2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 武天上, 薛雅蓉, 刘常宏
- WU Tianshang, XUE Yarong, LIU Changhong
- 贝莱斯芽孢杆菌CC0955发酵培养基优化及其泡腾颗粒的研制
- Optimization of fermentation medium and preparation of effervescent granules of Bacillus velezensis CC0955
- 微生物学通报, 2022, 49(7): 2599-2611
- Microbiology China, 2022, 49(7): 2599-2611
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.211034
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文章历史
- 收稿日期: 2021-11-05
- 接受日期: 2021-12-31
- 网络首发日期: 2022-01-28
微生物农药属于生物农药，其中以芽孢杆菌为核心的微生物农药已广泛应用于农业生产。国内已成功开发并上市的芽孢杆菌制剂有“百抗”水剂和“纹曲宁” “根腐消”可湿性粉剂等，它们对水稻纹枯病等病害有较好的防治效果。据统计，在我国已登记的微生物农药产品中，可湿性粉剂占比超过50.0%，悬浮剂占比为28.6%，二者总和占比近80.0%[1]。不难看出，我国农用微生物农药存在剂型单一的问题。另外，虽然以含有活菌的发酵液制备的水剂产品防效显著，但由于运输和储存难度大，生防菌存活期短[2]，不适合大规模推广使用[3]。因此，开发出长效、易用的生防产品新剂型就显得很有必要。
泡腾剂是一种相对新颖的剂型，在食品和中药行业比较常见[4-5]，然而在农药领域报道较少且多为除草剂[6-7]。相对液体制剂如水剂和乳油等，泡腾剂有易于储存和运输的特性；而相对于固体制剂如粉剂和可湿性粉剂，泡腾剂制备过程中产生的粉尘污染较少[8]。此外，泡腾剂遇水迅速崩解，具有速释功能。农业上应用泡腾剂能够省时省力，基于目前农村青壮年劳动力短缺的现状和植保专业化的需要[9]，细菌泡腾剂在植物生物防治上有较好的应用前景，符合农药发展的安全性和方便性等要求。
贝莱斯芽孢杆菌CC0955是分离自樟树叶片内生细菌CC09的抗利福平突变株，与野生菌株相比，该突变菌株具有更强的生防潜力，其发酵液及提纯产物对禾谷镰刀菌、立枯丝核菌和白地霉等常见植物病原菌均表现出较强的体外生长抑制活性[10]。本文通过发酵培养基的响应面优化，采用非水制粒法[11]制备该突变株的泡腾颗粒制剂，并评价了其物理性质和抑菌效果，以期为防治植物真菌病害提供新的选择。
1 材料与方法 1.1 供试菌株和样品Bacillus velezensis CC0955为本实验室获得的抗利福平突变菌株[10]，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani ATCC 13289)、姜茎腐霉菌(Pythium myriotylum ACCC 36294)和番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea ATCC 12481)由南京农业大学植物保护学院惠赠。创两优276水稻种子，江苏神农大丰种业科技有限公司；合作903大红番茄，上海长种番茄种业有限公司。
1.2 主要试剂和仪器葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；白炭黑、高岭土、滑石粉、膨润土、硅藻土、PVP-K30，上海源叶生物科技有限公司；一水柠檬酸、碳酸氢钠，麦克林生化试剂有限公司；黄腐酸钾，江苏渔水灵生物科技有限公司；PDA培养基，青岛海博生物；LB培养基，生工生物工程(上海)股份有限公司。
灭菌锅，智微科技有限公司；摇床，上海知楚仪器有限公司；烘箱，上海博迅实业有限公司；恒温培养箱，精宏仪器有限公司；pH计，上海雷磁仪器厂。
