2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 陈兰, 谢永丽, 吴晓晖, 杨雪, 王添, 武玲玲
- CHEN Lan, XIE Yongli, WU Xiaohui, YANG Xue, WANG Tian, WU Lingling
- 萎缩芽胞杆菌CKL1促盐胁迫下燕麦生长活性及其功能基因分析
- Avena sativa growth-promoting activity of Bacillus atrophaeus CKL1 under salt stress and the functional genes
- 微生物学通报, 2022, 49(8): 3150-3164
- Microbiology China, 2022, 49(8): 3150-3164
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.211123
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文章历史
- 收稿日期: 2021-11-25
- 接受日期: 2021-12-30
- 网络首发日期: 2022-02-09
2. 青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室, 青海 西宁 810016
2. Key Laboratory of Superior Forage Germplasm in the Qinghai-Tibetan Plateau, Xining 810016, Qinghai, China
燕麦(Avena sativa)为禾本科燕麦属草本植物，是优良的草料兼用栽培作物[1]，具有耐寒、耐旱、耐盐碱的特点，在青藏高原高寒环境中具有独特的生存及适应能力[2]。其茎叶嫩而多汁、适口性好、营养价值高，青贮或干草均可作为家畜饲料[3]，是提高牧区抗灾保畜能力及稳定和推进畜牧业发展的重要基础。
青海高原缺氧、低温、强紫外线的极端环境使牧草生长缓慢、产草量低[4]，同时过度放牧、鼠虫害等作用加剧了天然草地退化，导致“黑土滩”大量出现[5]。此外，青海省多为盐碱地和荒漠地，盐渍化会降低土壤水势，引起植物生理干旱，阻碍植物正常生长；同时，盐浓度过高导致植物发生单盐毒害，影响植物正常代谢[6]。燕麦须根系发达，可减少无效蒸发和地表径流，是青藏高原保护生态环境和防止水土流失的重要栽培牧草[7]。因此，利用栽培牧草扩大草场面积，提高盐碱地等贫瘠土地植被覆盖率是实现草场可持续发展的有效措施。
芽胞杆菌作为一类重要的植物根际促生菌，可产生能够抵抗盐碱、干旱、低温、紫外线等不良环境的芽胞，是一类被广泛研究和应用的生防细菌[8]。研究发现，芽胞杆菌可定殖在植物根围，分泌生长素等激素类物质，直接促进植物生长；可抑制植物病原物生长或诱导植物抗病性，间接促进植物生长[9]。代金霞等[10]研究发现对苜蓿(Medicago sativa)和柳枝稷(Panicum virgatum)幼苗接种复合菌群C3和C8，可明显提高其生物量；谢永丽等[11]研究发现，分离自青海北山林场的QB11、QB12、QB13等11株芽胞杆菌对油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)具有显著拮抗活性，推断与其产生了具有抑菌作用的脂肽类化合物泛革素有关。因此，利用根围促生菌促进牧草生长、提高草地生物量、改善生态环境在青海省草业发展中极其重要。
本研究对分离自青海茶卡盐湖骆驼蓬(Peganum L.)根际的萎缩芽胞杆菌CKL1的拮抗活性、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)活性、耐低温及耐盐性进行测定，并通过测定CKL1对盐胁迫下青海本土燕麦品种“青燕1号”地上生物量、叶绿素含量、脯氨酸含量及丙二醛含量的影响，探究CKL1对燕麦的促生作用，并利用二代测序技术对菌株CKL1的基因组进行测序及分析，同时对菌株的拮抗、促生、应答逆境胁迫等相关功能基因进行分析，以期为揭示菌株CKL1对盐胁迫下燕麦的促生机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料芽胞杆菌：以课题组前期分离鉴定的青海茶卡盐湖骆驼蓬(Peganum L.)根围的萎缩芽胞杆菌CKL1为研究对象[12]。
病原真菌：禾谷镰孢菌(F. graminearum)、锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)保存于青海大学高原草地资源与生态省部共建重点实验室。
培养基及试剂：LB培养基[13]；PDA培养基[14]；低温1C培养基[15]；Salkowski比色液[16]。
草种：燕麦(A. sativa)品种“青燕1号”保存于青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室。
