的过程中，含氮物质主要有被同化为胞内氮、被异化为气态氮以及作为溶解态氮残留在水中3个去向，通过定量分析水中氮的去向，建立0−36 h的氮平衡，可以得知NH4+-N、NO3−-N和NO2−-N的利用效率、利用能力的先后顺序。通过功能基因鉴定，不但能够进一步确定菌株N26是否为异养硝化-好氧反硝化菌，还能根据特定功能基因的关键酶分析NH4+-N、NO3−-N、NO2−-N的转化方向。氮的生物代谢途径多种多样，好氧环境下氨氮被异养菌代谢时，脱氮途径有全程反硝化和短程反硝化两种[40]，目前已成功分离的全程反硝化菌种有Bacillus cereus GS-5[41]和Acinetobacter sp. ND7[3]等，而Acinetobacter johnsonii sp. N26是一种可能的短程反硝化菌。
由表 2可见，氨氮、硝态氮作为氮源时，36 h残留硝酸盐浓度分别为0.096、0.214 mg/L，亚硝酸盐浓度分别为0.079、0.097 mg/L，最终水中保持较低的硝酸盐和亚硝酸盐积累水平，表明菌株N26具有高效的脱氮能力。在生物脱氮过程中，氮的转化途径有两条：一是被微生物同化成胞内氮；二是被微生物异化成气态氮。水中含氮物质被异化成气态氮越多，水中剩余的总氮就越少。通过比较0 h与36 h各部分氮的变化，分析了菌株N26脱氮的氮平衡。根据氮平衡计算，当氮源为氨氮时，初始TN的32.5%转化为气态氮，65.9%同化为胞内氮，只有1.6%作为溶解氮留在水中；当氮源为硝态氮时，初始TN的16.9%转化为气态氮，79.3%同化为胞内氮，只有3.8%作为溶解氮留在水中。由此可以看出菌株N26的异化效率上氨氮 > 硝态氮。
| Nitrogen source | Time (h) | NH4+-N(mg/L) | NO3‒-N(mg/L) | NO2‒-N(mg/L) | TN (turbid)(mg/L) | Intracellular-N(mg/L) | Proportion(%) | Gaseous-N(mg/L) | Proportion (%) |
| NH4Cl | 0 | 50.253±2.231 | 1.467±0.513 | 0.079±0.000 | 56.188±2.104 | 0.004 | 0.0 | 0.000 | 0.0 |
| 36 | 0.018±0.037 | 0.096±0.032 | 0.079±0.031 | 37.913±0.254 | 37.028 | 65.9 | 18.275 | 32.5 | |
| NaNO3 | 0 | 0.900±0.231 | 50.418±1.543 | 0.097±0.000 | 50.802±2.254 | 0.553 | 0.0 | 0.000 | 0.0 |
| 36 | 0.753±0.033 | 0.214±0.037 | 0.097±0.036 | 42.214±0.255 | 40.275 | 79.3 | 8.588 | 16.9 |
由表 3可见，菌株N26在异化过程中，amoA是氨单加氧酶的功能基因，nirS/nirK是亚硝酸盐还原酶的功能基因，nor是亚硝酸盐氧化还原酶的功能基因[42]，菌株N26具有amoA和nirS/nirK，但无nor，表明菌株N26直接将氨氮硝化为亚硝态氮，无中间产物硝态氮，表明氨氮的硝化过程遵循NH4+-N→NO2−-N→NO的转化途径。napA是周质硝酸盐还原酶的功能基因[43]，narG是呼吸硝酸盐还原酶的功能基因，菌株N26具有napA但无narG，表明菌株N26通过好氧途径将硝态氮转化为亚硝态氮，硝态氮的转化途径为NO3−-N→NO2−-N→NO[44]；Padhi等[45]的研究指出，经PCR扩增出的nap基因为Klebsiella pneumoniae CF-S9异养硝化-好氧反硝化提供了额外的证据。菌株N26有norB和nosZ，表明其在反硝化过程中遵循NO2−-N→NO→N2O→N2的转化途径。生长和脱氮曲线证明菌株N26硝化氨氮的能力强于硝化硝态氮的能力，氮平衡分析证明氨氮被异化为含氮气体的效率高于硝态氮，硝态氮被同化为胞内氮的比例高于氨氮，由此推测amoA功能基因的表达能力强于napA功能基因。菌株N26在同化过程中，通过GDH控制的氨同化酶直接吸收氨氮到细胞内，氨氮被硝化成亚硝态氮后，部分亚硝态氮通过功能基因nirB被还原成氨氮仍被同化，而功能基因nasA和nirB则将硝态氮还原为氨氮再将其同化[7]。