1.3 CC0955发酵培养基的响应面优化 1.3.1 Plackett-Burman实验设计前期实验结果显示，CC0955菌株在由蛋白胨9.0，酵母粉3.0，葡萄糖10.0，K2HPO4 0.2，MgSO4⋅7H2O 0.2组成的培养基(g/L)中发酵48 h，其发酵液对立枯丝核菌的抑制率相对较高，为51.11%。基于此培养基，采用Design-Expert软件进行了n=12的Plackett-Burman摇瓶发酵优化[12]，以发酵液对立枯丝核菌的抑制率(菌丝生长速率法)为响应值，考察了培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4和MgSO4⋅7H2O这5个因素对CC0955发酵液抑菌率的影响。计算每个因素的T效应值，并通过Plackett-Burman试验的F值检验及显著性分析，从5个因素中选出对发酵液抑菌率有明显影响的因素。
1.3.2 中心组合试验检测显著影响因子之间的交互作用根据Plackett-Burman试验结果，选出2个对抑菌率有显著性影响的因素——蛋白胨和K2HPO4，分别用A和B表示，并确定中心点数值，在固定其他因素的条件下，对A和B进行2因素5水平的中心组合设计，共13组试验，最后基于中心组合设计试验结果及响应面分析，获得抑菌率最高的CC0955菌株发酵培养基。
1.4 泡腾颗粒的制备 1.4.1 吸附载体的筛选参考蔡勋超等[13]的方法，评估了白炭黑、高岭土、滑石粉、膨润土和硅藻土载体对CC0955菌株的吸附性和生物相容性，以筛选最佳吸附载体。
载体吸附能力测定：分别将2 g载体置于不同的锥形瓶中，然后用移液枪吸取含菌发酵液，缓慢加入锥形瓶中，直至载体呈液体流动状为止，记录添加的发酵液体积。
生物相容性测定：在LB琼脂培养基中添加5%的载体，采用涂布平板法接种菌株CC0955，于37 ℃培养24 h，计数含各载体平板上的菌落形成单位(CFU)，不含载体的平板为对照(CK)，重复3次，计算各载体对菌株CC0955的生物相容性。生物相容性(%)=(处理组的CFU/CK的CFU)×100。
1.4.2 正交设计优化泡腾颗粒配方参考文献[14-15]确定泡腾颗粒的崩解剂为柠檬酸和碳酸氢钠。根据1.4.1的结果，吸附载体选择白炭黑。配料为黄腐酸钾，其既可作为pH调节剂中和柠檬酸，又可为植物补充钾元素。
以泡腾颗粒的活菌数和pH为指标[16]，优化碳酸氢钠与柠檬酸的摩尔比(A)、白炭黑(B)和黄腐酸钾(C)这3个因子的组成水平，其中A的3个水平分别为1.0、2.0和3.0 (C6H7O7⋅H2O为1.05 g；当A=1.0时，NaHCO3为0.42 g；当A=2.0时，NaHCO3为0.84 g；当A=3.0时，NaHCO3为1.26 g)；B的3个水平分别为0.5、1.0、1.5 g；C的3个水平分别为10.0、20.0、30.0 mg。通过极差分析，获得影响泡腾颗粒质量的关键因素。
1.4.3 泡腾颗粒的制备基于1.4.2的优化结果，采用非水制粒法[11]制备泡腾颗粒。制备步骤：称取1.50 g白炭黑，按1:3 (质量体积比)的比例吸附CC0955菌株发酵液，于50 ℃烘箱中干燥除去水分；然后再与1.05 g C6H7O7⋅H2O、0.84 g NaHCO3、0.03 g黄腐酸钾混合均匀，加入黏合剂PVP-K30乙醇溶液4 mL使其湿润黏合，移至模具中(规格为直径0.8 cm，高1 cm的空心圆柱)压实成型后取出，40 ℃烘干制得成品。
1.5 泡腾颗粒物理性质评价 1.5.1 密度用分析天平测得泡腾颗粒的质量m，卡尺测量颗粒的直径d和高h，则泡腾颗粒的密度可通过公式ρ=4m/πd2h。重复测量3次。
1.5.2 崩解时间和溶液pH在室温下(25 ℃)将1 g泡腾颗粒放到含有99 mL水的250 mL烧杯中(pH 7.0)[17]，完全崩解后记录其崩解时间，然后用pH计测定溶液的pH值，重复3次。
1.5.3 泡腾颗粒活菌计数称取0.1 g泡腾颗粒，置于9.9 mL无菌水中充分涡旋崩解，再将溶液稀释102倍，吸取100 μL均匀涂布于LB平板(3个重复)，37 ℃恒温箱培养24 h后计数。泡腾颗粒室温下放置6个月后再重复上述实验，计算菌存活率。
1.6 对常见植物病原菌的毒力回归方程和EC50通过前期预试验获得正式实验的浓度范围，分别称取一定量的泡腾颗粒溶于10 mL无菌水中，获得终浓度为5、10、20、40、80和100 mg/mL的悬液；分别取1 mL，制备含不同浓度悬液的PDA培养基；以含等量无菌水的PDA平板作为对照。然后接种立枯丝核菌、姜茎基腐霉菌和番茄灰霉病菌菌饼(直径5 mm)，28 ℃培养36 h，测量菌丝生长直径，计算抑制率，每个处理重复4次。
抑制率(%)=[(对照病菌直径−5)−(处理病菌直径−5)]/(对照病菌直径−5)×100[18]。
按照程根武等[19]的方法，计算菌株CC0955泡腾颗粒抑制供试病原真菌的毒力回归方程和EC50。
