产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌(extended- spectrum β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae，ESBL-KP)是当前全球严重的公共卫生问题，其产生的超广谱β-内酰胺酶(extended- spectrum β-lactamase，ESBL)由质粒介导，能水解单环类、头孢菌素类及青霉素类等药物，而且质粒可通过接合、转化和传导等形式导致携带的耐药基因扩散，使细菌产生多重耐药，增加治疗难度与病死率^[1-2]。ESBL-KP在肉制品^{[1, 3]}、乳制品^[4]及环境^[5]中广泛存在。研究表明，从生鸡肉分离获得的克雷伯菌中主要的ESBL基因和质粒也存在于临床分离株中^[6-8]，表明食品尤其是肉制品可能是ESBL细菌传播给人类的途径^[9]。机会性致病的ESBL-KP易导致食用受污染生禽产品的人患病，由于其广泛的耐药性且缺乏有效治疗疾病的抗生素，所以食品及食品原料中ESBL-KP的防控尤为重要。目前用于降低食品中致病菌风险的控制措施主要包括γ射线照射、气调包装、化学防腐剂和生物防腐剂等^[10]，但是这些方法存在设备和技术等方面的局限性。因此，寻找一种安全有效的方法来控制食品中的ESBL-KP至关重要。

蓝莓(Vaccinium corymbosum)又称蓝浆果，富含多酚类化合物，其提取物不仅具有抗衰老、保护视力、抗氧化、降脂等功能，还对食源性致病菌具有良好的抑制作用^[11-14]。目前，研究发现蓝莓提取物对副溶血性弧菌^[15]、肠炎沙门氏菌^[16]、霍乱弧菌^[17]和金黄色葡萄球菌^[18]均有显著杀菌作用。蓝莓提取物能在18 h内将三文鱼中副溶血性弧菌的菌落总数降低3.2 Log₁₀ (CFU/mL)^[15]。此外，蓝莓渣花色苷^[19]和蓝莓叶多酚^[20]能抑制鲈鱼中的菌落总数，延长其贮藏时间。Gato等^[21]研究发现，蓝莓多酚提取物能显著抑制耐药肺炎克雷伯菌生物被膜的形成，降低细菌在HT-29细胞上的黏附性。然而蓝莓提取物对ESBL-KP的抑菌活性及在牛乳中的抑菌机制尚不明确。本研究拟以黑珍珠(Vaccinium corymbosum L.)和巴尔德温(Vaccinium ashei)这2种蓝莓品种为原料，探究蓝莓提取物对3株产ESBL肺炎克雷伯菌的抑制作用及相关机制，以期为防控病原微生物、加强食品安全和提升蓝莓的应用价值提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 蓝莓

黑珍珠蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)购于上海市新浜蓝莓种植园；巴尔德温蓝莓(Vaccinium ashei)购于上海市敏蓝蓝莓种植园。选取个体均一且大小一致的果实，将其采摘后储存于−80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 菌株

肺炎克雷伯菌KP106、KP305、KP408分离自生牛乳中，保存于农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估重点实验室(上海)；大肠埃希菌(Escherichia coli) ATCC 25922购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.1.3 培养基主要试剂和仪器

LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、Mueller-Hinton琼脂(MHA)，北京陆桥技术股份有限公司。甲醇、98%甲酸、氢氧化钠、冰醋酸、盐酸、氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；福林酚溶液，上海源叶生物有限公司。抗生素药敏纸片[氨苄西林(ampicillin)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢他啶-克拉维酸(ceftazidime-clavulanate)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢噻肟-克拉维酸(cefotaxime-clavulanate)、美罗培南(meropenem)、四环素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、阿奇霉素(azithromycin)、红霉素(erythromycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、氯霉素(chloramphenicol)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、呋喃妥因(furantoin)]，北京天坛药物生物技术开发公司。

酶标仪，BioTek公司；共聚焦激光扫描显微镜，Cavl Zeiss公司；旋转蒸发仪、电热恒温水浴锅，上海申生科技有限公司；ESCO生物安全柜，上海生叉贸易有限公司；恒温振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 蓝莓提取物制备

