博落回是罂粟科博落回属的多年生草本植物，是一种富含生物碱的传统中药材，其主要活性成分均属异喹啉类生物碱，具有抗菌、杀虫、抗病毒、抗肿瘤、镇痛、消炎、改善肝功能及增强免疫力等多方面的药理作用^[1]。断奶仔猪使用博落回提取物(血根碱为主要有效成分)可以增加血清中溶菌酶的浓度，并且可以提高巨噬细胞吞噬指数^[2]。血根碱具有很强的抗菌活性，最初一直在牙膏和口腔冲洗液中使用，对口腔微生物具有很好的抗菌活性^[3-4]。血根碱对禽中临床分离的革兰氏阳性菌和阴性菌同样具有抗菌活性或显著的抑菌作用，与抗生素(例如链霉素、万古霉素、氨苄西林、苯唑西林、诺氟沙星、环丙沙星)联合使用对许多革兰氏阳性菌和阴性菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)表现出协同抗菌作用，并且还可以降低各个药物的有效剂量^[5-8]。血根碱可以诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株膜结合细胞壁自溶酶的释放，导致菌体的溶解，并且血根碱还可以改变细胞膜的形态结构^[8]。此外，血根碱还具有抗真菌活性^[9]。

肠外致病性大肠杆菌(extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC)是一种重要的病原菌，近年来对畜牧业(猪、禽、牛、羊)和人类健康的危害日益受到关注，多重耐药性和生物被膜的形成更增加了其防控的难度及对公共卫生的威胁。华中农业大学从我国不同地区猪场病猪的心、肺、肝、肾、脑、血液等组织器官分离鉴定了大量的大肠杆菌，300余株经血清分型和毒力因子检测鉴定为ExPEC，这些菌株可造成猪脑膜炎、败血症和肺炎等^[10]。对这些菌株进行药敏试验表明，它们均为多重耐药菌株，耐药谱广、耐药性强^[11]。ExPEC菌株目前广泛地从不同国家零售鸡肉、牛肉、猪肉、餐馆、即食食品(包括肉类、水果和蔬菜)中分离得到^[12-14]，因此，推测肉制品可能是人ExPEC感染的最主要来源。

本研究通过测定ExPEC PPECC042菌株对博落回主要活性成分血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱的最小抑菌浓度，研究亚抑菌浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱对ExPEC主要外膜蛋白和II型毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，T-A)系统基因及其调控基因表达的影响，初步探讨博落回生物碱对ExPEC的抑菌作用及对细菌生理活动的影响，以期为临床认识和理解博落回生物碱的药理作用及正确合理使用药物奠定基础。

ExPEC野生型分离株PPECC042 (WT)、tolC基因缺失株PPECC042:ΔtolC (ΔtolC)、hicAB基因缺失株PPECC042:ΔhicAB (ΔhicAB)、yafON基因缺失株PPECC042:ΔyafON (ΔyafON)和prlF-yhaV基因缺失株PPECC042:ΔprlF-yhaV (prlF-ΔyhaV)均由本研究室保存。

环丙沙星、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素，Sigma公司；血根碱、白屈菜红碱和原阿片碱由湖南农业大学曾建国惠赠；RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit，Qiagen公司；DNase I和溶菌酶，Fermentas公司；反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit，Thermo Fisher公司；荧光定量试剂盒SYBR Select Master Mix，Roche公司；引物(表 1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司。

参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) (M100-S19)推荐的肉汤微量稀释法^[16]，以LB培养基测定WT、ΔhicAB、ΔyafON、ΔprlF-yhaV和ΔtolC菌株对不同药物的MIC。所测MIC的药物分别为环丙沙星、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、血根碱、白屈菜红碱和原阿片碱。每次试验3个重复，重复3次，比较不同菌株对不同药物的MIC。

将WT、ΔtolC菌株分别接种含1/2 MIC亚抑菌浓度的白屈菜红碱、原阿片碱和血根碱的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，向培养物中以1:5的体积比迅速加入预冷的酚: 乙醇(1:9)溶液，冰浴10 min后4 ℃、10 000 r/min离心5 min收集细菌菌体，按照溶菌酶使用说明书将菌体用溶菌酶处理后，按照RNeasy Mini Kit说明书提取总RNA，并以DNase I对RNA进行处理去除基因组DNA。将提取的总RNA按照PrimeScript RT Reagent Kit说明书反转录为cDNA后−40 ℃保存备用。