1.7 泡腾颗粒与原始发酵液效果比较采用与1.6相同的皿内抑菌实验方法，比较CC0955菌株发酵液与含等量发酵液的泡腾颗粒抑制3种病原真菌活性的差异，考察泡腾颗粒制备过程对CC0955菌株发酵液抑菌活性的影响。
1.8 泡腾颗粒对水稻纹枯病和番茄灰霉病的防治效果 1.8.1 泡腾颗粒对立枯丝核菌侵染水稻幼苗的防治效果将营养土、蛭石、珍珠岩以50:25:25 (质量比)的比例混合，在0.12 MPa下蒸汽灭菌20 min后装入组培瓶(高10.5 cm，直径6.5 cm)，表面平整后播种经过表面消毒的饱满水稻种子10颗/瓶，于25 ℃培养20 d。参考易润华等的方法[20]，制备立枯丝核菌菌核接种体并接种于水稻根部土壤。然后将等量的30倍稀释CC0955发酵液、粉剂、泡腾颗粒溶液(1 g样品溶于30 mL无菌水中)分别施入水稻根部，施入等量的无菌水作为阳性对照。既不接种立枯丝核菌也不使用CC0955菌株产品的健康植株为阴性对照。其中粉剂为实验室早期制备[13]。各处理重复3次。于14 h光照、10 h黑暗、温度25 ℃和湿度85%条件下培养12 d，调查水稻幼苗的发病情况，计算病情指数与防治效果[21]。
病情指数=[∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)]×100；
防治效果(%)=[(空白对照病指–处理组病指)/空白对照病指]×100。
1.8.2 泡腾颗粒对灰霉菌侵染番茄的防治效果采用与1.8.1相同的种植方法在加仑盆中(高10 cm，直径11 cm)培育番茄至六叶期，高15 cm左右。参考周小江等的方法[22]制备106 CFU/mL的孢子悬浮液并接种于番茄叶面上。然后将等量30倍稀释CC0955发酵液、粉剂、泡腾颗粒溶液分别喷洒于番茄叶面，喷洒等量的无菌水为阳性对照。既不接种番茄灰霉菌也不使用CC0955菌株产品的健康植株为阴性对照。各处理重复3次。将番茄置于23 ℃、湿度90%的黑暗环境中培养24 h，之后保持同样温度和湿度，14 h光照/10 h黑暗条件下培养4 d，调查番茄叶面发病情况，计算病情指数与防治效果[22]。
2 结果与分析 2.1 CC0955发酵培养基的响应面优化 2.1.1 Plackett-Burman筛选关键因素的结果Plackett-Burman的试验结果见表 1，处理8组抑菌率最高，为77.05%，处理6组抑菌率最低，为60.66%。试验结果的统计分析(表 2)显示模型显著(P=0.047 2)；此外，蛋白胨(P=0.031 6)和K2HPO4 (P=0.010 4)两因素的影响达到显著水平。试验结果的t-效应值分析表明(图 1)，葡萄糖、蛋白胨、MgSO4⋅7H2O对CC0955菌株发酵液抑制立枯丝核菌有正效应(灰色)，而酵母粉和K2HPO4对CC0955菌株发酵液抑制立枯丝核菌有负效应(黑色)。
| Group | Glucose (g/L) | Peptone (g/L) | Yeast powder (g/L) | K2HPO4 (g/L) | MgSO4·7H2O (g/L) | Inhibition rate (%) |
| 1 | 15 | 12 | 1 | 0.4 | 0.4 | 67.21 |
| 2 | 5 | 12 | 5 | 0.1 | 0.4 | 73.77 |
| 3 | 15 | 6 | 5 | 0.4 | 0.1 | 60.66 |
| 4 | 5 | 12 | 1 | 0.4 | 0.4 | 67.21 |
| 5 | 5 | 6 | 5 | 0.1 | 0.4 | 70.49 |
| 6 | 5 | 6 | 1 | 0.4 | 0.1 | 60.66 |
| 7 | 15 | 6 | 1 | 0.1 | 0.4 | 73.77 |
| 8 | 15 | 12 | 1 | 0.1 | 0.1 | 77.05 |
| 9 | 15 | 12 | 5 | 0.1 | 0.1 | 70.49 |
| 10 | 5 | 12 | 5 | 0.4 | 0.1 | 70.49 |
| 11 | 15 | 6 | 5 | 0.4 | 0.4 | 63.93 |
| 12 | 5 | 6 | 1 | 0.1 | 0.1 | 65.57 |
| Source | Sum of squares | df | Mean square | F value | P value Prob > F |
| Model | 233.94 | 5 | 46.79 | 4.510 | 0.047 2 |
