微生物学通报  2023, Vol. 50 Issue (12): 5439−5448

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陈见兴, 王豪杰, 潘喻, 刘弘毅, 林欢, 朱良全, 陈洪岩, 谢金鑫, 夏长友, 张贺, 王玉娥
CHEN Jianxing, WANG Haojie, PAN Yu, LIU Hongyi, LIN Huan, ZHU Liangquan, CHEN Hongyan, XIE Jinxin, XIA Changyou, ZHANG He, WANG Yu'e
PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用
Establishment and application of a triplex RT-PCR method for detection of PDCoV, SADS-CoV, and SVA
微生物学通报, 2023, 50(12): 5439-5448
Microbiology China, 2023, 50(12): 5439-5448
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.230585

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收稿日期: 2023-07-17
接受日期: 2023-09-06
网络首发日期: 2023-10-07
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陈见兴, 王豪杰, 潘喻, 刘弘毅, 林欢, 朱良全, 陈洪岩, 谢金鑫, 夏长友, 张贺, 王玉娥. PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 微生物学通报, 2023, 50(12): 5439-5448.
CHEN Jianxing, WANG Haojie, PAN Yu, LIU Hongyi, LIN Huan, ZHU Liangquan, CHEN Hongyan, XIE Jinxin, XIA Changyou, ZHANG He, WANG Yu'e. Establishment and application of a triplex RT-PCR method for detection of PDCoV, SADS-CoV, and SVA[J]. Microbiology China, 2023, 50(12): 5439-5448.
PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用
陈见兴1,2 , 王豪杰3 , 潘喻2 , 刘弘毅2 , 林欢2 , 朱良全3 , 陈洪岩2 , 谢金鑫1 , 夏长友2 , 张贺2 , 王玉娥2     
1. 新疆农业大学动物医学学院, 新疆  乌鲁木齐    830052;
2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室, 黑龙江  哈尔滨    150069;
3. 中国兽医药品监察所, 北京 102600
收稿日期: 2023-07-17; 接受日期: 2023-09-06; 网络首发日期: 2023-10-07
基金项目: 国家重点研发计划青年科学家项目(2021YFF0703100)
摘要: 【背景】 猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A, SVA)均为猪的新发病原，严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断，因此亟须建立多重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测方法对疑似患病猪进行快速诊断，以降低经济损失。【目的】 建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】 参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域序列设计3对特异性引物，以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm)；采用方阵法优化其引物浓度；构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量；以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板，确定三重RT-PCR法的特异性；以批间和批内试验验证其重复性；经检测临床样本并与已报道的检测方法进行比较，评估其临床应用效果。【结果】 建立的三重RT-PCR检测方法最佳退火温度为58.3 ℃，引物最佳浓度分别为0.50、0.25和0.25 μmol/L；其敏感性高，PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL；其特异性强，仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带，对其他病毒均无扩增条带；该方法重复性好，批间和批内试验检测结果均一致。最后经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为4.4%、0%和0.73%，与已报道的检测方法一致。【结论】 建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法，为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。
关键词: 猪丁型冠状病毒    新型猪急性腹泻综合征冠状病毒    塞内卡病毒A型    三重RT-PCR    
Establishment and application of a triplex RT-PCR method for detection of PDCoV, SADS-CoV, and SVA
CHEN Jianxing1,2 , WANG Haojie3 , PAN Yu2 , LIU Hongyi2 , LIN Huan2 , ZHU Liangquan3 , CHEN Hongyan2 , XIE Jinxin1 , XIA Changyou2 , ZHANG He2 , WANG Yu'e2     
1. College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China;
2. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, Heilongjiang, China;
3. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 102600, China
Received: 17-07-2023; Accepted: 06-09-2023; Published online: 07-10-2023
Foundation item: This work was supported by the National Key Research and Development Program of China for Young Scientist (2021YFF0703100)
*Corresponding author: E-mail: ZHANG He, zhanghe01@caas.cn;
E-mail: WANG Yu'e, wangyue@caas.cn.
Abstract: [Background] Porcine deltacoronavirus (PDCoV), swine acute diarrhea syndrome coronavirus (SADS-CoV), and senecavirus A (SVA) are emerging pathogens which seriously endanger the development of the pig industry. The clinical symptoms of pigs infected with the three pathogens are difficult to be distinguished. Therefore, it is urgent to establish a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method for the rapid diagnosis of suspected pigs and reduce economic losses. [Objective] To establish a triplex RT-PCR method for simultaneous detection of single or mixed infection of PDCoV, SADS-CoV, and SVA. [Methods] Three pairs of specific primers were designed according to the conserved regions of the N genes of PDCoV and SADS-CoV and the L/P1 genes of SVA registered in GenBank, and the optimal annealing temperature (Tm) was determined by the temperature gradient PCR method. The primer concentration was optimized by the array method. The recombinant plasmids PMD-PDCoV, PMD-SADS-CoV, and PMD-SVA were constructed as standards to determine the limits of detection (LODs). The specificity of the triplex RT-PCR method was determined with the nucleic acid samples of six common pig viruses including porcine transmissible gastroenteritis virus, porcine epidemic diarrhea virus, and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The repeatability of the established method was verified by inter-batch and intra-batch tests. Finally, we employed the triplex PCR method to detect the clinical samples and compared the results with those obtained with the reported detection methods, thus evaluating the clinical application performance of this method. [Results] The optimal Tm was 58.3 ℃, and the optimal primer concentrations were 0.50, 0.25, and 0.25 μmol/L, respectively. The established method had high sensitivity, with the LODs of 1, 1, and 10 copies/μL for PMD-PDCoV, PMD-SADS-CoV, and PMD-SVA, respectively. It had strong specificity, with specific bands only for PDCoV, SADS-CoV, and SVA and no bands for other viruses. Moreover, the method had good repeatability as the test results were consistent between and within batches. Finally, the positive rates of PDCoV, SADS-CoV, and SVA in the clinical samples detected by the established method were 4.4%, 0%, and 0.73%, respectively, which were consistent with the results obtained with the reported detection methods. [Conclusion] The triplex RT-PCR method established in this study is accurate and reliable for the simultaneous detection of PDCoV, SADS-CoV, and SVA in clinical samples.
Keywords: porcine deltacoronavirus (PDCoV)    swine acute diarrhea syndrome coronavirus (SADS-CoV)    seneca virus A (SVA)    triplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)    

