丝状真菌是酶制剂、有机酸、抗生素等微生物发酵产品的重要表达体系^[1]。在液体深层发酵体系中，丝状真菌的菌体形态存在分散的菌丝、菌丝团和菌丝球3种形式^[2]。丝状真菌的形态变化是影响产物合成的核心因素，如土曲霉(Aspergillus terreus)的菌丝球越小越利于洛伐他汀的积累^[3]，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)呈分散的菌丝形态比菌丝球能产更高的青霉素^[4]，菌丝球较分散的菌丝形态更有利于富含花生四烯酸油脂的大规模生产^[5]。与此同时，丝状真菌形态也与发酵液黏稠、流变性质、营养分布等密切相关，如分散的菌丝使得介质黏度增加、发酵罐中营养分布极不均匀并会缠绕在叶轮上，造成堵塞并扩散到取样线和溢流线^[6]; 菌丝球最大可以达到几毫米，而发酵液中的溶解氧及其他营养成分只能渗透入菌丝球表面约200 μm^[7]，这使得菌丝球内部菌体活性急剧下降，甚至失去活性^[8]。这些问题的存在影响了丝状真菌的生长发育、物质代谢、废水处理等过程。因此，丝状真菌形态的形成过程、形成机理及控制因素等的深入研究对促进丝状真菌的工业化应用、提高目标物产量和提升废水处理能力等具有重要意义。

黑曲霉具有强大的代谢能力，已经广泛用于多种酶制剂和有机酸的生产，如蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、纤维素酶和柠檬酸等^[9-10]。研究表明，黑曲霉的形态与代谢物产量有着密切的联系，如：菌丝球的形成有利于柠檬酸的积累^[8]; 分散菌丝状更利于呋喃果糖苷酶和葡萄糖化酶的表达^[11]。除工业发酵应用外，黑曲霉也被应用于废水处理，如：黑曲霉AS3.3284对染料浓度为100 mg/mL的6种水溶性染料的废水脱色率均超过88%^[12]; 黑曲霉B77对铜、锰、锌、镍、铁等重金属具有强大的吸附能力^[13]等。然而黑曲霉对染料、重金属等的吸附能力与菌体形态的关系鲜有报道。

从普洱茶分离的黑曲霉RAF106除能合成蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、柠檬酸外，还能降解黄曲霉毒素，将茶多酚生物转化成生物可利用度更高的具有抗氧化能力的小分子物质^[14-15]，但该菌的菌丝球形成过程、影响因素及对染料的吸附能力等都未见报道。因此，本文以黑曲霉RAF106为研究对象，通过对不同生长时间的黑曲霉菌体形态进行显微观察，明确黑曲霉RAF106菌丝球的形成过程及方式; 并通过改变培养条件，探究初始pH、温度、孢子接种量、摇床转速对菌体形态变化的影响; 同时比较不同菌体形态对结晶紫的吸附能力。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和培养条件

黑曲霉ATCC 6257、黑曲霉RAF106 (CGMCC No. 9608)在马铃薯葡萄糖固体培养基(potato dextrose agar，PDA)上30 ℃培养5 d，在平板中加入吐温-80，收集孢子，用自制带棉花滤头过滤制得孢子悬液。将孢子悬液接种于100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth，PDB; 自然状态下pH 5.5)中，孢子终浓度5×10⁵个/mL，30 ℃、180 r/min摇床培养2 d，观察菌体形态形成过程及动态变化。

1.1.2 主要试剂和仪器

吐温-80，天津大茂化学试剂厂; 结晶紫、氢氧化钠，福晨(天津)化学试剂有限公司; 盐酸、蔗糖、硝酸钠，广州化学试剂厂; 乳糖，北京普博欣生物科技有限公司; D-果糖，北京索莱宝科技有限公司; 氯化铵，汕头市光华化学厂; 无水醋酸钠，天津市永大化学试剂有限公司; 酵母提取粉，广东环凯微生物科技有限公司; 胰蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司; 琼脂，Biofroxx公司。

恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司; 生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司; 生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司; 酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司; 离子酸度计，德国赛多利斯公司; 超低温高速离心机，Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉RAF106孢子及分散菌丝形成菌丝球的过程

将黑曲霉孢子悬液接种于PDB中摇床30 ℃、180 r/min培养2 d，每隔2 h取样进行显微摄影，观察菌丝球形成过程; 同时，将5 g自由分散的菌丝接种于PDB，30 ℃、180 r/min摇床培养24 h，每隔2 h取样进行显微摄影，观察菌丝球形成过程。