| Glucose | 2.02 | 1 | 2.02 | 0.190 | 0.674 8 |
| Peptone | 80.81 | 1 | 80.81 | 7.790 | 0.031 6 |
| Yeast powder | 0.22 | 1 | 0.22 | 0.022 | 0.888 0 |
| K2HPO4 | 139.95 | 1 | 139.95 | 13.480 | 0.010 4 |
| MgSO4⋅7H2O | 10.94 | 1 | 10.94 | 1.050 | 0.344 1 |
| Residual | 62.28 | 6 | 10.38 | ||
| Cor total | 296.22 | 11 |
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图 1 Plackett-Burman试验各因素对CC0955菌株发酵液抑菌率的影响
Figure 1 Effects of various factors on inhibition rate of strain CC0955 fermentation broth in Plackett-Burman test.
 ：正效应； ：负效应
: Positive effect; : Negative effect.
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根据2.1.1的结果，在固定其他因素的条件下(葡萄糖15.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，MgSO4⋅7H2O 0.4 g/L)，采用2因素5水平的中心组合设计方法，研究了蛋白胨和K2HPO4两因素对CC0955菌株发酵液抑菌活性的影响，结果见表 3。统计分析显示(表 4)，P=0.006 9 < 0.05，Lack of fit= 0.822 > 0.1，表明模型可靠。两因素对CC0955菌株发酵液抑菌率影响见图 2。当蛋白胨为12.00 g、K2HPO4为0.05 g时抑菌率最大，为90.60%。据此获得CC0955菌株的最佳发酵培养基组成为：蛋白胨12.00 g/L，酵母粉1.00 g/L，葡萄糖15.00 g/L，MgSO4⋅7H2O 0.40 g/L，K2HPO4 0.05 g/L。利用此培养基发酵48 h，CC0955菌株发酵液对立枯丝核菌的抑制率达到89.78%，显著高于优化前的抑制率51.11%，并与模型预测值90.60%无显著性差异(P > 0.05)。
| Group | Peptone (g/L) | K2HPO4 (g/L) | Inhibition rate (%) |
| 1 | 15.00 | 0.04 | 91.13 |
| 2 | 18.00 | 0.05 | 88.98 |
| 3 | 18.00 | 0.10 | 89.25 |
| 4 | 19.24 | 0.08 | 90.32 |
| 5 | 12.00 | 0.05 | 89.78 |
| 6 | 15.00 | 0.08 | 88.98 |
| 7 | 10.76 | 0.08 | 88.44 |
| 8 | 15.00 | 0.08 | 86.83 |
| 9 | 15.00 | 0.11 | 87.63 |
| 10 | 15.00 | 0.08 | 90.05 |
| 11 | 15.00 | 0.08 | 89.25 |
| 12 | 15.00 | 0.08 | 89.52 |
| 13 | 12.00 | 0.10 | 84.68 |
| Item | Sum of squares |
df | Mean square |
F value |
P value Prob > F |
| Model | 24.33 | 3 | 8.11 | 7.88 | 0.006 9 |
| Peptone | 5.17 | 1 | 5.17 | 5.02 | 0.051 8 |
| K2HPO4 | 11.96 | 1 | 11.96 | 11.62 | 0.007 8 |
| Peptone-K2HPO4 | 7.21 | 1 | 7.21 | 7.01 | 0.026 6 |
| Residual | 9.26 | 9 | 1.03 | ||
| Lack of fit | 3.14 | 5 | 0.63 | 0.41 | 0.822 2 |
| Pure error | 6.12 | 4 | 1.53 | ||