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)和新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)均属于冠状病毒科，作为近年来猪的新发病原，可引起仔猪腹泻、呕吐甚至严重脱水死亡，临床症状与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)相似，难以根据临床症状进行快速诊断[1-2]。塞内卡病毒A型(seneca virus A, SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属唯一的成员，可引起患病猪嗜睡、厌食、跛行及某些器官产生水疱样病变甚至死亡，临床症状与口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等引起水疱症状的病原相似，难以通过临床症状进行区分[3-4]。PDCoV、SADS-CoV和SVA均为猪的新发病原，无季节特异性和年龄特异性，但具有较高的感染率和死亡率，这3种新发病原均为RNA病毒，结构简单，具有较高的突变率[5]。有研究表明PDCoV和SADS-CoV分别可能由鸟类和蝙蝠突变而来[6-7]，SVA可感染牛、苍蝇和老鼠[8]，说明这些新发病原具有跨物种传播的风险和广泛流行的可能。目前，一些国家均有相关病例的报道[9-10]，每次暴发均对各国的生猪健康和经济造成很大的影响。

目前国内外已报道的方法中仅有少数几个相关病原的单重或双重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法的建立，尚未见可同时检测PDCoV、SADS-CoV与SVA这3种新发病原的多重RT-PCR方法，其中曾秀秀等[11]建立的多重RT-PCR方法中虽然包含PDCoV和SADS-CoV的检测，但最低检测拷贝数分别仅为1×106 copies/μL和1×104 copies/μL，灵敏性不高。其他单重RT-PCR的检测方法虽然灵敏性高，但仅能检测单一病原，操作烦琐且极易漏检，存在一定的局限性。因此，本研究通过序列比对分析确定PDCoV、SADS-CoV和SVA的特异性检测靶基因，设计3对特异性引物并建立一种能够同时快速检测此3种病毒的RT-PCR方法，以期为新发病原的流行病学调查和临床诊断提供灵敏和可靠的技术手段。

