卡西霉素(calcimycin，A23187，图 1)是1972年Reed等在教酒链霉菌NRRL3882中发现的聚醚类化合物，其结构由α-酮基吡咯、螺缩酮及苯并噁唑3部分组成^[1-2]。卡西霉素是重要的离子载体抗生素，目前已有17 000多篇文献对其报道，其能与生理上重要的阳离子如钙离子、镁离子等结合，形成脂溶性复合物通过生物膜，进而发挥药理作用^[3]。近年来，研究者发现卡西霉素通过将细胞外的钙离子逆浓度梯度泵入卵母细胞，从而有效激活卵母细胞，因此广泛应用于辅助生殖的临床实践中^[4-5]。基于卡西霉素独特的结构特征和广泛的生理活性^[6-8]，其生物合成途径的研究引起科学家的广泛关注。

对卡西霉素生物合成途径的研究始于1980年^[9-10]。2011年，Wu等^[11]从教酒链霉菌NRRL3882中克隆到负责合成卡西霉素的基因簇。根据生物信息学预测，calA1-A5是5个聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS)基因，负责螺缩酮的合成；calN1-N3负责α-酮基吡咯的合成；calT为抗性基因；calR1-R3为3个调控基因；calU1-U5为未知功能基因。2013年，我们通过基因敲除及喂养实验证实基因簇上的calB1-B4基因负责3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA，苯并噁唑环的前体物)的生物合成^[12]，并通过体外催化实验证实CalM负责卡西霉素中苯并噁唑结构的氮甲基化^[13]。2018年，Wu等通过体内外实验证实了CalC是一种ATP依赖的cezomycin-CoA连接酶^[14]，而硫酯酶CalG催化cezomycin-CoA复合物的解离^[15]。

卡西霉素生物合成基因簇上共有3个可能的转录调控基因calR1、calR2和calR3，分别属于TylR、LuxR和TetR家族。前期工作中，我们通过基因敲除、回补及体外催化实验证实calR3是卡西霉素生物合成中的负调控基因，calR3基因缺失突变株的卡西霉素产量提高了7倍^[16]。通过构建calR2基因缺失突变菌株并对其代谢产物及突变株基因转录水平分析，证实calR2在卡西霉素的生物合成中起正调控作用^[1]。

本研究以另一个潜在的调控基因calR1为研究对象，生物信息学比对分析发现，CalR1与泰乐菌素(tylosin)生物合成基因簇中的调控因子TylR及碳霉素(carbomycin)生物合成基因簇的调控因子AcyB2均具有较高的相似性。本研究通过PCR-targeting的方法，构建calR1基因中断的突变株、利用整合型回补质粒pJTU2170载体构建∆calR1: calR1的回补菌株，对∆calR1突变菌株及回补菌株的发酵产物进行HPLC分析，并比较分析在野生型及突变型菌株中卡西霉素生物合成关键基因的转录差异，以期初步阐明calR1基因对卡西霉素产量的影响，为卡西霉素生物合成调控网络的研究提供有力依据，并为后续利用分子生物学手段提高卡西霉素产量奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Escherichia coli ET12567/pUZ8002用于接合转移，BW25113/pIJ790用于PCR-targeting敲除宿主目的基因，整合型质粒pJTU2170用于突变株的回补，以上菌株及质粒均来自上海交通大学分子微生物学实验室，具体信息见表 1。

1.1.2 培养基

LA及LB培养基^[13]用于大肠杆菌培养；TSBY培养基^[13]用于链霉菌总DNA及RNA的提取；SFM固体培养基^[13]及SFM液体培养基分别用于链霉菌的培养及发酵。

1.1.3 主要试剂和仪器

KOD plus和rTaq，TOYOBO公司；限制性内切酶，New England Biolabs公司；RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、FastQuant RT Kit和SuperReal qPCR PreMix (SYBR Green)试剂盒，天根生化科技有限公司；卡西霉素标准品，Sigma-Aldrich公司。抗生素、如氨苄霉素、卡那霉素、阿泊拉霉素、氯霉素的浓度及HPLC、LC/MS条件见文献[1]。

恒温摇床ZWF-200、恒温培养箱ZXRD-B2050，上海智城分析仪器制造有限公司；用于DNA定量的ScanDrop200，耶拿分析仪器股份公司；用于RT-qPCR的ABI7900HT，应用生物系统公司；HPLC (Agilent 1200)、LC/MS (Agilent 6410)及ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm)，安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CalR1蛋白的序列比对分析

CalR1 (GenBank登录号为AEH42475.1)、TylR (GenBank登录号为AAF29380.1)、AcyB2 (GenBank登录号为ALK28498.1)的氨基酸序列采用Clustal Omega工具进行序列比对^[18]，采用Needleman-Wunsch BLAST方法进行一致性和相似性的两两比较。