1.2.2 培养条件对黑曲霉RAF106菌丝球大小的影响

采用单因素变量法研究培养液初始pH、培养温度、摇床转速、孢子接种量、碳氮源对黑曲霉菌丝球大小的影响。初始pH分别设为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0;培养温度分别设为25、30、35、40、45 ℃; 摇床转速分别设为140、160、180、200、220 r/min; 孢子接种量分别为5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶个/mL; 分别用果糖、蔗糖、乳糖、醋酸钠代替PDB中葡萄糖探究碳源对菌丝球的影响; 通过在PDB中额外添加酵母提取粉、胰蛋白胨、氯化铵、硝酸钠探究氮源对菌丝球的影响。培养24 h，取20个菌丝球排成一列，测量20个菌丝球的直径并取样进行显微摄影。同时，将培养所得的菌丝球烘干后称重。

1.2.3 黑曲霉菌丝球对结晶紫的吸附及吸附动力学模拟

将黑曲霉孢子悬液接种于PDB中30 ℃、180 r/min培养24 h，于4 000 r/min离心5 min后去除培养液，并收集菌丝球。用无菌水将菌丝球清洗3次，以相同条件离心去除多余水分，称取5 g菌丝球放置于含有0.7 mg/mL结晶紫溶液中，每隔2 h摇匀吸取结晶紫溶液，采用酶标仪测量吸光度(OD₅₉₀)。

1.2.4 黑曲霉形态对结晶紫吸附效果的影响

将5 g分散菌丝及不同大小的菌丝球分别加入0.7 mg/mL结晶紫溶液中，吸附12 h后于4 000 r/min离心5 min，取上层溶液，采用酶标仪测量吸光度(OD₅₉₀)。

1.2.5 数据分析

实验重复3次，数据以平均值±方差显示，并使用DPS软件进行单因素方差分析，比较判断组间差异。P < 0.05代表样本间存在显著性差异。

2 结果与讨论 2.1 黑曲霉RAF106孢子及分散菌丝成球的过程

根据成球过程的不同，丝状真菌的菌丝球形成机制分为凝聚型和非凝聚型2种类型，黑曲霉为典型的凝聚型丝状真菌，即：多个孢子首先聚集、膨胀，再生长出菌丝，由菌丝聚集缠绕形成菌丝球^[16]。以黑曲霉ATCC 6257为例，孢子前4 h不断聚集，6 h孢子萌发、长出芽管，8 h明显可见菌丝缠绕、菌丝球初步成型; 随后，菌丝不断生长缠绕，菌丝球体积不断增大(图 1A)。将分散的黑曲霉RAF106孢子悬液接种于PDB的培养过程中发现，生长初期孢子不断聚集，6 h孢子开始萌发、长出芽管，8 h形成清晰可见的菌丝，10 h明显可见菌丝缠绕，12 h菌丝球初步成型，随后菌丝不断生长缠绕，菌丝球体积不断增大(图 1B)，这与黑曲霉ATCC 6257的成球方式基本一致。说明黑曲霉RAF106菌丝球形成过程符合“接种孢子—孢子聚团—菌丝球形成”的孢子成球模型^[17]。

除孢子成球理论外，在海洋黑曲霉R3和黑曲霉ZJUBE-1中发现菌丝成球的现象^[18-19]。为阐明黑曲霉RAF106是否也存在这一现象，将分散的菌丝直接接入PDB中培养，实时观察菌丝球形成过程。研究发现，分散菌丝不断聚集缠绕，6 h菌丝球初步成型，至24 h菌丝伸长，菌丝球体积增大，中心密度增大(图 2)。这些结果说明，在黑曲霉RAF106中，孢子接种和菌丝接种均可形成菌丝球，菌丝球的形成并不完全依赖于孢子的凝聚。

2.2 培养条件对黑曲霉RAF106菌丝球大小的影响

研究表明真菌菌丝球形态受到初始培养液pH、培养温度、摇床转速、孢子接种量等培养条件的影响^[20]。本文探究了培养液初始pH、培养温度、孢子接种量、摇床转速以及不同碳氮源对黑曲霉RAF106菌丝球形成大小的影响。

2.2.1 培养液初始pH对黑曲霉菌丝球大小的影响

黑曲霉RAF106具有较好的耐酸性和耐碱性，在pH 4.0−10.0都可以生长且形成菌丝球(图 3A)。经比较，不同初始pH条件下黑曲霉的生长量没有显著差异，但菌丝球直径随pH值增大而减小(图 3B、3C)。与初始pH 4.0时直径5.80 cm相比，初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0时菌丝球直径分别减少了3.10%、12.24%、17.41%、22.59%、26.90%、33.97%，说明菌丝球大小与培养液初始pH值成反比; 这一现象与培养液初始pH值对冬虫夏草(Crodyceps sinensis Cs-Hk1)、橘青霉(Penicillium citrinum)成球影响结果一致^[21-22]，但与初始pH对黑曲霉MYA 135菌丝球大小影响相反，而且不同于海洋微紫青霉(Penicillium janthinellum)菌丝球直径随初始pH值增大呈先增大后减小再增大的趋势，青霉(Penicillium sp. L1)菌丝球直径则呈先增大后减小的趋势^[23-25]。

