随着经济的迅速发展和人口的不断增长，污水量逐渐增多，污水成分也变得更加复杂。由于污水中存在着大量的污染物和致病微生物^[1]，对公众健康会造成严重威胁，因此亟需有效的方法处理这些污水。利用具有代谢功能的微生物菌群吸收、分解、转化和去除污水中化学需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)、氮、磷等污染物的生物处理，是目前污水处理厂中最常用的方法之一，微生物是该污水生物处理方法中的核心。噬菌体作为一种侵袭细菌的病毒，广泛存在于污水生物处理系统中，是污水生物处理微生物菌群的重要组成部分^[2]。

在污水生物处理中，噬菌体具有以下功能：(1) 调节微生物群落结构，影响污水处理^[3]；(2) 作为环境监测指示生物^[4]；(3) 控制污水中的病原菌^[5]、污泥膨胀与发泡^[6-7]；(4) 减轻膜生物反应器的膜污染^[8]；(5) 减量污泥等功能。噬菌体因其特异性、自复制、指数增殖和对人类无害等优点，可以实现精确和可持续的微生物菌群控制^[9]。由于能够特异性地消灭致病菌和抗生素抗性细菌，驱动和控制微生物群落结构，噬菌体在调节污水生物处理过程中的微生物平衡方面起着重要作用和功能^[10]。

研究表明，微生物(包括细菌)群落结构会影响污水生物处理的效果、污泥产量和污泥特性等^[11-12]，噬菌体作为细菌的捕食者，与微生物群落有紧密的联系。因此，全面认识污水生物处理中的噬菌体及其功能具有重要意义。然而，研究通常聚焦于噬菌体的单一方面，例如噬菌体在不同工艺中的分布或其在微生物群落中的作用^[13-15]，较为分散且不够全面，难以形成对噬菌体及其功能的系统化认知。本文对相关文献进行了梳理总结归纳，详细阐述了噬菌体在污水生物处理中的分布，介绍了噬菌体的分离、培养和鉴定方法，重点讨论了噬菌体在污水生物处理中潜在的功能和应用及其影响因素，最后对噬菌体技术的应用进行了展望，以期加深人们对于噬菌体在污水生物处理中功能的认识，为噬菌体的应用提供指导，推动污水生物处理的发展。

1 污水生物处理中噬菌体的分布

污水生物处理工艺可分为好氧处理法和厌氧处理法，研究表明，在这些工艺中都发现了噬菌体的存在^[16-18]，常用的好氧处理法包括活性污泥法和生物膜法。

活性污泥法是一种通过微生物的代谢作用去除污水中有机污染物和氮磷等营养元素的污水处理方法^[19]，目前广泛用于生活污水和工业废水的处理。噬菌体是活性污泥的重要组成部分，在活性污泥法处理过程中噬菌体会通过感染和裂解活性污泥中一些细菌(宿主)实现其增殖，同时存在着消亡过程。研究发现，噬菌体在活性污泥中的丰度约为10⁸−10¹⁰个/mL^[20]，其主要种类包括肌尾科噬菌体、短尾科噬菌体、长尾科噬菌体和丝状科噬菌体等。在我们研究组正在进行的研究中，发现在3套解耦联污泥减量的实验室装置(采用序批式活性污泥法)中均存在着噬菌体，而且不同污泥减量工艺中的噬菌体在种类和丰度上存在差异^[21]。Ewert等^[17]发现活性污泥反应器中混合液和出水的噬菌体丰度显著高于进水的噬菌体丰度，说明噬菌体在污水生物处理中发生了增殖。Zhang等^[18]发现活性污泥反应器中连续2个月噬菌体群落的平均差异为16.0%，而且不同噬菌体的相对丰度发生了显著变化。膜生物反应器(Membrane Bio-Reactor，MBR)是采用膜分离技术替代二沉池进行固液分离的一种改进活性污泥工艺，噬菌体因其纳米级大小，在应用膜分离技术处理污水的过程中会被截留在滤膜上，因此往往能在滤膜上发现丰富的噬菌体^[22]。