1.2 方法 1.2.1 菌株CKL1拮抗病原真菌活性测定分别打取禾谷镰孢菌、锐顶镰孢菌菌碟接种到PDA平板中央，倒置于28 ℃恒温箱中培养至菌落直径为平板直径的1/2，在距离平板中央2.5 cm处的4个对称点各放置一个直径4 mm的滤纸小圆片；菌株CKL1于LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养14 h，吸取5 μL CKL1菌悬液至滤纸小圆片，将处理平板继续倒置于恒温培养箱中2−3 d，一个处理3次重复，观测并记录抑菌结果[17]。
1.2.2 菌株CKL1产吲哚乙酸能力测定已活化的CKL1菌悬液与Salkowski比色液按体积比2:1混合至白色陶瓷板中，避光静置30 min，一个处理3个重复，以LB液体培养基为对照，若显色后变为红色，表示CKL1能够分泌吲哚乙酸。将CKL1菌悬液4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液于5 mL离心管中，加入等量比色液，避光静置30 min后测定OD530值，根据标准曲线计算菌株CKL1分泌吲哚乙酸的量[16]。
1.2.3 菌株CKL1耐逆性测定耐盐性测定：菌株CKL1接种到LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养14 h；吸取50 μL菌液涂布于含NaCl浓度分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%的LB固体培养基上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养5 d，一个处理3个重复，每天观察并记录菌株的生长情况[17]。
耐低温测定：将菌株CKL1接种到1C液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养14 h，取10 μL菌液点到1C固体培养基上，设置4、10、14、18 ℃ 4个温度梯度培养5 d，一个处理3次重复，每天观察并记录生长情况[18]。
1.2.4 菌株CKL1促盐胁迫下燕麦的生长效应测定CKL1对盐胁迫下燕麦种子萌发效应：经20%次氯酸钠溶液消毒处理20 min后的燕麦草种在CKL1菌悬液(细胞浓度1×107 CFU/mL)中浸种2 h后，播入铺有滤纸的培养皿中，置于光照培养箱中培养(28 ℃，光/暗周期16 h/8 h)，3 d后用30 mL的200 mmol/L NaCl溶液进行盐胁迫处理；每2天测定种子发芽数，12 d后测定燕麦种子芽长、根长。一个处理3个重复，无菌水处理作对照。每个重复选20粒种子进行测定和记录[19-20]。
CKL1对盐胁迫下燕麦幼苗生长效应：天然土与蛭石按2:1 (体积比)混合后以120 ℃灭菌；消毒处理后的燕麦种子播入穴盆中，置于光照培养箱中培养(25 ℃，光/暗周期16 h/8 h)。设置3个处理：CKL1+200 mmol/L NaCl、ddH2O+200 mmol/L NaCl、ddH2O+0 mmol/L NaCl。待植株高达到3 cm时，以无菌水悬浮CKL1菌体，制成浓度为1×107 CFU/mL的CKL1菌悬液，取50 mL对植株进行灌根处理，对照组用同体积无菌水处理，每5天灌根一次，共2次灌根；灌根结束5 d后，用30 mL的200 mmol/L NaCl溶液进行灌根处理，即为盐胁迫，待胁迫结束5 d后取出燕麦幼苗，用无菌水将根冲洗干净，测量其株高和根长，擦干燕麦幼苗表面水分后测定鲜重并检测其生理生化特性[19-20]。
1.2.5 菌株CKL1促盐胁迫下燕麦的抗逆生理测定盐胁迫下叶绿素含量的测定：参考《植物生理学实验指导》[21]。燕麦叶片0.2 g剪碎至研钵中充分研磨，加入3 mL的80%丙酮继续研磨发白，静置5 min，过滤并用96%乙醇定容至25 mL棕色容量瓶中；以96%乙醇为空白，于665、649、470 nm处分别测定吸光度，按公式计算叶绿体色素含量。
盐胁迫下脯氨酸含量的测定：参考《植物生理学实验指导》[21]。燕麦叶片0.2 g，加入5 mL的8%磺基水杨酸溶液，水浴加热10 min，冷却至室温，加入冰乙酸和显色液继续加热40 min，甲苯萃取至分层，于520 nm处测定吸光度，按公式计算脯氨酸含量。
盐胁迫下丙二醛含量的测定：参考《植物生理学实验指导》[21]。燕麦叶片0.5 g，加入5 mL 10% TCA及少量石英砂进行研磨，4 000 r/min离心10 min；取上清液2 mL (对照加2 mL蒸馏水)，加入2 mL的0.6% TBA溶液，水浴加热15 min，迅速冷却，再次离心；于532、600、450 nm处分别测定上清液的吸光度，按公式计算丙二醛含量。
1.2.6 菌株CKL1全基因组测序芽胞杆菌CKL1接种于LB液体培养基中，以37 ℃、200 r/min振荡培养14 h，10 000 r/min离心10 min获取菌体，液氮速冻后，置于装有干冰的保温箱中送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序。
2 结果与分析 2.1 芽胞杆菌CKL1的拮抗病原真菌活性拮抗实验结果表明，菌株CKL1对禾谷镰孢菌、锐顶镰孢菌均可产生明显的抑菌圈，其中菌株CKL1拮抗锐顶镰孢菌抑菌圈平均直径为18 mm，具有显著的拮抗活性，能较大程度地抑制病原真菌的生长。说明芽胞杆菌可利用微生物之间拮抗、竞争作用阻止致病菌的菌丝生长(图 1)。
