2022, Vol. 49扩展功能
文章信息
- 徐肖文, 项志杰, 王琛, 郭爱珍, 陈颖钰
- XU Xiaowen, XIANG Zhijie, WANG Chen, GUO Aizhen, CHEN Yingyu
- 牛呼吸疾病综合征主要病毒的检测、分离与鉴定
- Detection, isolation, and identification of the main viruses causing bovine respiratory disease complex
- 微生物学通报, 2022, 49(12): 4978-4986
- Microbiology China, 2022, 49(12): 4978-4986
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.220867
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文章历史
- 收稿日期: 2022-09-08
- 接受日期: 2022-09-26
- 网络首发日期: 2022-10-28
2. 华中农业大学动物科技学院动物医学院, 湖北 武汉 430070;
3. 华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心, 湖北 武汉 430070;
4. 华中农业大学湖北省兽医流行病学国际科技合作基地, 湖北 武汉 430070;
5. 华中农业大学湖北洪山实验室, 湖北 武汉 430070
2. College of Veterinary Medicine, College of Animal Sciences and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
3. The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
4. Hubei International Science and Technology Cooperation Base of Veterinary Epidemiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China;
5. Hubei Hongshan Laboratory, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China
随着肉牛产业的不断发展，牛呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)已成为肉牛产业兴起的重要阻碍因素，同时也是养牛业的常发病[1]。BRDC是由环境应激和病原(细菌、支原体及病毒等)共同作用所致。其病毒性病原主要包括牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3)等[2]，这些病毒感染健康牛后常引起咳嗽、流鼻涕、食欲减退与呼吸困难等临床症状，严重影响生产性能。为了解我国BRDC的流行现状及优势病毒，本研究收集了来自湖北、湖南、安徽、河南、广东、广西和贵州等不同地区的病牛组织样本，利用反转录聚合酶链反应(reverse transcription- polymerase chain reaction，RT-PCR)技术对IBRV、BVDV、BRSV和BPIV-3四种病毒进行检测，并对阳性样品进行病毒的分离与鉴定，以期为疫苗研发和BRDC的防控提供重要依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样本来源自2021年9月到2022年7月收集来自湖北、湖南、安徽、河南、广东、广西和贵州等地区21个牛场的179头具有呼吸道症状牛的196份样品，包括167份鼻拭子、13份肺脏组织、1份鼻黏液、5份气管拭子、1份唾液和9份血清。
1.1.2 细胞牛胚肾(madin-darby bovine kidney，MDBK)细胞购自中国兽医药品监察所。
1.1.3 主要试剂和仪器DMEM高糖(2×)培养液，吉林吉诺生物工程有限责任公司；低熔点琼脂糖粉，武汉普兰德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix、DNA/RNA Extraction Kit、HiScript® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；1.1×S4 Fidelity PCR Mix，北京金沙生物科技有限公司。琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司；全自动核酸提取仪，南京诺唯赞医疗科技有限公司；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司。
1.2 方法 1.2.1 RT-PCR检测病毒提取病料的DNA/RNA，DNA病毒用PCR扩增检测IBRV，RNA病毒逆转录为cDNA后进行PCR扩增，检测BVDV、BPIV-3、BRSV。本研究所用引物如表 1所示，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反应体系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，退火(BVDV、IBRV、BPIV-3退火温度分别为59.5、60.5、57.6 ℃，BRSV一轮和二轮退火温度分别为53、56 ℃) 15 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出阳性条带的样本送公司测序，鉴定正确的样本进行病毒分离。