生物膜法是微生物、原生动物和后生动物等附着在滤料或载体上形成生物膜净化污水的一种方法。Sanderson等^[16]从曝气生物滤池(一种常用的生物膜法污水处理工艺)中分离出多种以不同肠球菌为宿主的原噬菌体，并通过鉴定功能性CRISPR/Cas序列发现噬菌体和细菌之间存在着持续的相互作用。

厌氧污水生物处理过程中也检测到了噬菌体的存在，因为没有原生动物等因素的干扰，在厌氧环境下可以更好地研究噬菌体和细菌之间的关系。Zhang等^[18]连续12个月监测厌氧消化池中微生物群落的组成变化，在消化污泥里发现了78种噬菌体和183个噬菌体基因，同时噬菌体会影响着厌氧消化器中细菌的菌群结构及厌氧消化器的工艺性能。

2 污水生物处理中噬菌体的分离、培养与鉴定

污水生物处理过程中的噬菌体种类繁多，需要对噬菌体进行分离、培养和鉴定，以识别其种属，研究其具体性状及功能。然而，在噬菌体的染色和观察过程中常常存在着细菌等杂质的干扰，因此选择合适的分离、培养与鉴定方法十分重要。在污水生物处理中，微生物常常以污泥絮凝体或生物膜的形式存在，而且被胞外聚合物(Extracellular Polysaccharide Substances，EPS)包裹，需要通过超声、振荡等方法破坏污泥絮凝或生物膜，才能进一步对其进行培养纯化。分离、培养方法有双层平板法^{[14, 23]}、沉淀离心法^[24]和水解超声/涡旋振荡法^[25]等(表 1)，从污泥或生物膜中分离提取纯种的噬菌体，并利用其对应的宿主进行扩大培养。目前常用噬菌斑计数、透射电镜、荧光显微镜和流式细胞仪等方法^[26-27]表征污泥或生物膜中噬菌体的丰度；其中显微镜和流式细胞仪可用于观察噬菌体的大小和结构，以初步分辨和鉴定噬菌体的种类。祁诗月^[14]利用双层平板法从城市污水厂曝气池的活性污泥中分离培养出了多种噬菌体，并利用透射电镜法进行了观察和鉴定。随着分子生物学技术的快速发展，宏基因组测序与数据分析已成为研究复杂环境中微生物群落的重要手段。若引物选用合适，该技术则可特异性检测噬菌体^[28]，对进一步构建噬菌体数据信息库和研究污水处理系统噬菌体的功能有重要意义。

3 噬菌体在污水生物处理中的功能 3.1 调控微生物菌群结构，影响污水处理效果

噬菌体作为污水生物处理微生物菌群中的重要组成，可以通过侵染细菌宿主来调控污水生物处理过程中的微生物菌群结构，从而影响污水处理效果。Abeles等^[29]研究发现噬菌体是细菌多样性的重要驱动因素，其与细菌保持动态平衡，对细菌群落的结构和动态变化产生重要影响，从而保证污水生物处理的稳定效果。Brown等^[3]连续2年监测全规模污水处理厂的噬菌体丰度、细菌菌落组成和污水水质，发现混合液中噬菌体丰度与其中COD和氨氮浓度有显著的相关性，直接影响相应的出水浓度。研究表明，噬菌体影响着污水生物处理中碳和氮的去除，在活性污泥系统中可能是控制细菌丰度、群落结构和功能稳定性的关键因素之一^{[3, 29]}。另外，噬菌体会通过侵染优势细菌使之裂解从而显著降低其相对丰度，直接影响该细菌数量，使微生物菌群结构发生变化，间接地影响系统中不同菌种之间的竞争^[3]。当外界因素变化导致污水生物处理效果降低时，可以在微生物菌群结构与污水处理效果关系研究的基础上，通过噬菌体去侵染特定微生物，从而恢复其菌群结构^[30]，提高污水处理效果。