| Functional genes | Key enzymes | Functions | Direction | Identification results |
| amoA | Ammonia monooxygenase | NH4+-NO2− | Dissimilation | + |
| narG | Respiratory nitrate reductase | NO3−-NO2− (anaerobic) | Dissimilation | – |
| napA | Periplasmic nitrate reductase | NO3−-NO2− (aerobic) | Dissimilation | + |
| nirS/nirK | Nitrite reductase | NO2−-NO | Dissimilation | + |
| nor | Nitrite oxidoreductase | NO2−-NO3− | Dissimilation | – |
| norB | Nitric oxide reductase | NO-N2O | Dissimilation | + |
| nosZ | Nitrous oxide reductase | N2O-N2 | Dissimilation | + |
| GDH | Ammonium-assimilating enzyme | NH4+-biological nitrogen | Assimilation | / |
| nasA | Assimilated nitrate reductase | NO3−-NO2− | Assimilation | / |
| nirB | Assimilated nitrite reductase | NO2−-NH4+ | Assimilation | / |
| +：阳性；–：阴性；/：未检测 +: Positive; –: Negative; /: Not identified. |
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通过生长和脱氮曲线、氮平衡分析和功能基因鉴定，确定菌株N26的异化代谢途径为NH4+-N→NO2−-N→NO→N2O→N2和NO3−-N→ NO2−-N→NO→N2O→N2 (图 18)，这是一个短程硝化-反硝化过程，同时证明菌株N26具有优良的脱氮性能，在好氧条件下仅有少量亚硝酸盐积累[46-47]。
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| 图 18 菌株N26的代谢途径 Figure 18 Metabolic pathway of strain N26. |
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通过生长与脱氮曲线的研究，结果表明：氨氮和硝态氮的去除与菌株N26的快速增殖在时间上保持一致，说明硝化-反硝化作用主要发生在对数生长期，菌体的生长需要大量含氮物质；菌株N26能够快速去除水中的氨氮和硝态氮，且水中最终保持较低的硝酸盐和亚硝酸盐积累水平；菌株N26在氨氮环境下生长速度和硝化能力强于在硝态氮环境下，对氨氮的处理优先程度高于硝态氮，Zhu等[48]研发的Pseudomonas mendocina 3-7与之类似，而杨云龙等[49]的研究发现，螯台球菌TAD1在硝态氮和亚硝态氮同时存在时优先利用硝态氮。