1 材料与方法 1.1 病毒基因组和病料

新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、塞内卡病毒A型(seneca virus A, SVA)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)、猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的基因组均由中国兽医药品监察所惠赠；从不同猪场采集273份腹泻病料。

1.2 主要试剂和仪器

2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，北京依珊汇通科技有限公司；TIANamp Virus DNA/RNA Kit、EndoFree Maxi Plasmid Kit和TIANprep Mini Plasmid Kit，黑龙江泰康生物科技有限公司；Gel Extraction Kit，北京索莱宝科技有限公司；Escherichia coli DH5α感受态细胞，北京睿博兴科生物技术有限公司；pMD18-T载体和PrimeScript™ RT reagent Kit，宝生物工程(大连)有限公司。梯度PCR仪，北京佰鸥创投生物科技有限公司；电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像仪，上海天能科技有限公司。

1.3 引物合成和设计

参照GenBank中登录的PDCoV N基因(MN942260)、SADS-CoV N基因(MN368598)和SVA L/P1基因(MN700930)序列，利用Primer 5.0软件设计3对特异性引物序列(表 1)，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，合成后的引物稀释至10 μmol/L，并保存于−20 ℃备用。

表 1　三重RT-PCR检测引物 Table 1　Primer of the triple RT-PCR
Primer name Primer sequence (5'→3') Product size (bp)
SVA-F TAGTCGTGTCGGTTCTATAGGTAGC 663
SVA-R TGGCAGTAAAAGTGGTGGTGGGTTG
PDCoV-F AACCCCAACAATCCTAAACATCAGC 501
PDCoV-R GAGCGCATCCTTAAGTCTCTCATAG
SADS-CoV-F CACTCCAGATCAACAGATTGGTTAT 312
SADS-CoV-R CGAGACTGTGAACGTGAAGC
表选项
1.4 模板的制备

根据反转录试剂盒说明书将SADS-COV、PDCoV、SVA、PEDV、TGEV、CSFV和PRRSV的RNA反转录为cDNA，于−80 ℃保存备用。

1.5 重组质粒的制备

利用胶回收试剂盒分别回收SVA的L/P1基因、PDCoV和SADS-CoV的N基因的部分保守序列，与pMD18-T载体连接，构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA，分别转化至E. coli DH5α感受态细胞，选取阳性克隆菌测序。将测序正确的样品扩大培养后采用质粒提取试剂盒分别提取PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA，用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度并换算为拷贝数，分别作为三重RT-PCR的重组质粒标准品。

1.6 三重RT-PCR方法的建立及优化

分别以PDCoV、SADS-CoV和SVA的cDNA为模板，利用设计的3对特异性引物分别进行单一和三重RT-PCR扩增。反应体系：2×Taq PCR StarMix 10 μL，3对引物分别为SVA F/R 0.5 μmol/L、PDCoV F/R 0.25 μmol/L和SADS-CoV F/R 0.25 μmol/L，模板1 μL，ddH2O补足20 μL。进一步对退火温度(50−60 ℃)和3种引物浓度比例进行优化，优化的方法是控制变量法，在其他因素保持不变的条件下，对某一因素的反应条件进行优化，最终确定三重RT-PCR的最佳反应条件。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58.3 ℃ 40 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 5 min。

1.7 特异性试验

应用优化后的三重RT-PCR方法，以SADS-CoV、PDCoV、SVA、TGEV、PEDV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV的DNA/cDNA为模板，分别以三重RT-PCR方法的引物，以及PEDV、TGEV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV的单独引物进行PCR/RT-PCR扩增，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测该方法的特异性。

1.8 灵敏性试验

将1×1011 copies/μL的重组质粒PMD- PDCoV、1×1011 copies/μL的重组质粒PMD-SVA分别稀释为1×1010 copies/μL后，与1×1010 copies/μL的重组质粒PMD-SADS-CoV等体积混合，用ddH2O进行10倍倍比稀释作为模板，利用优化后的三重RT-PCR方法进行检测，验证该方法的灵敏性。