3.2 作为环境监测指示生物

在污水生物处理过程中，需要监测城市污水处理厂进水和出水中的人类病毒和病原体，以便进行风险评估。噬菌体可以用作水中病毒和病原菌的指示生物或示踪剂(表 2)，反映水中微生物的污染状况，是目前广泛应用的微生物指标^[31-32]。环境监测中常用的噬菌体包括水中病毒指示物SC噬菌体、肠道病毒指示物F-RNA噬菌体和反映人类粪便污染程度的脆弱拟杆菌噬菌体等^[33]。由于噬菌体与人类肠道病毒的组成、结构、大小和复制位点十分相似，因此其能够对病毒污染和粪便污染提供更多的信息。Hartard等^[34]发现FRNAPH噬菌体可以用来鉴定污水中的粪便来源。利用噬菌体检测人类肠道病毒具有简单和经济的优势，能够很好地反映病毒的自然失活和评价污水处理效果^[35-36]，并预测人类肠道病毒的持久性和环境行为。

3.3 控制污水中的病原菌

在污水生物处理工艺中，部分噬菌体会以污水中的病原菌为宿主细菌，通过吸附特异性侵入细菌，在细菌体内增殖，最终裂解细菌释放子代噬菌体，达到控制这些病原菌的功能(表 2)。这些病原菌，诸如肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌和分枝杆菌^[37]等，会引起人类和动物肠道寄生虫感染、腹泻和肺部疾病，严重时甚至会导致死亡。Fan等^[38]从活性污泥中分离得到一种双链DNA噬菌体AJO1，发现其可以有效致死致病菌约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)，而且AJO1生长速度快，同时具有良好的热稳定性和pH稳定性，可用作无毒性的杀菌剂。Zhang等^[39]利用绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的噬菌体选择性地去除了宿主病原菌，并发现噬菌体处理对生物滤池内的亚硝酸盐氧化菌(Nitrite-Oxidizing Bacteria，NOB)和氨氧化菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)没有影响，对系统中的有益生物影响最小，改善了出水水质。另外，随着越来越多的抗生素进入生活污水中，细菌变异形成超级耐药细菌和多重耐药细菌^[40]，如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等，噬菌体是一种针对上述菌株的有效处理方法。Yu等^[41]向活性污泥中加入多价噬菌体及其生产宿主，成功地抑制了抗生素耐药性大肠杆菌。相比目前常用的杀菌剂和抗生素，噬菌体对生态更加友好，而且能利用宿主细菌呈指数增殖^[42]，保持较高的滴度，快速、持续侵染细菌，最终消灭出水中病原菌并随之消亡，保障出水安全性。

3.4 控制污泥膨胀

污泥膨胀是污水处理过程中常见的问题，膨胀的污泥容易随着出水流失，从而降低系统的污水处理效果。高晨晨等^[43]发现污水处理厂中膨胀污泥的微生物群落结构发生显著改变，对污水中总氮和氨氮的去除率平均降低5%，总磷去除率降低约3%。丝状细菌过度繁殖是污泥膨胀的主要原因之一^[7]，而噬菌体能够特异性侵蚀这些丝状细菌，控制其丰度，从而从根本上控制污泥膨胀的发生(表 2)。Han等^[44]研究表明污泥膨胀过程中的微生物群落会发生变化，而噬菌体与微生物菌群结构有一定的关系。Yang等^[45]对比污泥膨胀时期和非膨胀时期的细菌和噬菌体群落关系发现：软发菌(Haliscomenobacter hydrossis)是污泥膨胀时期主要的细菌之一，而且肌尾科噬菌体与软发菌(H. hydrossis)丰度有明显的协同增长关系，大约增加了1.3−3.1倍，表明噬菌体与丝状细菌存在着密切的动态关系。Kotay等^[46]将噬菌体与宿主软发菌(H. hydrossis)按1:1 000的体积比混合培养，丝状细菌死亡率为54%，污泥体积指数(Sludge Volume Index，SVI)从155 mL/g降至105 mL/g，说明该噬菌体对污泥膨胀起到了良好的控制作用，而且该噬菌体不会侵染负责去除COD、氨氧化和厌氧硫酸盐还原的细菌菌种，在SBR工艺中污水处理效率恢复到污泥膨胀之前。Choi等^[47]从污水中分离出一株宿主为浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)的强毒肌尾科噬菌体，将其加入活性污泥中侵染12 h，发现SVI由168±2 mL/g降至102±2 mL/g，污泥从膨胀变为不膨胀，沉降性能改善，上清液浊度显著降低，而且噬菌体的加入对去除COD和营养物质几乎没有影响，即对污水处理效率没有影响。