| Cor total | 33.59 | 12 |
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| 图 2 蛋白胨和K2HPO4影响菌株CC0955发酵液抑菌率的响应面图 Figure 2 Response surface diagram of the effect of peptone and K2HPO4 on the inhibition rate of strain CC0955 fermentation broth. |
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根据载体吸附的菌液体积和细胞数，比较了不同载体的吸附能力。实验结果显示(表 5)，膨润土和白炭黑吸附能力最强，硅藻土次之，滑石粉和高岭土的吸附能力较差。
| Carriers | Adsorption capacity | Biocompatibility | |||
| Volume (L/kg) | Number of bacteria (109 cell/g) | Alive bacteria (CFU) | Biocompatibility (%) | ||
| Talc | 1.10±0.20c | 5.50 | 136 | 88.31 | |
| Diatomite | 2.50±0.05b | 12.50 | 122 | 79.22 | |
| Bentonite | 3.75±0.15a | 18.75 | 0 | 0.00 | |
| Silica | 3.70±0.15a | 18.50 | 145 | 94.16 | |
| Kaolin | 0.95±0.05c | 4.75 | 88 | 57.14 | |
| CK | 154 | ||||
| 注：不同小写字母表示方差分析结果的邓肯氏新复极差检验在0.05水平上达到显著差异。下同 Note: Different lowercase letters mean that Duncan’s new complex difference test of analysis of variance has significant difference at the level of 0.05. The same below. |
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生物相容性实验结果显示(表 5)，白炭黑的生物相容性最高，达到94.16%；滑石粉和硅藻土次之，分别为88.31%和79.22%；高岭土生物相容性较差，为57.14%；膨润土的生物相容性最差。
综合吸附能力和生物相容性指标，选取白炭黑为CC0955菌株发酵液泡腾颗粒制剂的吸附载体。
2.2.2 泡腾颗粒组成的优化及制备采用正交设计试验，优化了碱酸摩尔比(A)、白炭黑含量(B)和黄腐酸钾含量(C)三因素对泡腾颗粒崩解pH和活菌数的影响。以pH为指标条件下，因素A的极差最大(R=1.633)，表明碱酸摩尔比对pH的影响最大；但以活菌数为指标条件下，因素B的极差最大(R=2.877)，表明白炭黑对活菌数影响最大(表 6)。因素B和C在K3水平上取得平均活菌数最大值，即选择B3 (白炭黑)和C3 (黄腐酸钾)可实现最大活菌数。虽然因素A在K1水平下活菌数最多，但pH值最低，溶液过酸。综合考虑活菌数和pH，选择K2水平，即A2=2，最终获得各因素的最佳配比为A2B3C3，此配比下1 kg泡腾颗粒含：C6H7O7⋅H2O 307.02 g、NaHCO3 245.61 g、白炭黑438.60 g和黄腐酸钾8.77 g。根据此配比，采用非水制粒法，成功制备含贝莱斯芽孢杆CC0955菌株发酵液的泡腾颗粒。
| Group | A Molar ratio of alkali to acid | B Silica (g) | C Potassium fulvic acid (g) | pH | Number of alive bacteria (×108 CFU/g) |
| 1 | 1 | 0.5 | 0.01 | 5.04 | 1.00 |
| 2 | 1 | 1.0 | 0.02 | 4.98 | 3.50 |
| 3 | 1 | 1.5 | 0.03 | 4.94 | 7.25 |
| 4 | 2 | 0.5 | 0.02 | 5.66 | 1.88 |
| 5 | 2 | 1.0 | 0.03 | 5.72 | 1.75 |