1.9 重复性试验

应用建立的三重RT-PCR方法进行重复性试验。批内试验：以PMD-PDCoV、PMD-SADS- CoV和PMD-SVA为模板进行PCR扩增，每次试验做3次重复；批间试验：分批提取质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA，等体积混合后，在相同条件下分别进行3次PCR扩增，以评估该方法的重复性和可靠性。

1.10 临床样品检测

从猪场采集粪便样品273份，每份样品取1−2 g于2 mL离心管中，加入PBS将样品浸没并使用漩涡振荡器充分振荡混匀，12 000 r/min离心3−5 min取上清，将上清分别使用0.22 μm的滤膜过滤获得病毒原液。根据TIANamp Virus DNA/RNA Kit说明书分别提取病毒原液中的基因组，并利用反转录试剂盒进行反转录，获得反转录产物。用本研究建立的三重RT-PCR方法与此类病原已报道的单重或多重RT-PCR检测方法进行比较[12-14]，以确定该方法的准确性。

2 结果与分析 2.1 重组质粒标准品的鉴定结果

构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD- SADS-CoV和PMD-SVA，利用紫外分光光度计检测3种重组质粒浓度分别为670、719和113 μg/mL。经换算分别为1.82×1011、2.05×1011和3.43×1010 copies/μL，将质粒分别存放于−20 ℃备用。

2.2 单一及三重RT-PCR检测的建立

分别以PDCoV、SADS-CoV和SVA的cDNA为模板，利用设计的3对特异性引物，分别进行单一和三重RT-PCR扩增。结果显示，能够特异性扩增出PDCoV、SADS-CoV和SVA的目的片段，阴性对照组无扩增条带(图 1)。将目的条带切胶回收后测序，结果与预期结果一致。

图 1　单重RT-PCR和三重RT-PCR扩增结果 Figure 1　Amplification results of single RT-PCR and triple RT-PCR. 1‒4: RT-PCR products of SVA L/P1, PDCoV and SADS-CoV N gene, respectively; 5: Negative control; M: DL2000 DNA Marker. 1‒4：SVA L/P1基因、PDCoV的N基因、SADS-CoV的N基因和多重RT-PCR阳性条带；5：阴性对照；M：DL2000 DNA Marker
图选项
2.3 三重RT-PCR检测方法的优化结果

通过对退火温度和引物浓度进行优化，确定三重RT-PCR的最适反应体系：2×Taq PCR Mix 10 μL，引物PDCoV-F/PDCoV-R、SADS- CoV-F/SADS-CoV-R和SVA-F/SVA-R分别为0.50、0.25和0.25 μmol/L，模板1 μL，ddH2O补足20 μL。最适反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58.3 ℃ 40 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 5 min。结果表明优化后的退火温度及引物浓度能特异性地扩增出目的片段(图 2)。

图 2　三重RT-PCR退火温度及引物浓度的选择 Figure 2　Selection of annealing temperature and primer concentration for the triple PCR. A: 1‒8: The annealing temperature were 60.0, 59.4, 58.3, 56.3, 53.9, 52.0, 50.7 and 50.0 ℃; M: DL2000 DNA Marker. B: 1‒3: Concentrations of PDCoV primer was 0.250 μmol/L, concentrations of SADS-CoV and SVA primers were 0.250, 0.325 and 0.500 μmol/L; 4‒6: Concentrations of PDCoV primer was 0.325 μmol/L, concentrations of SADS-CoV and SVA primers were 0.250, 0.325 and 0.500 μmol/L; 7‒9: Concentrations of PDCoV primer was 0.500 μmol/L, concentrations of SADS-CoV and SVA primers were 0.250, 0.325 and 0.500 μmol/L; M: DL2000 DNA Marker. A：1‒8：退火温度分别为60.0、59.4、58.3、56.3、53.9、52.0、50.7和50.0 ℃；M：DL2000 DNA Marker. B：1‒3：PDCoV引物为0.250 μmol/L，SADS-COV和SVA引物分别为0.250、0.325和0.500 μmol/L；4‒6：PDCoV引物为0.325 μmol/L，SADS-COV和SVA引物为0.250、0.325和0.500 μmol/L；7‒9：PDCoV引物为0.500 μmol/L，SADS-COV和SVA引物为0.250、0.325和0.500 μmol/L；M：DL2000 DNA Marker
图选项
2.4 三重RT-PCR特异性试验结果