取冷冻蓝莓果实，微波加热3 min解冻后放入匀浆机中充分匀浆。随后取20 g蓝莓匀浆置于三角瓶中，加入体积比为85:14.5:0.5的甲醇: 水: 甲酸溶液后，以200 W功率的超声波辅助提取5 min，涡旋30 s后继续超声5 min。随后4 500 r/min离心15 min收集上清液。反复浸提，最终料液比为1:10。将上清液进行隔膜抽滤后，旋转蒸发至恒重，用无菌去离子水定容至10 mL，得到浓度为2 000 mg/mL的巴尔德温和黑珍珠蓝莓提取物，置于−20 ℃备用^[16]。

1.3 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalte法^[22]测定2种蓝莓提取物中的总酚含量。取1 mL样品定容至10 mL进行10倍倍比稀释。从中取1 mL加入到5 mL 10%福林酚中，混匀后静置4−7 min，加入4 mL 7.5%碳酸钠溶液，在室温下孵育1 h后于765 nm处测定吸光度值。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，并按公式(1)计算出总酚的含量。

(1)

式中，ω为总酚含量(mg/g)；C为没食子酸浓度(mg/mL)；V为样品体积(mL)；N为稀释倍数；M为样品质量(g)。

1.4 花青素含量的测定

蓝莓提取物中花青素浓度的检测使用pH值示差法^[23]。取1 mL制备的蓝莓提取物加到4 mL pH 1.0的氯化钾或4 mL pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液中，涡旋待其混合均匀后分别在520 nm和700 nm处检测吸光度值。根据公式(2)计算提取物中花青素浓度：

(2)

式中，A=(A₅₂₀−A₇₀₀)_{pH 1.0}−(A₅₂₀−A₇₀₀)_{pH 4.5}，A为最终吸光度；ξ为矢车菊定-3-葡萄糖苷(cyanidin- 3-glucoside)的摩尔吸收系数(26 900)；M_W为摩尔质量(449.2)；DF为稀释倍数。

1.5 肺炎克雷伯菌耐药谱测定

1.5.1 肺炎克雷伯菌耐药谱检测

采用美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推荐的药敏纸片法检测肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢唑林、头孢他啶、头孢噻肟、美罗培南、四环素、多西环素、庆大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、红霉素、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、磺胺甲噁唑和呋喃妥因共16种抗生素的敏感性。将肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408接种于5 mL LB肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养过夜后，取100 μL培养物重新接种于5 mL的LB肉汤中，37 ℃、200 r/min摇床中培养4 h至10⁹ CFU/mL，3 000 r/min离心10 min后重悬于等体积生理盐水中，并稀释至10⁶ CFU/mL，用无菌棉签将菌液涂布于MHA平板后，将抗生素纸片贴于MHA平板上，37 ℃培养16−18 h后测量抑菌圈直径。以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌。根据文献[24]评价肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性。

1.5.2 产ESBL肺炎克雷伯菌的验证

采用CLSI推荐的药敏纸片法进行肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP403的ESBL试验。将头孢他啶/头孢他啶-克拉维酸、头孢噻肟/头孢噻肟-克拉维酸抗生素纸片贴于接种了肺炎克雷伯菌KP106、KP305或KP408的MHA平板上，37 ℃培养16−18 h后测量抑菌圈直径。以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌。根据文献[24]，头孢他啶或头孢噻肟中任何一种药物加与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增加5 mm及以上时判定为产ESBL。

1.6 蓝莓提取物的MIC和MBC测定

采用微量肉汤稀释法^[25]测定蓝莓提取物对肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408的MIC和MBC。向96孔板中加入100 μL LB肉汤，取100 μL蓝莓提取物在96孔板中连续2倍倍比稀释。取100 μL对数期的肺炎克雷伯菌KP106、KP305或KP408菌液加入到96孔板中，蓝莓提取物的终浓度为200、100、50、25、12.5和6.25 mg/mL，以不含蓝莓提取物的LB肉汤培养基作为对照。将96孔板置于37 ℃培养24 h，培养后无肉眼可见菌落生长的最小蓝莓提取物浓度为MIC，取无肉眼可见菌落生长的培养物在LB平板上涂布，37 ℃培养24 h后无菌落生长的最小蓝莓提取物浓度为MBC^[26]。