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| 图 1 芽胞杆菌CKL1拮抗病原真菌活性 Figure 1 Antagonistic activity of Bacillus CKL1 to pathogens. A：拮抗禾谷镰孢菌；B：拮抗锐顶镰孢菌 A: Antagonistic activity to Fusarium graminearum; B: Antagonistic activity to Fusarium acuminatum. |
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通过Salkowski显色法和IAA标准曲线对芽胞杆菌CKL1进行产IAA能力的定性、定量测定。将振荡培养的CKL1菌悬液与Salkowski比色液按比例混合至比色盘，静置30 min后溶液变红，表明芽胞杆菌CKL1具有产吲哚乙酸的能力；绘制IAA标准曲线，得到标准方程为y=0.018 9x+0.127 1，测得菌株CKL1在530 nm处的吸光度为0.279，计算出菌株CKL1在含100 mg/L色氨酸的金氏培养基中IAA的合成量为8.037 μg/mL (图 2)。
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| 图 2 芽胞杆菌CKL1产吲哚乙酸显色反应 Figure 2 Colorimetric reaction of Bacillus CKL1. |
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将菌株CKL1的菌液分别涂布于含NaCl浓度为3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%的LB固体培养基，置于37 ℃条件下培养。结果表明，菌株CKL1在含NaCl浓度为3%、5%、7%、9%、11%和13%的LB平板上均可正常生长，在含NaCl浓度为15%的LB培养基上不能正常生长，表现出一定的耐盐性(表 1)。
| Strain | Salt-resistance characteristic (%) | Low-temperature adaptability (℃) | ||||||||||
| 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 18 | 14 | 10 | 4 | ||
| CKL1 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ | − | +++ | +++ | +++ | + | |
| 注：+++：生长良好；++：正常生长；+：缓慢生长；−：不能生长 Note: +++: Growth well; ++: Growth normal; +: Growth slowly; −: Nonviable. |
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芽胞杆菌CKL1在14 ℃和18 ℃条件下，培养1 d后长出菌圈；10 ℃低温条件下，其生长和扩展较快，培养2 d后即出现明显的菌苔；4 ℃低温条件，可缓慢生长，在培养3 d后出现菌苔，表现出良好的低温适生性。因此，菌株CKL1对高原低温环境具有更好的耐受性(表 1)。
2.4 菌株CKL1促盐胁迫下燕麦的生长效应 2.4.1 CKL1促盐胁迫下燕麦种子萌发效应经CKL1菌悬液浸种的燕麦种子播种2 d后其发芽率高于CK组，而且在整个观察期中菌悬液浸种后的种子发芽率及发芽势都明显高于CK组，其中，第12天悬液浸种的燕麦种子发芽率为100%，CK组发芽率为80% (图 3)。测定菌悬液浸种与CK组已发芽的燕麦种子的芽长及根长，菌悬液浸种后芽长和根长的最大值分别为5.25 cm和3.75 cm，显著大于CK组，芽胞杆菌CKL1对芽长和根长的促生效果分别为79.83%和87.33% (图 3)。
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| 图 3 盐胁迫下CKL1促燕麦种子萌发及生长 Figure 3 The strain CKL1 promotes the germination of Avena sativa under salt stress. A：燕麦种子发芽数；B：燕麦种子萌发能力 A: Germination number of Avena sativa; B: Germination ability of Avena sativa. |
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用CKL1菌悬液(浓度为1×107 CFU/mL)对燕麦幼苗进行二次灌根，再以30 mL的200 mmol/L NaCl进行胁迫处理后，发现与ddH2O+200 mmol/L NaCl组相比其长势较好。测定燕麦幼苗的株高、根长及鲜重发现，盐胁迫下经菌株CKL1灌根对燕麦的生长有促进作用。CKL1+200 mmol/L NaCl组中测得燕麦植株的株高、根长及鲜重最大值分别为24.5 cm、12.2 cm和0.449 g，与ddH2O+200 mmol/L NaCl组相比其株高、根长及鲜重分别提高了44.54%、66.98%和45.42%，与ddH2O+0 mmol/L NaCl组相比其株高、根长及鲜重分别提高了40.61%、59.52%和130.81% (图 4，表 2)。实验结果表明，芽胞杆菌CKL1可减轻盐胁迫对燕麦生长的影响，促进燕麦生长，积累生物量。