以建立的三重RT-PCR方法对SADS-CoV、PDCoV、SVA、PEDV、TGEV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV的DNA/cDNA进行PCR扩增。图 3结果显示，用三重RT-PCR引物扩增含SVA等10种病原基因组cDNA只能扩增出3种目的病原的基因，其他病原基因未获得扩增产物。目前扩增出的PEDV等病原条带作为阳性对照，阴性对照无特异性条带，表明该方法具有良好的特异性。

图 3　三重RT-PCR的特异性试验 Figure 3　Specificity test of the triple RT-PCR. 1: Amplification results of SVA, PDCoV, SADS-CoV, PEDV, TGEV, PRRSV, SIV, CSFV, PCV2, and PRV mixture with primers of SADS-CoV, PDCoV and SVA; 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14: Positive control of PEDV, TGEV, PRRSV, SIV, CSFV, PCV2, and PRV; 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15: Amplification results of PEDV, TGEV, PRRSV, SIV, CSFV, and PCV2 with primers of SADS-CoV, PDCoV and SVA respectively; 16: Negative control; M: DL2000 DNA Marker. 1：采用SADS-CoV、PDCoV和SVA的引物对SADS-CoV、PDCoV、SVA、PEDV、TGEV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV的DNA/cDNA混合物进行RT-PCR的扩增结果；2、4、6、8、10、12和14：PEDV、TGEV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV阳性对照；3、5、7、9、11、13和15：采用SADS-CoV、PDCoV和SVA的引物分别对PEDV、TGEV、PRRSV、SIV、CSFV、PCV2和PRV的DNA/cDNA进行RT-PCR的扩增结果；16：阴性对照组；M：DL2000 DNA Marker
图选项
2.5 三重RT-PCR灵敏性试验结果

将拷贝数1×1011 copies/μL的重组质粒PMD-PDCoV、1×1011 copies/μL的重组质粒PMD-SVA分别稀释为1×1010 copies/μL后，与1×1010 copies/μL的重组质粒PMD-SADS-CoV等体积混合，然后进行10倍倍比稀释作为模板。结果显示，PMD-PDCoV的检测下限是1 copies/μL，PMD-SADS-CoV的检测下限是1 copies/μL、PMD-SVA检测下限是10 copies/μL (图 4)，表明该方法敏感性较高。

图 4　三重RT-PCR敏感性试验 Figure 4　Sensitivity test of the triple RT-PCR. 1‒8: The mixed plasmid concentrations were 1×107‒1×100 copies/μL, respectively; 9: Negative control; M: DL2000 DNA Marker. 1‒8：重组混合质粒浓度分别为1×107‒1×100 copies/μL；9：阴性对照；M：DL2000 DNA Marker
图选项
2.6 重复性试验结果

利用建立的三重RT-PCR检测方法进行批内和批间重性试验，结果显示该方法扩增条带均一致(图 5)，表明该方法具有良好的重复性。

图 5　三重RT-PCR重复性试验 Figure 5　Repeatability test of the triple RT-PCR. 1‒3: Intra batch repetition; 4‒6: Inter batch repetition; M: DL2000 DNA Marker. 1‒3：批内重复；4‒6：批间重复；M：DL2000 DNA Marker
图选项
2.7 临床样品检测结果