菌株N26硝化过程中只有亚硝态氮短暂增多，而硝态氮则不会增多，说明脱氮过程中的中间产物是亚硝态氮，在硝化氨氮和硝态氮时都出现了中间产物亚硝态氮，但在氨氮环境下亚硝态氮的最大值和停留时间均比较低，文刚等[50]对Acinetobacter junii ZMF5、He等[51]对Pseudomonas mendocina TJPU04及Padhi等[45]对Klebsiella pneumoniae CF-S9的研究均证明亚硝态氮为异养硝化-好氧反硝化的唯一中间产物。在处理硝态氮时由于亚硝态氮的长时间积累，使得菌株N26的菌株数量下降较多，说明亚硝酸盐对该菌株有毒害作用，进而影响其反硝化性能，该现象与Almeida等[52]的报道相类似。菌株N26在氨氮环境下的36 h总氮去除率高于在硝态氮环境下，但总体上总氮的去除效率均不高，随着培养时间的延长，总氮将下降到一稳定值，总氮的高残留率是异养硝化-好氧反硝化领域仍需解决的薄弱环节，而对这一部分的研究则鲜见报道。
通过脱氮性能优化的研究，得出该菌株的最适氮源为氯化铵，最适碳源为丁二酸钠，最适温度为30 ℃，最适接种量为15%，最适pH值为8.0−9.0，最适C/N为15，最适转速为120 r/min，最适氮负荷为≤300 mg/L (氨氮)。该结果表明不动杆菌N26是一种适合应用于污水和废水中氨氮处理的微生物，胡丹等[53]研发的神户肠杆菌HD-NAH在脱氮条件的选择性上与菌株N26相似，其最适C/N为18，生长最适宜的环境pH值为7.0−10.0；单一氮源下，神户肠杆菌HD-NAH的去除速率和去除率表现为亚硝态氮 > 氨氮 > 硝态氮，结合菌株N26在硝化-反硝化过程中仅出现中间产物亚硝态氮这一现象可知，菌株N26的去除速率和去除率表现应与之相同。此外，Ye等[19]研发的Pseudomonas putida Y-12，其对208.1 mg/L氨氮的72 h处理效率为98.8%；雷强等[54]研发的Klebsiella oxytoca YZ-12的最适氨氮负荷≤150 mg/L。
通过脱氮途径的分析，初步确定不动杆菌N26脱氮时遵循一种短程硝化-反硝化路径，其他经报道有相同或类似脱氮代谢途径的菌种有：Chen等[13]发现的产碱杆菌(Alcaligenes sp.) TB对氨氮的脱氮路径与菌株N26相同；Xu等[55]发现的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) WXN-23对硝态氮的脱氮路径与菌株N26相同。应该指出，微生物对氨氮或硝态氮的短程硝化-反硝化并不局限于以上路径，有些菌种在处理含硝态氮废水过程中无中间产物亚硝酸盐产生，证明硝态氮不经过亚硝态氮直接被还原为含氮气体，但对该脱氮方式及菌种的研究，目前的信息还十分有限。
4 结论从羊粪堆肥中分离获得的一株细菌Acinetobacter johnsonii sp. N26，能够快速去除水中的氨氮和硝态氮，且最终保持较低的硝酸盐和亚硝酸盐积累水平，其对初始浓度50 mg/L的氨氮、硝态氮的36 h去除效率均达到99.5%以上，最大去除速率分别为5.330、3.147 mg/(L·h)。菌株N26在氨氮环境下生长速度和硝化能力强于在硝态氮环境下，中间产物亚硝酸盐对菌株的生长有毒害作用。在无碳源或0转速时，菌株N26的生长和脱氮效果十分微弱，功能基因鉴定结果表明菌株N26没有或不表达控制呼吸硝酸盐还原酶的功能基因narG，而可以表达控制周质硝酸盐还原酶的功能基因napA，说明Acinetobacter johnsonii sp. N26是一株异养硝化-好氧反硝化不动杆菌。菌株N26异养硝化-好氧反硝化的最佳条件为：氮源为氯化铵；碳源为丁二酸钠；温度为30 ℃；接种量为15%；pH 8.0−9.0；C/N为15；转速为120 r/min；氮负荷≤300 mg/L。异养硝化-好氧反硝化菌N26的脱氮代谢途径为NH4+-N→NO2−-N→NO→ N2O→N2和NO3−-N→ NO2−-N→NO→N2O→N2，是一种短程硝化-反硝化过程。菌株N26的生长和脱氮曲线、氮平衡分析以及功能基因鉴定，表明菌株N26是一株高效、节能的异养硝化-好氧反硝化菌种，可为后续异养硝化-好氧反硝化的理论研究与实际应用提供参考。
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