1.2.2 calR1基因敲除突变菌株的构建

本研究中，calR1基因敲除采用的是PCR-targeting方法。设计引物R1-F1和R1-F2 (表 2)，PCR扩增用于敲除calR1基因的替换片段。通过Escherichia coli BW25113/pIJ790的λ-RED重组系统将含有阿泊拉霉素抗性基因及oriT的cassette与柯斯质粒p16F9上的calR1基因进行双交换同源重组，获得重组质粒pJTU3789。pJTU3789的接合转移及接合子筛选条件同文献[1]。挑取接合子扩大培养，提取其基因组DNA，采用引物R1-F3和R1-F4 (表 2)进行PCR扩增验证。链霉菌基因组DNA的提取方法及PCR反应体系、条件见文献[1]。

1.2.3 calR1基因回补菌株的构建

设计引物R1-F5和R1-F6 (表 2)，以教酒链霉菌NRRL3882的基因组DNA为模板，通过高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增完整的calR1基因。PCR产物通过限制性内切酶Nde I及EcoR I酶切后连接到pJTU2170上，构建回补质粒pJTU2170-R1。在辅助质粒pUZ8002的协助下，通过大肠杆菌和链霉菌之间的两亲本接合转移，将pJTU2170-R1导入到ΔcalR1突变株中，采用卡那霉素抗性筛选，并使用PCR扩增回补菌株的总DNA以验证回补是否成功。

1.2.4 菌株发酵及发酵产物分析

将野生菌株NRRL3882、突变菌株GLX24及回补菌株GLX27 (ΔcalR1: calR1)的孢子接种培养。种子液及发酵的培养条件、发酵液的收集、萃取、浓缩，以及HPLC或LC/MS检测分析条件见文献[1]，其中色谱检测程序：0−5 min，70%甲醇等梯度洗脱；6−20 min，70%−90%甲醇洗脱；21−40 min，90%−100%甲醇洗脱；41−45 min，100%甲醇洗脱。

1.2.5 链霉菌总RNA的提取和反转录

将野生NRRL3882菌株和突变菌株GLX24的孢子接种于TSBY培养基中，30 ℃、220 r/min培养5 d，吸取少量菌液于12 000 r/min离心1 min，弃上清。然后按照Total RNA Isolation Kit操作说明提取RNA，之后将去除DNA的RNA反转录为cDNA，根据FastQuant RT Kit的操作说明书进行，详见文献[1]。

1.2.6 卡西霉素生物合成基因转录水平检测

采用荧光定量PCR分析野生菌株及calR1中断的突变株的卡西霉素生物合成相关基因的转录水平。以cDNA为模板，16S rRNA基因为内参，根据ΔΔC_t的计算公式^[1]，通过比较C_t值计算目标基因在突变菌株和野生菌株的转录水平差异。根据卡西霉素生物合成相关基因的功能及其在基因簇上的分布筛选了14个目标基因，其中calC的RT-qPCR引物序列见本文表 2，其他基因的引物见文献[1]的表 2。根据SuperReal qPCR PreMix试剂盒配制20 μL Real-time PCR反应体系：10 μL Super Real SYBR Green PreMix，上、下游引物(300 nmol/L)各3 μL；模板cDNA (4 ng/μL) 4 μL。PCR反应条件见文献[1]。

2 结果与分析 2.1 CalR1的生物信息学分析

如图 2的氨基酸序列比对显示，CalR1与兽药抗生素泰乐菌素生物合成基因簇中的调控因子TylR^[19-21]，以及源自耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)的碳霉素生物合成基因簇的调控因子AcyB2^[22-25]均具有较高的相似性。其中CalR1与TylR的一致性和相似性分别为38%和49%，与AcyB2的一致性和相似性分别为37%和49%。这提示我们，CalR1可能为卡西霉素生物合成途径的调控因子。

2.2 calR1基因敲除突变菌株与回补菌株的构建

为了确认calR1基因的功能，通过PCR-targeting技术，对教酒链霉菌NRRL3882基因组上的calR1基因进行敲除及回补实验，通过双交换同源重组构建了用于敲除calR1基因的基因敲除质粒pJTU3789，见图 3A。将pJTU3789转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，接着与野生菌株接合转移，筛选含阿泊拉霉素抗性的接合子。通过PCR验证接合子的基因型，其中双交换突变株GLX24的PCR扩增片段为1 760 bp，而野生菌株的扩增片段为750 bp，结果见图 3B，与预期相吻合。

将本研究构建的calR1基因回补质粒pJTU2170-R1导入到突变菌株GLX24 (ΔcalR1)中获得回补菌株GLX27(ΔcalR1: calR1)，提取回补菌株GLX27的DNA，PCR扩增验证。因为pJTU2170为整合型质粒，所以回补菌株含有750 bp的野生型条带及1 760 bp的重组条带(图 3C)。