为了进一步探究pH对菌丝球大小的影响，将于初始pH 4.0的PDB中形成的菌丝球转移至pH 10.0的PDB中，初始pH 10.0的PDB中形成的菌丝球转移至pH 4.0的PDB中培养12 h，观察菌丝球大小变化(图 4)。结果表明，与继续在原pH条件下培养12 h的菌丝球大小相比，成球后改变pH并不能显著改变菌丝球大小。结合前人报道，我们推测初始pH抑制大菌丝球形成的可能原因在于pH影响孢子表面电荷，从而影响真菌菌体形态，即：随着pH值增大，孢子细胞壁表面负电荷增加，静电斥力增大，影响孢子聚集，从而抑制菌丝球形成^[26-27]。

2.2.2 培养温度对黑曲霉RAF106菌丝球大小的影响

黑曲霉RAF106在温度胁迫下表现出良好的耐性，在培养温度为25−40 ℃均能较好地生长，其生长量无显著性差异(图 5A、5B); 菌丝球直径随温度升高呈先增后减的趋势(图 5A、5C)。35 ℃时菌丝球直径最大(7.30 cm)，与之相比，25、30、37、40 ℃时的菌丝球直径分别下降了57.67%、22.88%、17.81%、25.62% (图 5C)，说明黑曲霉菌丝球大小在小于35 ℃时与温度成正比，大于35 ℃时则成反比。当温度升高到在45 ℃，显微镜下仅能看到少量的孢子聚集及萌发(图 6)，说明高温可能影响孢子聚集及减缓孢子萌发，导致黑曲霉菌丝球形成受到抑制。黑曲霉RAF106菌丝球大小随温度变化的趋势与产香真菌GS-1、青霉X5、土曲霉M11基本一致^[28-30]。

2.2.3 摇床转速对黑曲霉菌丝球大小的影响

不同摇床转速未显著性改变黑曲霉菌丝球大小及生物量(图 7)。在摇床转速为140−220 r/min条件下培养24 h所得的黑曲霉，20个菌丝球直径在4.39−5.29 cm之间，而平均生物量在0.24−0.36 g之间。这与转速对液体培养的元蘑(Hohenbuehelia serotina)及茶树菇(Agrocybe aegirita)菌丝球形态的影响相同^[31-32]，但不同于黑曲霉R3菌丝球直径与转速呈正比及黑曲霉HFM5A-1菌丝球直径随转速增大呈先增大后减小的趋势^{[18, 33]}。转速升高不仅提高了培养基中的溶氧量，同时也促进了真菌养分的吸收，从而促进菌丝球的形成; 同时，高转速也意味着产生较大的剪切力，从而促使菌丝断裂，不利于菌丝球的形成，这导致摇床转速对不同丝状真菌菌丝球的形成具有不同的影响效果^[33-35]。

2.2.4 接种量对黑曲霉RAF106菌丝球大小的影响

接种量显著影响黑曲霉菌丝球大小及生物量(图 8A、8B)。经比较，黑曲霉生物量随接种量的升高而升高，而菌丝球大小随接种量升高而下降(图 8B、8C)。与接种量为5×10⁴个/mL时菌丝球生物量(0.067 g)相比，当接种量为1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶个/mL时，生物量分别增加了1.24、2.19、2.56和3.51倍(图 8B)，这与孢子接种量对赭曲霉ATCC 3150 (Aspergillus ochraceus ATCC 3150)、黑曲霉557生物量的影响相同^[36-37]。与接种量为5×10⁴个/mL时菌丝球直径9.49 cm相比，当接种量为1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶个/mL时，所形成的菌丝球直径分别下降了15.70%、48.16%、51.74%和71.23%，这表明黑曲霉菌丝球大小与接种量成反比，这与孢子接种量对黑曲霉AB1.13、嗜热土曲霉M11菌丝球直径的影响相同^{[17, 37]} (图 8C)。孢子接种量的增大，使得黑曲霉间对营养成分和生长空间的竞争加剧，从而限制了菌丝球增大^[35]。

2.2.5 不同碳源对黑曲霉菌丝球大小的影响

不同碳氮源能够影响黑曲霉的生长及菌丝球的大小(图 9A)。与葡萄糖组相比，蔗糖、果糖组生物量分别增加了4.14%、9.10%，而醋酸钠、乳糖组分别降低了65.00%、26.65% (图 9B)，这与葡萄糖、蔗糖、乳糖对桔青霉和竹荪(Dictyophora indusiata)生物量的影响相同^[38-39]; 蔗糖、醋酸钠、果糖和乳糖组菌丝球直径分别减小了14.67%、27.63%、27.87%和27.14% (图 9C)，这与葡萄糖、蔗糖对黑曲霉Y3菌丝球直径的影响相同^[40]。这些结果表明以葡萄糖为碳源最有利于菌丝球的形成，而以醋酸钠、乳糖为碳源不利于菌丝球形成，这可能因为黑曲霉对乳糖及醋酸钠利用率不高使得菌体生长过程中碳源匮乏所造成^[24]。