| 6 | 2 | 1.5 | 0.01 | 5.74 | 2.88 |
| 7 | 3 | 0.5 | 0.03 | 6.88 | 0.75 |
| 8 | 3 | 1.0 | 0.01 | 6.53 | 2.25 |
| 9 | 3 | 1.5 | 0.02 | 6.45 | 2.13 |
| K1 | 4.987 (3.917) | 5.860 (1.210) | 5.770 (2.043) | ||
| K2 | 5.707 (2.170) | 5.743 (2.500) | 5.697 (2.503) | ||
| K3 | 6.620 (1.710) | 5.710 (4.087) | 5.847 (3.250) | ||
| R1 | 1.633 (2.207) | 0.150 (2.877) | 0.150 (1.207) | ||
| 注：括号外数据是以pH值为指标做的分析，括号内数据是以活菌数为指标做的分析 Note: The data outside the bracket is the analysis with pH value as the index, and the data inside the bracket is the analysis with the number of alive bacteria as the index. |
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泡腾颗粒外观为白色圆柱状颗粒(图 3)；泡腾颗粒的平均直径为0.70 cm，平均高度为0.77 cm，平均质量为0.21 g，平均密度为0.71 g/cm3；室温下1 g泡腾颗粒在99 mL水中平均崩解时间为61.00 s、溶液的pH值为5.44；泡腾颗粒所含活菌数为6.05×108 CFU/g。室温下保存6个月，细菌数仍维持在同一数量级，为3.55×108 CFU/g，存活率达58.68%。
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| 图 3 泡腾颗粒(A)和泡腾颗粒在水中的崩解(B) Figure 3 Effervescent granules (A) and disintegration of effervescent granules in water (B). |
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采用检测菌丝生长速率的方法，获得了泡腾颗粒对3种植物病原菌的毒力回归曲线(图 4)，并据此求出泡腾颗粒对立枯丝核菌、姜茎腐霉菌和番茄灰霉病菌的EC50分别为27.65、34.49和41.50 mg/mL。
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| 图 4 泡腾颗粒溶液对3种病原菌的毒力回归曲线 Figure 4 Toxicity regression curve of effervescent granule solution to three pathogens. |
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采用检测菌丝生长速率的方法，比较了CC0955菌株发酵液与含等量发酵液的泡腾颗粒对病原真菌生长的抑制率差异，结果显示(图 5)，泡腾颗粒对立枯丝核菌和番茄灰霉菌的抑制作用与发酵液无显著差异，但对姜茎基腐霉的抑制作用显著低于发酵液。
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| 图 5 泡腾颗粒与发酵液对植物病原菌的抑制率 Figure 5 Inhibition rate of effervescent granule and fermentation broth to phytopathogens. *: P < 0.05. |
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用30倍稀释的CC0955泡腾颗粒溶液、发酵液和粉剂溶液分别处理感染了立枯丝核菌的水稻幼苗根部以及感染了灰葡萄孢的番茄叶面，分别调查水稻和番茄各植株的发病严重程度。结果显示(表 7)，泡腾颗粒对由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病的防效与发酵液和粉剂的防效无显著差异，分别为42.35%、45.63%和39.08%，但发酵液的防效则显著高于粉剂；泡腾颗粒对由灰葡萄孢引起的番茄灰霉病的防效与发酵液和粉剂无显著差异，分别为57.62%、58.93%和69.13%。