参照SYBR Select Master Mix说明书采用SYBR green法，以rrsG基因作为内参基因，对外膜蛋白基因ompC、ompX、ompF、tolC及调控基因acrR、rob、marR、rpoS、soxS、bcr和II型T-A系统基因yafON、hicAB、prlF-yhaV进行表达量分析，实验所用引物见表 1。PCR反应体系：2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，ddH₂O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环；然后从72 ℃升至95 ℃，每20 s升温1 ℃，进行熔解曲线分析。结果分析采用2^−ΔΔCt相对定量法，即ΔC_t=C_t (目的基因)−C_t (内参基因)，ΔΔC_t= ΔC_t (处理组)−ΔC_t (参照组)，参照组目的基因相对表达倍数即为2^−ΔΔCt。

采用非配对Student’s t test的统计学分析方法进行统计学显著性差异分析，其中两组之间的P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

采用微量肉汤稀释法对WT、ΔhicAB、ΔyafON、ΔprlF-yhaV和ΔtolC菌株测定不同药物的MIC，结果如表 2所示，ΔtolC菌株对环丙沙星、氯霉素的敏感性与WT菌株相比显著增加，与文献[17]报道的一致。ΔhicAB和ΔprlF-yhaV菌株对氯霉素敏感性略有升高，分别为4倍和2倍。此外，ΔtolC菌株对原阿片碱、血根碱、白屈菜红碱的敏感性分别提高2、16和16倍，并且ΔhicAB菌株对血根碱的敏感性增加了2倍(表 2)。结果表明，TolC不仅在ExPEC的抗生素抗性方面发挥着重要作用，还可以对原阿片碱、血根碱、白屈菜红碱等生物碱的抗性发挥着重要作用；此外，细菌的不同T-A系统或许可能在抗生素和生物碱的敏感性方面也发挥着作用。

外膜蛋白是ExPEC含有的独特的脂质双分子层结构外膜，其在增强细菌黏附侵袭能力、物质运输及相关功能物质的合成等方面发挥着重要作用^[17-18]，外膜蛋白还可以改变细胞外膜的通透性而诱导细菌耐药性的形成^[18]，因此，本研究在亚抑菌浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下，比较了WT和ΔtolC菌株的主要外膜蛋白基因的表达水平。结果表明：当在1/2 MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在时对WT和ΔtolC菌株ompX、ompF、tolC基因的表达水平具有较大影响，对ompC基因的表达水平影响较小；其中，当存在1/2 MIC白屈菜红碱时，WT和ΔtolC菌株的ompX和tolC基因的表达水平显著升高(P < 0.01)；当存在1/2 MIC血根碱时，WT菌株的tolC基因的表达水平显著下降(P < 0.01) (图 1A)。在ΔtolC菌株中，1/2 MIC血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱可以不同程度地促进ompX和ompC基因的表达，相反地，它们对ompF基因的表达却存在着不同程度的抑制(P < 0.01或P < 0.05) (图 1A)。结果表明，不同的生物碱对不同的外膜蛋白表达有不同的影响，或许是由于不同生物碱对不同细胞外膜蛋白的通透性不同或适配性不同造成的。

通过对参与外膜蛋白调控的部分调控子基因表达水平分析，结果显示当存在1/2 MIC血根碱时，WT和ΔtolC菌株的marR和rpoS基因的表达水平显著升高(P < 0.01)，并且marR基因在1/2 MIC白屈菜红碱时的表达水平也显著升高(P < 0.01) (图 1B)。结果表明，不同的生物碱对于ExPEC参与应激反应具有不同的分子机制，而且TolC外膜蛋白的缺失与否对细菌参与应激反应同样具有影响作用。

图 1　亚抑菌浓度生物碱对WT和ΔtolC菌株外膜蛋白基因(A)及调控基因表达的影响(B) Figure 1　The effects of sub-inhibitory concentrations of alkaloids to outer membrane protein genes (A) and their regulatory genes (B) expression of ExPEC WT and ΔtolC strain. 数据以平均值±标准误表示。以双尾非配对t检验进行差异性显著分析，*：P < 0.05；**：P < 0.01。下同 Values are shown in means ± standard error of the mean. Statistically significant fold changes were determined using two-tailed unpaired Student's t tests. *: P < 0.05; **: P < 0.01. The same below.