1.7 蓝莓提取物对ESBL-KP生长的影响

根据Lu等^[27]的方法向试管中加入2 mL含有2种蓝莓提取物(0、1×MIC和2×MIC)的LB肉汤培养基，取10 μL对数期的菌液分别接种到上述试管中，37 ℃、200 r/min摇床培养，在培养0、2、4、6、8、12和24 h时，取出培养的试管，连续10倍倍比稀释后涂布于LB平板上，37 ℃培养24 h后对菌落进行计数，绘制生长曲线。

1.8 蓝莓提取物对ESBL-KP细胞膜完整性的影响

采用荧光染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察蓝莓提取物对细胞膜完整性的影响^[28]。将对数期的肺炎克雷伯菌菌液在LB肉汤培养基中稀释至OD₆₀₀为0.5，然后用25 mg/mL和50 mg/mL的黑珍珠蓝莓提取物处理6 h，以不含蓝莓提取物的LB肉汤培养基作为对照。将培养物在4 ℃、8 000 r/min离心5 min后，弃去上清并重新悬浮于0.85%生理盐水中。根据LIVE/DEAD试剂盒说明书，用SYTO 9和碘化丙啶(propidium iodide，PI)对细胞进行染色后，通过共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

1.9 蓝莓提取物对牛乳中ESBL-KP的抑菌活性

参考Zhang等^[26]的方法向试管中加入2 mL巴氏灭菌牛乳，将制备的黑珍珠蓝莓提取物进行2倍倍比稀释，使牛乳中蓝莓提取物的终浓度为25−200 mg/mL。取10 μL培养至对数期的肺炎克雷伯菌加到含有不同浓度蓝莓提取物的试管中，以不含蓝莓提取物的巴氏灭菌牛乳为对照，将试管置于25 ℃培养24 h，每间隔6 h将培养物取出，连续10倍倍比稀释后涂布于LB平板上，37 ℃培养24 h后对平板上的菌落进行计数。

1.10 数据统计与分析

所有实验重复3次，采用GraphPad Prism 9软件对实验结果进行统计分析并作图。

2 结果与分析 2.1 两种蓝莓提取物中总酚和花青素的含量

多酚和花青素对病原菌具有良好的抑制作用，本研究检测了2种蓝莓提取物中的总酚和花青素的含量。如表 1所示，巴尔德温蓝莓提取物中总酚和花青素含量分别为2.3 mg/g和67.5 mg/100 g。与巴尔德温蓝莓相比，黑珍珠蓝莓提取物含有的总酚和花青素更高，分别为3.5 mg/g和92.5 mg/100 g。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐药性

2.2.1 肺炎克雷伯菌耐药性检测结果

肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408对八大类16种常用抗生素的耐药性结果如表 2所示，KP305的耐药性最强，对12种抗生素(氨苄西林、头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻肟、四环素、多西环素、卡那霉素、阿奇霉素、红霉素、环丙沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑)均耐药。KP106对氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻肟、四环素、卡那霉素、红霉素、氯霉素和磺胺甲噁唑共8种抗生素耐药。KP408对氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻肟、四环素、多西环素、红霉素和磺胺甲噁唑共7种抗生素耐药。耐药性检测结果表明，肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408均为多重耐药菌株。

2.2.2 ESBL-KP菌株的验证

ESBL-KP的鉴定结果如表 3所示，头孢他啶和克拉维酸联合使用对菌株KP106、KP305和KP408的抑菌圈直径分别为21、22和27 mm，比单独使用头孢他啶分别增加了3、6和8 mm。头孢噻肟和克拉维酸联合使用对菌株KP106、KP305和KP408的抑菌圈直径分别为26、31和31 mm，与单独使用头孢噻肟的抑菌圈相比分别增加了14、18和17 mm。因此，与头孢噻肟相比，头孢噻肟-克拉维酸对3株肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径增加5 mm以上，因此肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408均为ESBL-KP菌株。