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| 图 4 盐胁迫下CKL1对燕麦幼苗生物量的影响 Figure 4 Effects of strain CKL1 on boimass of Avena sativa under salt stress. |
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| Isolates | Aboveground part | Underground part | Fresh weight of seedling (g) | Weight increased effect (%) |
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| Average plant height (cm) |
Growth promoting effect (%) | Average root length (cm) |
Growth promoting effect (%) |
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| CKL1+200 mmol/L NaCl | 22.245±2.783 | 44.54* | 8.040±1.846 | 66.98* | 0.397±0.074 | 45.42* | |
| ddH2O+200 mmol/L NaCl | 15.390±1.371 | 0.00 | 4.815±1.358 | 0.00 | 0.273±0.064 | 0.00 | |
| CKL1+200 mmol/L NaCl | 22.245±2.783 | 40.61* | 8.040±1.846 | 59.52* | 0.397±0.074 | 130.81** | |
| ddH2O+0 mmol/L NaCl | 15.820±1.976 | 0.00 | 5.040±0.880 | 0.00 | 0.172±0.045 | 0.00 | |
| 注：±：标准差，*：在5%水平上差异显著，**：在1%水平上差异显著 Note: ±: Standard deviation, *: Significant difference at the 0.05 level, **: Significant difference at the 0.01 level. |
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测定盐胁迫下燕麦叶片中叶绿素含量，以CKL1菌悬液灌根处理后燕麦叶片中的叶绿素含量为27.002 mg/g-FW，与ddH2O+0 mmol/L NaCl组相比叶绿素含量稍有提高，但不明显；相较于ddH2O+200 mmol/L NaCl组，CKL1处理过的叶片中叶绿素含量明显提高(图 5)。推测芽胞杆菌CKL1对盐胁迫下燕麦的叶绿素降解有一定的抑制作用，从而使植株在盐胁迫下维持相对正常的光合作用。
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| 图 5 盐胁迫下CKL1对燕麦叶绿素含量的影响 Figure 5 Effect of CKL1 on chlorophyll content of Avena sativa in salt stress. |
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制作脯氨酸含量的标准曲线，得到标准方程为y=0.037 7x−0.009 7，获得各处理组的脯氨酸含量。在盐胁迫下，以CKL1菌悬液处理后的燕麦植株脯氨酸含量为20.309 μg/g-FW，相较于ddH2O+200 mmol/L NaCl组提高了25.25% (图 6)。说明芽胞杆菌CKL1可使遭受盐胁迫燕麦中的脯氨酸含量提高，通过细胞渗透调节减轻盐胁迫对燕麦的伤害。
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| 图 6 盐胁迫下CKL1对燕麦脯氨酸含量的影响 Figure 6 Effects of CKL1 on proline content of Avena sativa in salt stress. |
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植物在逆境胁迫下会发生膜脂过氧化作用，其产物丙二醛的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。CKL1菌悬液处理后燕麦幼苗的丙二醛含量为6.160 μmol/g-FW，ddH2O+200 mmol/L NaCl组与ddH2O+0 mmol/L NaCl组的丙二醛含量分别为5.447 μmol/g-FW和7.527 μmol/g-FW (图 7)。CKL1菌悬液处理后，燕麦在盐胁迫下丙二醛含量降低，说明芽胞杆菌CKL1能缓解燕麦植株在盐胁迫下的细胞膜脂过氧化作用，减缓细胞膜受到伤害。