图选项

T-A系统在维持细菌生理功能方面发挥着重要作用，本研究在亚抑菌浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下比较了WT和ΔtolC菌株的yafON、hicAB和prlF-yhaV这3个T-A系统基因的表达水平。结果显示，在1/2 MIC的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下，可以不同程度地影响WT菌株和ΔtolC菌株的yafO和yafN基因的表达水平，当白屈菜红碱存在时WT菌株的yafO和yafN基因水平表达显著上升(P < 0.01)，当原阿片碱存在时显著降低了WT菌株的yafN基因表达(P < 0.01)；在ΔtolC菌株中，当存在原阿片碱时yafN基因的表达水平显著增加(P < 0.01) (图 2A)。在1/2 MIC的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下，可以不同程度地降低WT菌株的hicA和hicB基因表达，而促进ΔtolC菌株中hicA和hicB基因的表达，其中原阿片碱对ΔtolC菌株hicA和hicB基因表达的促进作用最强(P < 0.01) (图 2B)，结果表明外膜蛋白TolC的完整性对于T-A系统hicAB参与细菌应激具有一定的影响。在1/2 MIC的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下，可以不同程度地促进WT和ΔtolC菌株的prlF基因表达，并且WT菌株在1/2 MIC的白屈菜红碱存在下prlF和yhaV基因表达水平与不存在生物碱相比表达量分别增加了6倍和5倍，而在ΔtolC菌株中其表达量也呈现显著增加；在血根碱存在的情况下，WT菌株的prlF基因表达量略有增加外，yhaV基因的表达量显著降低，是不添加生物碱的0.22倍(图 2C)。因此，结果表明II型T-A系统参与了ExPEC不同生物碱的应激反应，并且外膜完整性对不同T-A系统参与生物碱的应激反应具有不同的作用。

图 2　亚抑菌浓度生物碱对WT和ΔtolC菌株II型T-A系统基因表达的影响 Figure 2　The effects of sub-inhibitory concentrations of alkaloids to type II T-A genes expression of ExPEC WT and ΔtolC strain.

图选项

外膜蛋白的完整性对细菌是非常重要的，也是非常必需的，这些外膜蛋白涉及细菌广泛的生理过程，如脂质代谢、细胞黏附、膜结构稳定性及应激适应等^[19-20]，其中外膜蛋白TolC缺失后导致外膜结构完整性破坏，造成细菌对外界应激反应性改变^[17]，外膜蛋白还可以改变细胞外膜的通透性而诱导细菌耐药性的形成^[18]。当亚抑菌浓度的血根碱、白屈菜红碱和原阿片碱存在时，对WT和ΔtolC菌株的ompC、ompX、ompF、tolC基因的表达具有较大的影响，表明外膜蛋白不同程度地参与了ExPEC对生物碱的应激反应过程。此外，本研究发现T-A系统hicAB缺失还可造成ExPEC对血根碱和氯霉素的敏感性增高。已有研究表明血根碱可以诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株膜结合细胞壁自溶酶的释放，导致细菌的溶解，并且血根碱还可以改变细胞膜的形态结构^[8]，并且细菌在外界环境刺激下，一些外膜蛋白通过调整自身表达(如OmpC和OmpF等)维持细胞渗透压平衡，控制小分子物质或分泌蛋白的扩散，其与细菌耐药性相关^[21-22]。当革兰氏阴性菌接触抗生素后，细菌可以通过改变外膜蛋白的组成或其表达量(如OmpF和OmpC)降低外膜通透性，使细菌产生获得性耐药性^[23]。过量表达OmpX可降低OmpC和OmpF的表达量，从而降低细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感程度^[24]。因此，hicAB的缺失导致对血根碱和氯霉素敏感性的增高或许与外膜蛋白表达水平的改变相关，并且外膜蛋白参与了ExPEC对亚抑菌浓度生物碱的应激反应，通过不同外膜蛋白表达水平的改变以适应生物碱的应激反应。由于不同生物碱对不同外膜蛋白表达的影响不同，当外排泵蛋白TolC缺失时，血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱可以不同程度地促进ompX和ompC基因的表达，其可能机制是尽可能维持细菌胞内环境平衡，或者由于TolC外排泵蛋白的缺失而增加ompX和ompC基因表达水平，促进细菌对生物碱分子向外排出的通透性。RpoS在细菌应对高渗透压、高温、低pH、氧化、饥饿和抗生素压力等应激环境下的生理活动中发挥着决定性的作用^[25]，并且MarR家族也是细菌在发挥抗生素抗性中最重要的调控子^[26]，而本研究结果显示，血根碱对WT和ΔtolC菌株的marR和rpoS基因的表达水平具有显著的升高作用，白屈菜红碱可以显著促进marR基因的表达水平，并且在ΔtolC菌株中血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱可以不同程度地促进rpoS基因的表达水平，因此，对marR和rpoS基因表达的影响表明外膜完整性与否对不同亚抑菌浓度生物碱的应答或应激反应机制存在不同，其表达的改变是对生物碱应激的适应性反应。