2.3 菌株代谢产物分析

将S. chartreusis NRRL3882、GLX24及GLX27分别进行液体发酵，30 ℃、220 r/min培养7 d，采用HPLC分析发酵产物，以calcimycin标准品作为阳性对照。HPLC结果见图 4，野生菌株产生卡西霉素及cezomycin^[12]，突变菌株GLX24失去产生卡西霉素的能力，但有cezomycin的积累，结合文中2.1的生物信息学预测结果，说明calR1基因可能在卡西霉素的生物合成中起调控功能，可能负责从cezomycin至卡西霉素之间的转化。calR1基因对突变株GLX24进行回补后，回补菌株GLX27恢复产生卡西霉素的能力，表明calR1基因中断对卡西霉素产量的影响并不是由极性效应产生，进一步说明calR1基因在卡西霉素生物合成中的调控作用。

2.4 RT-qPCR分析卡西霉素生物合成相关基因转录水平

通过RT-qPCR分析calR1基因对卡西霉素合成相关基因的转录调控，提取培养96 h (平台期)^[16]的S. chartreusis NRRL3882与GLX24的总RNA，分析卡西霉素生物合成基因簇上14个不同功能基因(图 5)的转录水平，测定这些基因在突变菌株与野生菌株的转录差异，各基因的分布及预测的功能见图 1B。

结果如图 5所示，与野生型相比，突变株中calC、calG和calU3的转录水平显著下降，而其他11个基因的转录水平均有明显上升。由图 4可知，calR1基因的敲除导致中间产物cezomycin大量积累，几乎不产生终产物calcimycin。因此，在野生型菌株中，calR1可能通过正调控calC、calG及calU3的转录水平，促进cezomycin向calcimycin的转化。

3 讨论与结论

calR1在生物信息学预测中属于TylR家族基因，但该家族基因的实验研究较少，目前只有泰乐菌素生物合成基因簇中的tylR及碳霉素生物合成基因簇的acyB2有研究报道。本研究通过将calR1基因进行敲除及回补，通过代谢产物比较分析，证实其负责调控从中间产物cezomycin向终产物卡西霉素的转化。卡西霉素在3位上比cezomycin多一个甲氨基(图 1A)，因此calR1可能负责调控cezomycin的3位氨基化。

通过对基因簇中14个代表性基因进行转录水平差异检测，发现敲除calR1后，calC、calG、calU3的转录水平均显著下降(分别下降约0.013、0.028、0.01倍)。最近的研究报道显示，CalC与cezomycin在3位的活化有关^[14]，而CalG催化CalC的逆反应^[15]。Cezomycin经CalC活化后，可能经过多步反应在CalU3等蛋白作用下3位氨基化(CalU3功能研究待发表)，然后由CalM进一步甲基化^[13]，形成终产物卡西霉素。因此calC转录水平的显著下调将阻碍cezomycin的进一步反应，这与本研究观察到的敲除calR1前后基因转录水平差异结果相一致。

敲除calR1后，calM等11个基因的转录水平均有不同程度的上升，显示calR1是一个识别位点较宽泛的转录调控因子，该性质与tylR相似。在Streptomyces fradiae中敲除tylR后，泰乐菌素生物合成基因簇中有至少19个基因转录水平下调或不表达，同时至少有13个基因转录水平上调^[19]。这种生物合成途径内的“全局性”调控现象，可能与CalR1或TylR的DNA结合结构域的识别特异性有关。

敲除calR1后，calR2、calR3的转录水平均有不同程度上升(图 5)，显示3个调控基因之间可能具有相互作用。已有的研究显示，敲除calR2后，calR1、calR3的转录水平基本无变化，而calA1、calA3、calA5、calM、calB4、calT、calU2等基因均显著下调，导致完全不产卡西霉素及cezomycin^[1]。敲除calR3后，calR2转录水平约上升3倍，calR1基本不变，除了calA1略有下降，其余关键基因的转录水平均有不同程度上升，其中calT的转录水平大约上升170倍，导致卡西霉素的产量上升了约8倍^[16]。综合以上基因转录差异数据，可推测calR1负调控calR3及calR2，calR3也负调控calR2，但该推测还需要进一步实验验证，因其可能并非直接调控关系，可能涉及中间产物产量变化等导致的间接调控。关于高产菌株改造，calR1及calR2与卡西霉素的高产关系还不明确，需要进一步研究，而敲除calR3的突变株产量提升明显，有望改造成工业发酵高产菌株。综上所述，本研究通过基因敲除回补、代谢产物比较分析、基因转录差异检测等鉴定了calR1为卡西霉素生物合成途径中的调控因子，其可能通过调控calC、calG及calU3的表达，催化中间产物cezomycin转化为卡西霉素。本研究将为揭示卡西霉素的3位甲氨基化修饰机制打下良好基础。