与不添加额外氮源组相比，外源添加的氯化铵、胰蛋白胨、硝酸钠和酵母提取粉组生物量分别增加84.44%、43.07%、27.37%和50.71% (图 9B)，这与氯化铵提高黑曲霉Y3生物量，蛋白胨、酵母提取粉促使土曲霉M11生物量增加的结果一致^{[30, 40]}，可能由于黑曲霉可以直接摄取无机氮供生长使用，也可以通过胞外酶将蛋白质等复杂氮源分解为小分子以满足生长所需，但对不同有机氮、无机氮的分解吸收效率不同^[41]。然而，外源添加氯化铵、胰蛋白胨、硝酸钠和酵母提取粉所得菌丝球直径分别减小了46.45%、36.67%、73.10%和57.95% (图 9C)，这与蛋白胨降低黑曲霉Y3直径，蛋白胨、氯化铵的添加使黑曲霉557粒径减少的结果相同^{[37, 40]}。

2.3 黑曲霉对结晶紫的吸附应用

2.3.1 黑曲霉形态对结晶紫吸附能力的影响

将黑曲霉菌丝球加入结晶紫溶液后发现，吸附初期，结晶紫浓度迅速下降，2 h后菌丝球对结晶紫吸附速率下降，6 h吸附趋于平衡(图 10)。说明黑曲霉RAF106除用于降解黄曲霉毒素B1、生物转化茶多酚外^[14-15]，还可用于废水处理。为了探究黑曲霉菌体形态对结晶紫吸附能力的影响，测定了不同直径的菌丝球及分散菌丝对结晶紫的吸附效果。结果表明菌丝球对结晶紫的吸附率随直径升高而降低。与直径为1.55 mm的菌丝球(其结晶紫吸附率为94.44%)相比，直径为2.16、3.63、3.75、4.71 mm的菌丝球对结晶紫的吸附率分别下降1.69%、1.92%、2.38%、2.54% (图 11);而分散菌丝对结晶紫的吸附率为94.89% (图 11)，这表明黑曲霉菌丝球对结晶紫的吸附率与直径成反比，分散菌丝形态更有利于吸附结晶紫。这与不同粒径的微紫青霉菌丝球粉末对刚果红的吸附、海洋黑曲霉游离菌丝对染料的吸附结果相同^{[24, 42]}。因为在湿重相同条件下，不同形态的黑曲霉比表面积越大，提供给染料的吸附位点相应增加，因此吸附量也增加^[24]。

2.3.2 黑曲霉菌丝球对结晶紫吸附动力学模拟

为进一步了解菌丝球吸附结晶紫的吸附机制，分别用准一级动力学模型(图 12A)、准二级动力学模型(图 12B)对所得数据进行模拟。结果表明用准二级动力学模拟拟合得到线性相关系数较高(R² > 0.99)，由此可知黑曲霉RAF106吸附结晶紫过程遵循准二级动力学模型。这与海洋黑曲霉ZJUBE-1菌丝球对刚果红的吸附、普鲁兰多糖菌丝球对亚甲基蓝和甲基橙的吸附、短刺小克银汉霉(Cuuninghamella echinulata)菌丝球对孔雀绿的吸附结果一致^[43-45]，表明染料吸附速率主要由化学吸附过程控制，与吸附剂和染料的化学性质有关。

3 结论

黑曲霉RAF106以孢子成球及菌丝聚集成球2种方式形成菌丝球，形成菌丝球的大小与培养液初始pH和孢子接种量成反比，与摇床转速无关; 当温度低于35 ℃时与温度成正比，温度高于35 ℃时则与温度成反比; 以葡萄糖为碳源更有利于菌丝球的形成，而外源添加氮源不利于形成菌丝球。菌丝球生物量与初始pH、摇床转速及温度无关而与接种量成正比，而且受不同碳氮源的影响。

除用于黄曲霉毒素B1降解、茶多酚生物转化^[14-15]外，黑曲霉RAF106还可以吸附结晶紫，其吸附能力与菌体形态密切相关。分散菌丝状较菌丝球更利于结晶紫吸附，而且菌丝球大小与结晶紫吸附能力成反比。通过动力学模拟发现，黑曲霉RAF106菌丝球对结晶紫的吸附更符合准二级动力学，说明黑曲霉RAF106对结晶紫的吸附属于化学吸附过程。本文研究结果将有利于优化发酵体系，控制黑曲霉菌体形态，提升黑曲霉的应用效能。