3.5 控制污泥发泡

污泥发泡是在生物反应池和二沉池表面产生大量泡沫的现象，这些泡沫会隔绝空气，影响污水复氧，从而使出水水质恶化，影响污水处理效果。泡沫会富集细菌病原体，携带抗生素抗性基因，随着出水或形成气溶胶逸散到环境中，造成危害^[48]。气泡、表面活性物质和疏水性物质的共同作用被认为是引起污泥发泡的重要原因^[49]，这个过程中，疏水性物质是必不可少的。作为一种疏水性物质，疏水性细菌在污水生物处理中却常常发挥着积极的作用，因此需要在污水处理过程中保持一定的丰度。噬菌体能够侵蚀特定的疏水性细菌，如球衣菌属(Sphaerotilus spp.)、戈登氏菌属(Gordonia spp.)、斯科曼氏菌属(Skermania spp.)、分期杆菌属(Mycobacterium spp.)和诺卡氏菌属(Nocardia spp.)等，控制其丰度在形成稳定泡沫所需的阈值以下^{[6, 50]}，从而在源头上抑制污泥发泡的产生(表 2)，保持稳定的污水处理效果。Dyson等^[51]从活性污泥中分离出的一株长尾科噬菌体，发现其可以强制裂解引起污泥发泡的强疏水性细菌松状斯科曼氏菌(Skermania piniformis)，从而抑制污泥发泡。Khairnar等^[52]发现噬菌体NOC1、NOC2和NOC3可以使疏水性细菌诺卡氏菌(Nocardia)的丰度在短时间内迅速下降，24 h后宿主细菌的数量减少87.5%，泡沫显著减少，成功控制了污泥发泡，而且所分离的噬菌体与活性污泥系统中最常见的细菌没有交叉感染性，不会影响污水处理效果。Petrovski等^[53]从活性污泥中分离出的长尾噬菌体GTE2和GTE7能够靶向控制疏水性细菌戈登氏菌(Gordonia)和诺卡氏菌(Nocardia)，其中长尾噬菌体GTE7对宿主细菌有更强的抑制作用。Liu等^[54]从活性污泥中分离出可以导致污泥发泡的丝状细菌戈登氏菌(Gordonia)及其4种对应的噬菌体，经过9 d混合处理培养，发现宿主细菌的丰度相较对照组下降了90%，污泥泡沫显著减少。

3.6 控制膜污染

微生物是造成膜污染的重要原因，微生物及其胞外聚合物(EPS)附着在膜组件上会加重膜生物反应器的膜污染^[55]，影响出水效率，缩短膜的使用寿命。噬菌体可以特异性地侵染细菌，从而减少目标宿主细菌的丰度，调控细菌的群落结构，并分泌多糖解聚酶(Polysaccharide Depolymerase Enzymes，PDE)降解EPS，抑制和破坏细菌在膜组件表面形成的生物膜(表 2)，使生物膜可以通过物理方法剥离^[56-57]，恢复膜通量，从而提高污水处理效率。噬菌体尺寸一般大于膜生物反应器的孔径，能够被拦截在膜内进行持续的生物控制，并可以使用多价噬菌体联合处理含有多种细菌的生物膜，保障膜生物反应器的处理效率。Goldman等^[58]将烈性噬菌体添加到超滤反应器，特异性感染绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，发现滤膜表面生物膜层的形成明显减少，同时膜的通透性提高了40%−60%。Bhattacharjee等^[57]从污水处理厂的混合液中分离出多重耐药细菌戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis ARB-1)的特异烈性噬菌体DTP1，并将10¹² PFU/mL的该噬菌体加入已经发生膜污染的膜生物反应器中，发现膜通量从15 L/hm²恢复至47 L/hm²。