2.3 蓝莓提取物的MIC和MBC

巴尔德温和黑珍珠蓝莓提取物对3株ESBL-KP的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度如表 4所示，2种提取物对3株ESBL-KP均具有显著的抑菌和杀菌作用。巴尔德温蓝莓提取物对肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408的MIC均为25 mg/mL，MBC均为50 mg/mL。黑珍珠蓝莓提取物对3株肺炎克雷伯菌的MIC和MBC与巴尔德温蓝莓提取物相同，MIC均为25 mg/mL，MBC均为50 mg/mL。

2.4 蓝莓提取物对ESBL-KP生长的影响结果

为研究蓝莓提取物对ESBL-KP生长的影响，测定了蓝莓提取物处理3株产ESBL肺炎克雷伯菌24 h内的生长曲线。如图 1所示，培养24 h后，未经蓝莓提取物处理的肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408菌落总数达到9.0−9.4 Log₁₀ (CFU/mL)，比初始接种量增加了2.7−3.6 Log₁₀ (CFU/mL)。经过25 mg/mL的巴尔德温蓝莓或黑珍珠蓝莓提取物处理24 h后，3株肺炎克雷伯菌的菌落总数与对照组相比下降了2.9−3.6 Log₁₀ (CFU/mL)，与初始接种量相比下降了0.1−1.1 Log₁₀ (CFU/mL)，表明肺炎克雷伯菌的生长受到明显抑制。当2种提取物的浓度增加到50 mg/mL时，能在6−8 h内将菌株KP106、KP305和KP408全部杀死。巴尔德温蓝莓与黑珍珠蓝莓提取物对产ESBL肺炎克雷伯菌株的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度和抑菌活性无显著性差异，因此选择黑珍珠蓝莓提取物进行后续试验。

2.5 蓝莓提取物对ESBL-KP细胞膜完整性的影响结果

荧光染料SYTO9能通过结构完整的细胞膜进入活细胞产生绿色荧光，PI能进入细胞膜结构受损的细胞产生红色荧光，采用荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)观察蓝莓提取物对细胞膜完整性的影响。如图 2所示，未经蓝莓提取物处理过的菌株KP106、KP305和KP408细胞呈明亮的绿色荧光，表明细胞膜结构完整。经过25 mg/mL蓝莓提取物处理过后，绿色荧光减少、红色荧光增多；当用50 mg/mL的蓝莓提取物处理6 h后，菌株KP106、KP305和KP408的红色荧光显著增加、绿色荧光大量减少甚至完全消失，表明蓝莓提取物能破坏产ESBL肺炎克雷伯菌细胞膜的完整性。

2.6 蓝莓提取物在牛乳中的抑菌活性

为了研究牛乳基质对蓝莓提取物抑菌活性的影响，检测了不同浓度的黑珍珠蓝莓提取物对牛乳中产ESBL肺炎克雷伯菌的抑菌活性。如图 3所示，与未添加蓝莓提取物的对照组相比，25 mg/mL和50 mg/mL蓝莓提取物明显抑制了菌株KP106、KP305和KP408的生长，生长速率降低；当用100 mg/mL的蓝莓提取物处理时，牛乳中3株肺炎克雷伯菌的生长完全被抑制，培养24 h后活菌数比初始接种量分别降低了0.24、0.71和0.14 Log₁₀ (CFU/mL)；当用200 mg/mL的蓝莓提取物处理6 h后，未检测到菌株KP106、KP305和KP408的活菌数，表明黑珍珠蓝莓提取物能有效抑制或杀灭牛乳中的产ESBL肺炎克雷伯菌。