利用本试验建立的三重RT-PCR方法与已报道文献中所使用的引物分别对273份临床样品进行检测，结果显示，PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为4.4%、0%和0.73%。PDCoV与SVA混合感染、PDCoV与SADS-CoV混合感染、SVA和SADS-CoV的阳性率均为0%，PDCoV、SADS-CoV和SVA混合感染阳性率为0%，与这3种病原已报道的单重或多重RT-PCR检测方法的检测结果复合率为100%。表明本研究建立的三重PCR方法准确性高，临床应用性好(表 2)。

表 2　临床样品检出率 Table 2　Detection rate of clinical samples
Virus Positive rate (%) Agreement rate (%)
Triple PCR methods Reported PCR detection methods
PDCoV 4.4 (12/273) 4.4 (12/273) 100
SADS-CoV 0 (0/273) 0 (0/273) 100
SVA 0.73 (2/273) 0.73 (2/273) 100
PDCoV+SVA 0 (0/273) 0 (0/273) 100
PDCoV+ SADS-CoV 0 (0/273) 0 (0/273) 100
SVA+SADS-CoV 0 (0/273) 0 (0/273) 100
PDCoV+ SADS-CoV+SVA 0 (0/273) 0 (0/273) 100
表选项
3 讨论与结论

随着我国养猪业养殖密度的日益加大，猪的疫病呈现出多种病原混合感染的态势，这极大地加快了疫病的传播和变异的速度，提高了防疫的难度，是目前养猪业面临的重大挑战。近年来，PDCoV、SADS-CoV和SVA均为猪的新发病原，具有较强的重组能力和较高的突变率，导致这些新发病原不具有宿主特异性，可实现跨宿主传播，对人类的健康存在潜在的威胁[15-16]。针对这些新发病原，很难做到仅通过临床症状进行快速诊断，还需借助实验室手段才能确诊。

PCR作为分子生物学常用的检测方法之一，因其灵敏性高、特异性强、操作简便等优点而被广泛应用。张帆帆等[17]根据PDCoV N基因设计引物，建立了单重RT-PCR检测方法；司广斌等[12]根据SADS-CoV N基因设计引物，建立了单重RT-PCR检测方法；范慧等[14]根据SVA保守基因设计引物，建立了单重RT-PCR检测方法。与以上方法相比，本研究建立的方法具有可同时检测多种病原且省时等优点。秦秋英等[18]根据PDCoV N基因设计引物和探针，建立了荧光定量PCR检测方法；张记宇等[19]根据SADS-CoV N基因设计引物，建立了SYBR Green荧光定量PCR检测方法；郭振华等[20]根据SVA保守基因VP1设计引物，建立了Taqman荧光定量PCR检测方法。相较以上方法，本研究建立的方法具有操作简便、省时、检测成本低等优点。目前国内外鲜见可同时检测这三种病原的多重RT-PCR方法的文献报道。因此亟须建立一种准确性高、敏感性强、重复性好的多重RT-PCR方法检测方法，实现对这3种新发病原的高效快速诊断，以防止其流行和暴发，并为实验室确诊此类与其他病原临床症状相似的病原提供有效手段。

本研究针对SVA的L/P1基因和PDCoV、SADS-CoV的N基因的保守区域，分别设计了3对特异性引物，扩增的目的片段大小分别为663、501和313 bp，相邻片段大小在100 bp以上，可在凝胶电泳时比较直观地区分。本研究进一步优化了退火温度和引物浓度等条件，获得了最佳反应条件，建立了一种能同时检测出PDCoV、SADS-CoV和SVA的多重RT-PCR方法，实现了对这3种新发病原同时快速诊断的目的。同时，本试验建立的方法具有灵敏性高、重复性好和特异性强等特点，能为此类新发病原检测提供准确和可靠的检测结果。利用本研究建立完成的三重PCR的方法，对来自不同猪场采集的273份临床样品进行了检测，分别检出PDCoV阳性率为4.4%、SADS-CoV阳性率为0%、SVA阳性率为0.73%，3种病毒混合感染检出率为0%，与文献中已报道的引物检测结果一致，表明该方法具有较好的临床应用效果。由于检测样品数目有限，并未有混合阳性样品检出，还需进一步对临床样品进行收集和检测，以进一步丰富临床检测数据并为流行病学调查提供有效资料。

REFERENCES
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