3.7 减量污泥

污水生物处理中的活性污泥利用污水中的有机物合成新的细胞物质进行繁殖，随着系统的运行，污泥不断增加，一定的污泥增长对污水生物处理是有益的，但是活性污泥中好氧微生物的同化效率很高，导致容易产生过量的剩余污泥。De Leeuw等^[59]发现在污水处理中噬菌体和细菌之间存在着密切的相关性，噬菌体扮演着细菌捕食者的角色。由于污泥减量的前提是不影响或不显著影响污水处理效果，而噬菌体能够特异性侵染引起污泥增量大却又不影响有机物去除和脱氮除磷效果的问题细菌，使其消亡^[60]。因此通过加入噬菌体等手段可以控制污泥中特定细菌的增殖，在保证污水处理效果的前提下，实现污泥减量(表 2)。Han等^[61]研究表明，污水生物处理过程中的污泥减量与污泥的微生物菌群结构有直接关系，而我们研究组近期在实验室不同解耦联污泥减量工艺的污泥中发现，微生物(包括噬菌体)的种类和丰度存在着明显差异，这也说明噬菌体可能与污泥减量有关系^[21]，但噬菌体在污泥减量中的作用仍需要进一步研究。

4 影响污水生物处理中噬菌体的因素 4.1 温度

温度显著影响着污水处理过程中微生物的代谢和群落结构(表 2，表 3)，决定着噬菌体的存活、侵染和储存，在低于最佳温度时，噬菌体遗传物质进入细菌宿主较少；在较高的温度时，噬菌体的潜伏期会延长^[62]。Puck等^[63]研究了不同温度下T1 (一种细菌)噬菌体对T1的吸附，发现在37 ℃时吸附最快，温度过高或过低都会影响吸附速率。Kotay等^[46]发现丝状细菌H. hydrossis的特异性噬菌体，在–20−35 ℃内的感染效率几乎没有变化，但是暴露在高于42 ℃后噬菌体发生变性、失活。在污水生物处理中，考虑到微生物群体的生物活性，通常应将温度控制在15−35 ℃内^[64]。

4.2 酸碱度

酸碱度(Potential of Hydrogen，pH)会影响噬菌体的活性及其与宿主之间的吸附，从而影响其感染效率(表 2)。当pH值低于噬菌体的等电点，范德华引力和疏水相互作用会克服噬菌体粒子之间的静电斥力，导致噬菌体聚集，降低感染效率^[65]，而在强酸或强碱的条件下，噬菌体会失去活性(表 3)。Fan等^[38]发现在pH 6.0−9.0时，AJO1噬菌体的感染效率在70%以上，pH 7.0时感染效率最高。曾祥朋^[66]发现污水处理厂样品中分离的噬菌体YZ1在pH 4.0−8.0内具有活性，pH 7.0时活性最好。Jiang等^[67]发现沙门氏菌噬菌体KM15在pH 6.0−7.0时形成最多的噬菌斑，在pH 10.0−11.0缓冲液中的活性高于pH 3.0−4.0，表明该噬菌体在碱性条件下具有更好的耐受性。尽管大多数噬菌体的适宜pH在中性，但是仍需要在应用前通过试验确定最佳pH以达成最好的侵染效果。

4.3 感染复数

感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)即投加噬菌体与宿主菌数量的初始比值，会影响噬菌体的效价。研究表明，由于不同噬菌体的形态和结构存在差别，其MOI存在差异，在污水生物处理中其最佳MOI值范围为0.001−15 (表 2，表 3)。因此，在应用噬菌体之前，通常需要进行预实验确定最佳的MOI值(表 3)，以实现有效的微生物控制。