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| 图 7 盐胁迫下CKL1对燕麦丙二醛含量的影响 Figure 7 Effects of CKL1 on malondialdehyde content of Avena sativa under salt stress. |
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全基因组测序结果表明，CKL1菌株基因组由一个DNA序列为4 281 280 bp的染色体组成，GC含量为43.0%，共编码4 078个蛋白；基因数量为4 305，具有16个rRNA，69个tRNA；CKL1与萎缩芽胞杆菌的相似性为89.723%，最接近的基因相似性达91.812 3%，2个基因簇之间的一致性达到91%；CKL1基因组序列在NCBI的登录号为NZ_PVWA00000000.1。
2.6.2 基因组功能注释将菌株CKL1的基因序列与GO数据库进行比对，共注释到3 303个功能基因，占基因总量的76.72%，划分为生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三类。其中与生物过程相关功能基因有907个，主要与转录调控、DNA模板、翻译及跨膜运输密切相关，也参与碳水化合物代谢、DNA修复等过程；与细胞组分相关功能基因有1 069个，主要与膜的组成成分、细胞质、质膜相关；与分子功能相关基因有1 642个，主要与ATP结合、DNA结合相关，同时也参与金属离子结合、转录因子活性、跨膜转运体活动、腺苷三磷酸酶活性等活动(图 8和图 9)。
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| 图 8 GO功能分类分析 Figure 8 Gene distribution based on GO classification. |
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| 图 9 COG注释聚类分析 Figure 9 Gene distribution based on COG classification. |
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(1) 拮抗活性相关基因分析
菌株CKL1可拮抗病原真菌禾谷镰孢菌、锐顶镰孢菌，又可知芽胞杆菌的拮抗活性与可产生具有拮抗活性的脂肽类抗生素有关。基因组序列分析表明：CKL1具有编码抑菌活性的脂肽化合物蛋白的基因簇，包括编码脂肽类化合物iturin合成的关键基因ituA、ituB和ituC，编码surfactin合成的关键基因srfATE、srfAC、srfAB和srfAA，表明菌株CKL1可通过非核糖体肽途径合成脂肽类抗菌物质伊枯草菌素(iturin)和表面活性素(surfactin)，拮抗病原真菌，抑制其生长(表 3)。此外，CKL1菌株具有编码细胞色素P450、甲基转移酶、ACP合成酶的PKS家族的基因pksS、pksR和pksF，这3个蛋白参与细胞的抗病促生作用。
| Gene names | Location | Length | Function |
| ituA | 28 596−40 541 | 11 946 | Iturin synthase gene, with inhibition of fungal activity |
| ituB | 40 592−56 683 | 16 092 | Iturin synthase gene, with inhibition activity |
| ituC | 56 958−64 571 | 7 614 | Iturin synthase gene, with inhibition activity |
| srfATE | 224 866−224 132 | 735 | Surfactin biosynthesis thioesterase gene |
| srfAC | 228 724−224 894 | 3 831 | Surfactin synthetase gene, with inhibition activity |
| srfAB | 239 512−228 743 | 10 770 | Surfactin synthetase gene, with inhibition activity |
| srfAA | 250 307−239 535 | 10 773 | Surfactin synthetase gene, with inhibition activity |
| pksS | 281 931−283 172 | 1 242 | Cytochrome P450, with antimicrobial activity |
| pksR | 291 002−283 278 | 7 725 | Methyltransferase gene, involved in growth-promoting gene expression |