细菌和古细菌中普遍存在着T-A系统，主要维持细菌生理功能的发挥，II型T-A系统是目前研究较多的一类，其中毒素和抗毒素都是蛋白质，包括MazE-MazF、RelE-RelB、YefM- YoeB、MqsR-MqsA和ShpA-ShpB等，毒素通常抑制细菌生长，而抗毒素则中和毒素。本研究在亚抑菌浓度的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下比较了WT和ΔtolC菌株的yafON、hicAB和prlF-yhaV这3个II型毒素-抗毒素基因的表达水平，结果发现在1/2 MIC的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在下，可以不同程度地促进WT和ΔtolC菌株的prlF基因表达，并且在WT菌株存在血根碱的情况下，prlF基因表达量略有增加外，yhaV基因的表达量显著降低，这或许是由于细菌为了应对亚抑菌浓度生物碱的应激反应而促使细菌生长出现抑制，从而避免对细菌造成损伤。然而，在白屈菜红碱存在时WT菌株的yafO和yafN基因水平表达显著上升，当原阿片碱存在时显著降低了WT菌株的yafN基因表达；而在ΔtolC菌株中，当存在原阿片碱时yafN基因的表达水平明显增加；在1/2 MIC的血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱存在时可以不同程度地降低WT菌株的hicA和hicB基因表达，但促进ΔtolC菌株中hicA和hicB基因的表达。已有报道在大肠杆菌K-12菌株中，HicA (58个aa)的表达引起ompA等外膜蛋白基因mRNA在特定位点的断裂，同时造成细菌蛋白翻译速度急剧下降，从而引起细菌生长停滞，而hicB的表达可以中和HicA的毒素作用发挥抗毒素功能，使细菌复苏生长^[27]。类鼻疽杆菌HicA毒素超表达可以引起细菌生长停滞，并且增加对环丙沙星和头孢他啶耐受性的持留细菌数量，缺失hicAB基因的类鼻疽杆菌显著降低对环丙沙星耐受的持留细菌的发生率^[28]。因此本研究结果提示，不同生物碱对不同T-A系统表达的影响不同，并且细菌外膜完整性在T-A系统应对生物碱的反应过程中具有重要的作用，当细菌外膜完整时，生物碱促使毒素基因表达抑制细菌生长；而当外膜完整性破坏(例如TolC缺失)时，生物碱可促使细菌抗毒素基因表达水平升高。此外，hicAB和prlF-yhaV缺失对氯霉素、血根碱敏感性增加的原因可能与抗毒素hicB基因的表达量增加相关，从而导致细菌对氯霉素、血根碱的耐受性降低，并且降低了对氯霉素和血根碱耐受的持留细菌数量。

本研究结果表明，T-A系统和外膜蛋白参与了ExPEC对生物碱的应激反应过程，ExPEC在参与不同博落回生物碱的应激过程中，对主要外膜蛋白和II型T-A系统表达的影响也不同；并且TolC外膜完整性在ExPEC参与对生物碱的应激中具有重要的作用，对T-A系统的表达具有重要的影响作用。为了进一步明确生物碱对T-A系统和外膜蛋白的影响，通过蛋白质水平和全基因转录组两个层次对其进行深入了解和研究，对于认识其药理作用具有十分重要的理论意义。