4.4 带电粒子

在中性条件下，噬菌体粒子带有负电荷，会与污水中存在的某些正价阳离子发生反应形成沉淀，影响噬菌体的稳定性及其对细菌的侵染效果(表 2)。静电作用在噬菌体的吸附过程中有着重要作用，不同带电粒子对噬菌体的影响不同。Puck等^[63]向营养肉汤中加入适当浓度的Cl⁻发现，T1噬菌体对大肠杆菌的吸附速率有了显著提高，但过量Cl⁻对噬菌体的吸附作用会产生抑制。Al³⁺和Fe³⁺较低剂量时就会使噬菌体产生快速且不可逆的失活，例如，Matsui等^[68]发现4种铝盐溶液(硫酸铝、氯化铝、液铝和聚合氯化铝溶液)都会使Qβ、MS2、T1、P1噬菌体发生不同程度的失活。

5 噬菌体在污水生物处理中应用的局限和解决方法 5.1 宿主范围窄

大多数情况下噬菌体具有高度的特异性，这种特异性会导致噬菌体的宿主范围窄，限制其大规模的生产和富集(表 2)。为了克服噬菌体的这种不足，研究者尝试在污水生物处理中应用具有多宿主的多价噬菌体^[69]。Yu等^[41]利用多价噬菌体和替代宿主抑制抗生素抗性细菌NDM-1，发现对比窄宿主范围噬菌体的处理，多价噬菌体可达到更高的丰度，NDM-1减少了更多。

5.2 宿主难确定

污水生物处理过程中的微生物种类繁多，不同的污水处理厂有着不同的微生物群落结构，因此噬菌体的宿主通常难确定(表 2)。通常，可以利用16S rRNA基因和高通量测序等分子生物学手段对系统的微生物群落进行分析，并通过分析噬菌体与细菌群落的结构和功能关系，确定宿主细菌^[65]。

5.3 噬菌体抗性

宿主在驯化之后可能会产生一定的抗性(表 2)，从而使噬菌体失效，阻止噬菌体吸附和进入，破坏噬菌体基因组和终止噬菌体生命周期^[70]。通常可以通过将针对同一宿主菌的多种噬菌体混合在一起，靶向多种抗性载体，从而避开细菌的不同抗性机制，防止噬菌体抗性宿主的产生，这种方法被称为噬菌体“鸡尾酒疗法”^[71]。为了适应和保持针对不断出现的新菌种的活性，噬菌体的种类需要持续更新^[72]。另外，研究发现宿主细菌在产生噬菌体抗性之后，会一定程度上降低环境适应性，在种间竞争中处于劣势，并失去对某些抗生素和化学药剂的抗性。因此，可以采用噬菌体和特定抗生素或化学药剂联合处理的方法，抑制细菌产生噬菌体和抗生素抗性，提高细菌的杀灭。

6 结论和展望

噬菌体作为污泥的重要组成部分，广泛存在于各种污水处理工艺中，在污水生物处理过程中发挥重要作用，其在污水生物处理过程中可以起到指示生物、消灭病原菌、控制污泥膨胀和污泥发泡、控制膜污染和减量污泥等功能。但要利用噬菌体进行大规模应用，仍然存在一些问题，我们难以精准识别噬菌体及其宿主，尚未明确宿主细菌对噬菌体的抗性机制及其相互作用，而且也不确定应用噬菌体是否会对污水生物处理产生其他不利的影响。

因此，在未来污水生物处理中噬菌体的研究应从以下方面进行：

(1) 开发准确高效分析鉴定噬菌体的方法，形成标准化鉴定噬菌体的方法。

(2) 应用噬菌体仍存在宿主范围窄、宿主难确定和宿主产生噬菌体抗性等问题，需要针对这些问题进行深入的研究。

(3) 在实际污水生物处理应用上需要尽早地为细菌目标建立噬菌体库。

(4) 切实了解噬菌体与细菌的动态变化和相互作用，及其与污水生物处理效率的关系，以充分发挥噬菌体的功效，保证污水生物处理的污染物去除效果，使其更好地服务于污水生物处理过程，促进污水生物处理健康发展。