3 讨论与结论

蓝莓中含有丰富的总酚和花青素，其含量分别为206.2−460.4 mg/100 g和20.2−128.0 mg/100 g^[29]，本研究通过甲醇萃取制备了巴尔德温蓝莓和黑珍珠蓝莓2种蓝莓提取物，总酚和花青素含量与报道一致，总酚含量分别为2.3 mg/g和3.5 mg/g，花青素含量分别为67.5 mg/100 g和92.5 mg/100 g。田恒等^[30]采用纤维素酶和果胶酶辅助丙酮提取金寨蓝莓花青素，最佳提取率分别为118.93 mg/100 g和56.64 mg/100 g。可见，蓝莓品种、提取方式、产地等差异都会导致其总酚和花青素含量的不同。

蓝莓提取物对ESBL-KP有显著的抑制和杀灭作用，其MIC值为25 mg/mL，MBC值为50 mg/mL。杨天龙等^[31]研究发现青刺尖的石油醚和乙酸乙酯提取物分别在156.3−2 500.0 mg/mL、312.5−2 500.0 mg/mL时对肺炎克雷伯菌呈现剂量依赖性的抑制作用。程招敏等^[32]发现黄芩、黄连和鸡血藤对泛耐药肺炎克雷伯菌也具有抑制作用，但其MIC (64、128、256 mg/mL)均高于本研究结果。中国野生蓝莓提取物对革兰氏阳性菌(如单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(如沙门氏菌和副溶血性弧菌)均具有良好的抑菌活性，MIC为12.5−100.0 mg/mL^[18]，而且革兰氏阴性菌对蓝莓提取物更敏感，可能由于革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖细胞壁，可以保护细胞免受恶劣环境的侵害^[17]。Cerezo等^[33]发现4种蓝莓(Snowchaser、Star、Stella Blue和Cristina Blue)的花青素提取物对导致尿路感染的肺炎克雷伯菌的MIC和MBC均为9.52 mg/mL，低于本研究结果，花青素提取物对肺炎克雷伯菌具有更高的抑菌活性，表明蓝莓中主要的抑菌活性物质可能是花青素^[18]，因此，后续可进一步研究蓝莓花青素对ESBL-KP的抑制作用及抑菌机制。

目前天然产物的作用方式主要有：改变细胞膜的通透性，引起细胞内离子失衡；破坏细胞膜结构，使核酸、蛋白质等生物大分子泄漏；进入细菌细胞内部干扰蛋白合成等^[34-36]。本研究中共聚焦激光扫描显微镜的结果表明，蓝莓提取物的作用机制可能是破坏肺炎克雷伯菌的细胞膜结构，造成细胞膜破损，导致细胞发生致命性的损伤。有研究表明蓝莓提取物能破坏副溶血性弧菌细胞膜完整性，使细胞内的核酸和蛋白质等大分子泄漏^[18]。细胞膜在细胞质和细胞外介质之间充当屏障的作用，使细胞选择性地控制其内部环境，维持正常的生理活性。

食品中成分复杂，容易对防腐剂或抑菌剂产生影响，如蛋白质^[37]、脂肪^[38]和碳水化合物^[39]等食品基质可能与抑菌成分发生作用，降低其抑菌活性。有研究表明，乳酸链球菌肽可能与牛乳中的磷脂相互作用，使其无法有效接触细菌而导致抑菌能力降低^[40]。Zheng等^[10]研究发现200×MIC的辅酶Q0才能完全杀死虾肉中的副溶血性弧菌。本研究中，25−50 mg/mL的黑珍珠蓝莓提取物能抑制或杀灭培养液中的肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408；在牛乳模型试验中，100 mg/mL的黑珍珠蓝莓提取物能完全抑制肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408的生长并持续至少24 h，200 mg/mL的黑珍珠蓝莓提取物能在6 h内将肺炎克雷伯菌完全杀死。因此，蓝莓提取物受牛乳基质影响较小，能有效抑制牛乳中肺炎克雷伯菌的生长。

综上所述，蓝莓提取物中含有丰富的多酚和花青素，能通过破坏细胞膜的完整性对产ESBL肺炎克雷伯菌发挥抗菌作用，而且受牛乳中基质影响较小，具有较高的应用潜力，但蓝莓提取物在牛乳中的应用或作为食品安全和健康的营养补充剂有待进一步研究。