| pksF | 353 688−352 441 | 1 248 | ACP synthase gene, regulated cell membrane fluidity |
| trpC | 735 425−736 177 | 753 | Involved in the tryptophan-dependent IAA synthesis pathway, associated with defense responses |
| trpB | 736 819−738 021 | 1 203 | Beta gene |
| trpA | 738 014−738 817 | 804 | Tryptophan synthase subunit alpha gene |
| − | 186 664−185 711 | 954 | Siderophore ABC transporter substrate-binding protein gene |
| mnhA | 71 395−73 815 | 2 421 | Na+/H+ antiporter subunit A, maintained normal growth under high salt stress |
| mnhB | 73 793−74 224 | 432 | Na+/H+ antiporter subunit B, maintained normal growth under high salt stress |
| mnhC | 74 224−74 565 | 342 | Na+/H+ antiporter subunit C, maintained normal growth under high salt stress |
| mnhD | 74 549−76 039 | 1 491 | Mrp gene, enhanced resistance to adversity and synergetic transport of serine |
| mnhE | 76 045−76 521 | 477 | Na+/H+ antiporter subunit E, maintained normal growth under high salt stress |
| mnhF | 76 521−76 805 | 285 | Na+/H+ antiporter subunit F, maintained normal growth under high salt stress |
| mnhG | 76 789−77 163 | 375 | Na+/H+ antiporter subunit G, maintained normal growth under high salt stress |
| proS | 420 054−418 360 | 1 695 | Proline-tRNA ligase gene, increased tolerance to osmotic stress |
| proC | 789 642−788 803 | 840 | Involved in proline synthesis, alleviated cell apoptosis |
| opuA | 298 729−297 584 | 1 146 | Betaine/proline/choline family ABC transporter ATP-binding protein gene |
| opuBD | 300 262−299 588 | 675 | Glycine betaine/carnitine/choline/choline sulfate ABC transporter permease gene |
| opuC | 301 203−300 286 | 918 | Osmotic transporter gene |
| desR | 895 474−894 875 | 600 | Response regulator transcription factor, involved in fatty acid synthesis |
| desK | 896 607−895 471 | 1 137 | Sensor histidine kinase gene, involved in low temperature response |
| yesM | 111 473−113 203 | 1 731 | Response regulator transcription factor, involved in metabolism and stress response |
| yesN | 113 203−114 330 | 1 128 | Response regulator transcription factor, involved in stress response |
| 注：−：未知基因 Note: −: Unknown gene. |
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(2) 促生相关功能基因分析