| Viruses | Target genes | Sequence (5′→3′) | Product size (bp) | References |
| BPIV-3 | N | F1: GAGAAAGACCCAGGAAGACAGA | 704 | [3] |
| R1: ACACCCATCGCATAACTCCAGA | ||||
| F2: CATCCATAGTTCCTTATGCATG | 153 | Designed by our laboratory | ||
| R2: TTGGGTCGCTCTGTTTCC | ||||
| F3: ACAGTATGTAACAGGACGGTCC | 126 | |||
| R3: GCCTCTTGTGTAATCCCCAA | ||||
| IBRV | TK | F: CCGACCGCCTCCTACACCAGATGCT | 868 | Designed by our laboratory |
| R: GGGTGTAGGCAAGCTCACCGCAACG | ||||
| BRSV | N | F1: CAAACTAAATGACACTTTCAACAAG | 566 | [4] |
| R1: CATTTCATTCCTTAGTACATTGTTG | ||||
| F2: CGTAGTACAGGTGACAACATTG | 422 | |||
| R2: ACCAAAGCAGCAACACATAGCAC | ||||
| BVDV | 5ʹUTR | F: TCAGCGAAGGCCGAAAAGAGG | 310 | [5] |
| R: TCCATGTGCCATGTACAGCAGAG |
阳性样品(病牛的肺组织样品充分匀浆后，8 000 r/min离心3 min取上清液)反复冻融后经0.22 μm滤器过滤，取适量滤液接种于长满单层的MDBK细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱中感染2 h，弃去滤液，用PBS清洗后加入含有2%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM维持液，每日观察细胞病变。接毒3−5 d或细胞出现80%以上病变后收毒，反复冻融3次，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上清并经0.22 μm滤器过滤后置−80 ℃备用。
1.2.3 PCR鉴定参照表 1引物序列，对盲传的每一代病毒液进行PCR鉴定。PCR反应体系：1.1×S4 Fidelity PCR Mix 21 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL。PCR反应条件：98 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，退火(BVDV、IBRV、BPIV-3退火温度分别为59.5、60.5、57.6 ℃，BRSV一轮和二轮退火温度分别为53、56 ℃) 15 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收阳性条带产物进行测序。
1.2.4 噬斑纯化对1.2.3鉴定正确的病毒进行噬斑纯化，将病毒液进行10倍比稀释。选择10−3、10−4、10−5、10−6、10−7这5个稀释度接种长满单层MDBK细胞的6孔板，剩余1个孔为阴性对照，在37 ℃、含5% CO2培养箱中感染作用2 h，弃去滤液，加入2 mL提前准备好的含有2%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗和DMEM培养液(2×)的低熔点琼脂糖，待彻底凝固后置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养，每日观察病变，挑取单个噬斑进行扩大培养。
1.2.5 TCID50测定将MDBK细胞消化后以每孔200 μL接种于96孔板，待细胞长满单层后弃去细胞培养液，使用不含血清和双抗的DMEM培养液将病毒原液进行10倍比系列稀释，最高稀释到10−8，每个梯度做8个重复，每孔加入100 μL病毒液，在5% CO2、37 ℃培养箱中吸附2 h后补加100 μL维持液，放于培养箱中培养，于3−5 d后按照Reed-Muench法(TCID50≥50%病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例，距离比指 > 50%的百分数−50%与 > 50%的百分数−低于50%的百分数之比)统计结果。
1.2.6 BPIV-3生长特性测定将已知病毒滴度的病毒以0.1 MOI (multiplicity of infection，原液感染复数)接种长满单层的MDBK细胞，分别于接毒后3、6、9、12、18、24、30、33、42、48、60、72 h收毒，反复冻融3次，测定各时间点的病毒滴度，绘制生长曲线。
2 结果与分析 2.1 BRSV、IBRV、BPIV-3、BVDV的阳性检出率利用RT-PCR对196份临床病料进行检测，结果显示，7.14% (95% CI：3.96，11.69) (14/196，14份鼻拭子样本)的临床样品检测到BRSV，6.63% (95% CI：3.58，11.07) (13/196，13份鼻拭子样本)的临床样品检测到BVDV，0.51% (95% CI：0.01，2.81) (1/196，1份鼻拭子样本)检测到IBRV，4.08% (95% CI：1.78，7.88) (8/196，6份鼻拭子样本及2份肺组织样本)检测到BPIV-3 (图 1−4)。