| Treatment group | Rice | Tomato | |||
| Disease index | Control effect (%) | Disease index | Control effect (%) | ||
| Negative control | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Positive control | 27.52±1.76a | 0c | 13.97±4.53a | 0b | |
| Fermentation | 14.96±0.87b | 45.63±3.89a | 5.74±1.10b | 58.93±7.85a | |
| Powder | 16.76±1.03b | 39.08±4.60b | 4.31±1.54b | 69.13±11.00a | |
| Effervescent | 15.86±0.78b | 42.35±3.45ab | 5.92±2.45b | 57.62±17.55a | |
优化发酵培养基及培养条件，是提高生防菌防效的重要手段，常见的优化方式包括单因素试验、正交试验和响应面试验等[23]。例如，杨从军[24]采用单因素试验与正交试验设计相结合的方法，对Bacillus brevis W4菌株发酵培养基及培养条件进行了优化，优化后的发酵液对番茄灰霉病菌的抑制率较优化前提高了26.9%。刘京兰等[12]利用响应面优化的方法，使Bacillus velezensis CC09菌株发酵产iturin A的能力较优化前提高了4.2倍，高达501.0 mg/L。本研究采用响应面优化方法，对CC09的抗利福平突变株CC0955进行了发酵培养基组成的优化，优化后的发酵液对立枯丝核菌的抑制率为89.78%，较优化前提高了38.67%，显著提升了该菌作为生防菌的应用潜力。
目前市面上的微生物农药多为悬浮剂[25]，而且大多直接利用微生物代谢产物或单独的微生物菌体为原料制备产品[26]，存在防效较差或较难保存运输等问题。泡腾剂是一种相对新颖的剂型，在食品和中草药领域应用较多。郭慧玲等[27]利用正交设计法优化了三黄泡腾片的处方，获得的泡腾片崩解迅速、口感良好。在农业领域，杀虫剂、除草剂和杀菌剂均有泡腾剂型[8]，但以除草剂为主[28-29]，目前尚缺乏生防菌泡腾剂型。鉴于泡腾剂具有环保、简便、易保存运输和使用等特点，市场应用前景广阔。本文研究制备的泡腾颗粒，完全利用了CC0955菌株的菌体及其发酵液中的活性成分，具有快速崩解、抗菌活性高和保存期长的特点，室温下保存6个月活菌存活率高达58.68%，高于Wiwattanapatapee等[17]的结果，显示出一定的贮存优势。
CC0955菌株泡腾颗粒具有与发酵液相当的抗菌活性，但对姜茎基腐霉的抑制率显著低于发酵液(图 5)，这可能与姜茎基腐霉的生长对pH敏感有关[30]，泡腾颗粒偏酸，发酵液偏碱，碱性条件更不利于姜茎基腐霉的生长。然而，在实际应用中，无论泡腾颗粒还是发酵液都需要进行大量稀释，稀释后的pH接近中性，因此推测，在大田应用时，泡腾颗粒和发酵液对姜茎基腐霉所致病害的防治效果无显著差异。此外，泡腾颗粒对立枯丝核菌和番茄灰霉菌的抑制作用则与发酵液无显著差异，说明泡腾颗粒制备过程中基本保留了CC0955菌株发酵液的抗菌成分。
近年来，随着国家对生态农业的高度重视，生防菌产品及其应用越来越受到关注[31-32]。本研究以贝莱斯芽孢杆菌CC0955菌株发酵液为有效成分研制的泡腾颗粒制剂，30倍稀释液对由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病以及由灰葡萄孢引起的番茄灰霉病有较好的防治效果，防效与CC0955发酵液无显著差异。作为一种新的生防菌剂型，该泡腾颗粒制剂具有重要的应用和推广价值。
由于白炭黑载体的吸附能力有限，限制了泡腾颗粒对发酵液的承载量，进而影响其防病效果。因此，今后可通过筛选吸附能力更强的载体或通过冷冻干燥[16]等发酵液浓缩技术或添加麸皮和糖蜜等辅料[33]，提高泡腾颗粒对发酵液的吸附量，进一步提升泡腾颗粒的防病效果及贮存时间。此外，有必要开展大田试验，进一步验证CC0955菌株泡腾颗粒的防病效果及其优越性。
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