菌株CKL1可产生IAA从而促进植物生长(表 3)。基因组测序分析表明，CKL1基因组中包含编码与生长激素合成相关的关键基因trpC、trpB和trpA[22]，参与色氨酸依赖的IAA合成途径，直接促进植物生长。此外，发现CKL1存在一个未知基因具有铁载体能力，可提高植物体内铁素含量，诱导植物抗病性，间接促进植物生长[23]。
(3) 耐胁迫相关功能基因分析
据报道，植物应答胁迫的渗透调节物质包含K+、Na+、Ca2+等无机盐离子和甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖等小分子有机物。基因组测序分析表明，CKL1基因组中存在多个抗逆蛋白及编码渗透调节蛋白的基因簇，具有编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因簇，该基因簇包含mnhA、mnhB、mnhC、mnhD、mnhE、mnhF和mnhG；也具有编码脯氨酸、甜菜碱等渗透蛋白合成的基因簇，其中，基因proS、proC参与脯氨酸合成，可增加对渗透胁迫的耐性，OPU家族的opuA、opuBD和opuC编码渗透转运蛋白参与渗透调节，可缓解细胞凋亡。此外，转录调控因子关键基因desR、desK、yesM和yesN可参与高盐、低温胁迫应答[24]，菌株CKL1促进盐胁迫下燕麦体内脯氨酸含量明显变化，通过合成脯氨酸等渗透调节物质以提高植物抗逆性，促进燕麦生长(表 3)。
3 讨论与结论青海高原地处世界屋脊，具有沙化严重、植被稀少和土壤盐渍化等特点，燕麦(A. sativa)作为优质牧草，逐渐成为青海高寒牧区推广的栽培草种，是冷季喂养中不可或缺的优良牧草[25]，因此，提高燕麦在恶劣环境中的产草量和品质是维持青海省畜牧业持续发展和生态稳定的重要措施。据报道，在干旱、盐碱、低温等非生物胁迫条件下，植物根际促生菌能够通过调节植物乙烯合成速度，调控乙烯相关信号通路，诱导逆境蛋白的产生，从而缓解盐碱、干旱、水涝、温度等对植物的逆境胁迫[26]。因此，在极端生境中利用有益菌类使燕麦达到高产稳产是推进畜牧业可持续发展和维持高原生态良好的重要基础。
芽胞杆菌作为一类重要的生防细菌，通过拮抗作用、竞争作用、诱导抗性和促生作用等方式对植物起到防病促生作用[27]。崔文艳等[28]研究发现，解淀粉芽胞杆菌(B. amyloliquefaciens) B9601-Y2菌株能够抑制玉米叶斑病和茎基腐病的生长，促进植株生长。本研究中萎缩芽胞杆菌CKL1拮抗能侵染禾谷类作物及其他植物的禾谷镰孢菌(F. graminearum)和引起马铃薯干腐病的锐顶镰孢菌(F. acuminatum)，说明芽胞杆菌CKL1能有效防止病原真菌生长及扩散，提高植物抗病性，间接促进植物生长；并且发现菌株CKL1有产IAA的能力，通过促进植物细胞生长、分裂及分化直接促进植物生长。张慧等[29]研究发现，编码iturin蛋白的ituD基因是S44菌株抑菌活性、植物根际定殖与调控的关键因子，菌株CKL1全基因组测序表明，CKL1基因组中存在编码抑菌活性的脂肽化合物伊枯草菌素(iturin)和表面活性素(surfactin)的基因ituA、ituB、ituC及srfATE、srfAC、srfAB、srfAA，具有抗菌活性，可间接促进植物生长；CKL1基因组中也存在参与色氨酸依赖的IAA合成途径所必需的基因trpC及编码色氨酸合酶的基因trpB、trpA，可直接促进植物生长。
刘畅等[30]报道盐胁迫下施用木霉菌肥小麦叶片的丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于施用化肥的小麦。本研究中经CKL1菌悬液浸种后的燕麦种子在盐胁迫处理后萌发率可达100%，而且发芽速度较快，长势也优于对照；经CKL1菌悬液灌根处理后的燕麦幼苗在盐胁迫下其株高、根长、鲜重显著提高。燕麦幼苗经CKL1菌悬液处理后维持了燕麦植株在盐胁迫下相对正常的光合作用，测得其叶绿素含量均高于对照组；并且维持了燕麦在盐胁迫下的脯氨酸合成，通过积累较高水平的脯氨酸含量进行渗透调节从而提高燕麦的抗盐性；此外，燕麦在盐胁迫下的丙二醛含量显著降低，表明芽胞杆菌CKL1的处理可抑制燕麦细胞膜脂过氧化，降低膜脂过氧化产物丙二醛的积累，保护生物膜结构的完整性。综合可知，萎缩芽胞杆菌CKL1具有一定的耐盐性，而且对盐胁迫下燕麦的生长具有较好的促进作用。菌株CKL1基因组分析表明存在编码渗透调节物质的基因簇，其中，参与Na+/H+逆向转运蛋白合成的基因包括mnhA、mnhB和mnhC等，参与脯氨酸、甜菜碱等合成的基因簇包含proS、proC及OPU家族，参与转录调控的关键基因包含desR、desK、yesM和yesN。
萎缩芽胞杆菌CKL1具有低温适生性及耐盐性的特点，同时具有显著拮抗病原真菌活性及产吲哚乙酸的能力，在极端环境中具有更好的适应性，从而增强植物抗病性、促进植物生长，在盐碱地等贫瘠土壤植被恢复中具有一定的应用潜力。本研究综合菌株CKL1的生物学活性及基因组序列分析，揭示了盐胁迫下CKL1对燕麦的促生效应，展现了菌株CKL1良好的逆境适生能力及抗病促生能力，为利用促生菌促燕麦生长提供了优质菌株及理论依据。
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