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| 图 1 部分病料BPIV-3 RT-PCR扩增结果 Figure 1 BPIV-3 RT-PCR amplification results of some disease materials. M：DL2000 DNA Marker；1−5：不同病料BPIV-3病毒检测结果；6：阴性对照；7：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1−5: BPIV-3 virus test results of different disease materials; 6: Negative control; 7: Positive control. |
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| 图 2 病料IBRV RT-PCR扩增结果 Figure 2 IBRV RT-PCR amplification result of the disease material. M：DL2000 DNA Marker；1：病料IBRV病毒检测结果；2：阴性对照；3：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1: IBRV virus test result of the disease material; 2: Negative control; 3: Positive control. |
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| 图 3 部分病料BRSV RT-PCR扩增结果 Figure 3 BRSV RT-PCR amplification results of some disease materials. M：DL2000 DNA Marker；1−5：不同病料BRSV病毒检测结果；6：阴性对照；7：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1−5: BRSV virus test results of different disease materials; 6: Negative control; 7: Positive control. |
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| 图 4 部分病料BVDV RT-PCR扩增结果 Figure 4 BVDV RT-PCR amplification results of some disease materials. M：DL2000 DNA Marker；1−3：不同病料BVDV病毒检测结果；4：阴性对照；5：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1−3: BVDV virus test results of different disease materials; 4: Negative control; 5: Positive control. |
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在179头牛中，BRSV、IBRV、BPIV-3、BVDV这4种病毒的阳性检出率分别为7.82% (95% CI：4.34，12.77) (14/179)、0.56% (95% CI：0.01，3.07) (1/179)、4.47% (95% CI：1.95，8.62) (8/179)、7.26% (95% CI：3.92，12.10) (13/179)；其中BVDV与BRSV在病牛中共感染的比例为0.56% (95% CI：0.01，3.07) (1/179)。
2.2 病毒的分离与鉴定对上述阳性样品进行病毒分离，接种细胞3−5代并经PCR鉴定后成功获得1株BVDV (non-cytopathic)与6株BPIV-3 (图 5和图 6)。光学显微镜下显示BPIV-3早期细胞变圆肿大，局部细胞脱落(图 7A)；中期细胞逐渐融合脱落成圆形，部分细胞裂解为碎片(图 7B)；后期细胞大面积融合形成拉网状(图 7C)，最终细胞完全脱落。图 7D为正常MDBK细胞。
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| 图 5 BPIV-3 PCR扩增结果 Figure 5 BPIV-3 PCR amplification results. M：DL2000 DNA Marker；1−6：不同样本BPIV-3病毒检测结果；7：阴性对照；8：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1−6: BPIV-3 virus test results of different disease samples; 7: Negative control; 8: Positive control. |
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| 图 6 BVDV PCR扩增结果 Figure 6 BVDV PCR amplification results. M：DL2000 DNA Marker；1：样本BVDV病毒检测结果；2：阴性对照；3：阳性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1: BVDV virus test result of sample; 2: Negative control; 3: Positive control. |
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| 图 7 BPIV-3细胞病变 Figure 7 Cytopathy of BPIV-3. A：接毒后24 h (40×)；B：接毒后48 h (40×)；C：接毒后72 h (40×)；D：阴性对照(40×) A: 24 h after receiving the poison (40×); B: 48 h after receiving the poison (40×); C: 72 h after receiving the poison (40×); D: Negative control (40×). |
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使用分型引物(BPIV-3A上游引物：5'-CAT CCATAGTTCCTTATGCATG-3'，下游引物：5'-T TGGGTCGCTCTGTTTCC-3'；BPIV-3C上游引物：5'-ACAGTATGTAACAGGACGGTCC-3'，下游引物：5'-GCCTCTTGTGTAATCCCCAA-3')进一步对所获得BPIV-3的病毒进行分型鉴定，发现6株BPIV-3病毒均能扩增出BPIV-3C目的条带，而且与预期大小一致(图 8)，同时将其PCR产物送去测序，并将测序结果在NCBI上比对，结果也显示6株BPIV-3病毒为C型，而BVDV的PCR产物测序结果比对后结果显示为1d型。
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| 图 8 BPIV-3C PCR扩增结果 Figure 8 BPIV-3C PCR amplification results. M：DL2000 DNA Marker；1−6：不同样本BPIV-3C病毒检测结果；7：阳性对照；8：阴性对照 M: DL2000 DNA Marker; 1−6: BPIV-3C virus test results of different disease samples; 7: Positive control; 8: Negative control. |
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对6株BPIV-3C分别进行至少3次噬斑纯化，每次纯化挑取多个噬斑(图 9)，并进行扩大培养，待80%以上病变后收毒，利用RT-PCR进行外源病毒检测鉴定，确定为纯净的BPIV-3C病毒。
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| 图 9 BPIV-3C单个噬斑(100×) Figure 9 Single plaque of BPIV-3C (100×). |
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接毒后3−5 d，按Reed-Muench计算法，得出6株BPIV-3C病毒滴度分别为107.55、108.1、107.43、107.2、107.47、107.8 TCID50/mL。
2.5 病毒生长曲线为了解病毒的生长特性，选取毒价较高的毒株，以0.1 MOI接毒测定生长曲线，结果表明，病毒在接毒后24 h时增殖达到峰值，病毒滴度达到108.52 TCID50/mL，24−30 h病毒复制进入短暂平台期，随后病毒滴度呈下降趋势(图 10)。
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| 图 10 BPIV-3C生长曲线 Figure 10 Growth curve of BPIV-3C. |
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BRDC对肉牛业与奶牛业健康发展的威胁日趋严重，由于BRDC的感染情况较为复杂，了解我国BRDC的流行现状及流行毒株对该病的防控具有重要意义。近年来，越来越多的研究人员对其主要病毒性病原进行了调查，但多是基于抗原甚至抗体的检测，难以反映疾病的真实情况。例如，肉牛BPIV-3的血清学阳性率为77.6%−91.08%[6-7]；IBRV抗体阳性率为50.23%−52.77%，群体阳性率在70%以上[8]。BVDV抗原总阳性率为0.49%，抗体总阳性率为75.94%−80.97%[9-10]。部分奶牛群中IBRV、BVDV、BPIV-3、BRSV的个体阳性率则分别高达76.2%、60.5%、63.2%、45.4%，群体阳性率更是分别高达82.2%、75.0%、85.7%、89.3%[11]。本研究利用RT-PCR技术对该4种病原进行了病原学检测，结果也显示了IBRV、BVDV、BPIV-3、BRSV这4种病毒在我国肉牛群中确实存在不同程度的流行。而且在患有呼吸道疾病综合征的病牛中，BRSV和BVDV占有优势的地位，阳性检出率分别为7.82%和7.26%。表明我国肉牛呼吸道疾病综合征的防控中，应将BRSV和BVDV作为防控的要点。
此外，本研究还发现了BVDV与BRSV共感染的病例，这与许多学者的相关研究报道[11-13]一致，这4种病毒在临床上存在混合感染的情况，主要是因为某种病原感染健康牛后会导致饲养牛的抵抗力下降，甚至还会造成免疫抑制，从而易发生继发感染与混合感染。
为了有针对性地开发牛呼吸道疾病综合征病毒的高效疫苗，本研究对临床样本进行了病毒的分离，并鉴定了具体的亚型。发现在所调查的场群中，BVDV为1d型，BPIV-3为C型。目前国内流行的BVDV主要为1型[14]，BPIV-3主要为A型与C型，鲜有B型报道[15]，这也与本研究的结果一致。
综上所述，本研究揭示了华中、华南、西南等地区部分养殖场BRDC主要病毒性病原的流行情况，为BRDC的防控提供了参考依据，而且分离获得的毒株是当下国内较为流行的病毒亚型，能够作为相关疫苗研究的储备，具有良好的临床应用价值。
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