近些年来，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的耐药问题逐渐突出，多重耐药菌株及高毒力菌株不断出现，寻找合适的解决方法是目前抗感染治疗的重点及趋势。噬菌体是能特异性感染细菌等微生物的病毒，可用于治疗细菌感染，特别是在治疗耐药细菌的感染方面极具潜力。早在20世纪初期，噬菌体制剂就被应用于临床治疗。目前，噬菌体制剂在包括格鲁吉亚、波兰和俄罗斯在内的许多国家的商业化使用已被批准。经过多年探索，噬菌体在防控金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等较为常见致病菌中的应用已日渐成熟，但肺炎克雷伯菌作为近些年才逐步被研究人员所重视的条件致病菌之一，关于其噬菌体治疗相关的报道较少。本文基于国内外对肺炎克雷伯菌及其噬菌体的研究数据，综述了肺炎克雷伯菌的感染现状，简述了噬菌体疗法的研究进展，主要分析了噬菌体在治疗肺炎克雷伯菌感染方面的应用，并提出了未来对基于肺炎克雷伯菌噬菌体的抗菌研究和应用的展望。

1 肺炎克雷伯菌研究概况

肺炎克雷伯菌是一种常见的革兰氏阴性致病菌，在环境中广泛存在。作为一种人兽共患病病原，肺炎克雷伯菌已成为除大肠杆菌外最常见的条件致病菌。肺炎克雷伯菌通过受污染的食物或水传播，并与社区获得性感染、医院获得性感染有关。该菌由于携带抗菌药物抗性编码基因的各种质粒，可产生多重耐药表型，对人类和动物健康、生态环境都是一个挑战^[1]。在动物安全方面，可引起诸如奶牛乳房炎、肺炎、菌血症在内的多种动物疫病^[2]；在食品安全方面，从生鲜蔬菜、鸡肉、猪肝、生鲜牛奶等食品中均有分离出多重耐药肺炎克雷伯菌菌株的报道，尽管存在于食品链中的肺炎克雷伯菌可能不会对食品本身造成危害，但可能会增加食物链上的耐药基因库^[3]；在临床安全方面，肺炎克雷伯菌引发的院内感染较为严重，受到了广泛关注。从“低致病性条件致病菌”到“高发病率主要病原菌”的转变，使得肺炎克雷伯菌逐渐引起科研人员的重视，目前的研究大多集中在肺炎克雷伯菌的毒力和耐药性等方面。

1.1 经典肺炎克雷伯菌与高毒力肺炎克雷伯菌

肺炎克雷伯菌是目前临床上最为常见的条件致病菌之一，经典型肺炎克雷伯菌(“Classic” K. pneumoniae，cKP)通常可引起医院获得性感染，在免疫力低下的患者中致病。在不断进化的过程中，亚洲最初出现了具有高黏性表型的高毒力肺炎克雷伯菌(“Hypervirulent” K. pneumoniae，hvKP)^[4]，而后世界各地都零星出现严重感染病例。相较于cKP，高毒力肺炎克雷伯菌往往更具致病性，而且常伴随严重的后遗症。这些菌株的出现对公众健康造成了巨大的威胁，因此，尽早地分离鉴定出hvKP菌株，评估其与临床和流行病学数据的相关性，对临床预防和治疗具有重大意义。最初研究者以菌落呈现高黏液性作为筛选hvKP的标志，但是后来的研究证实并非所有的hvKP都表现出该特性，一些cKP也可以表现出高黏液黏度表型^[5-6]。荚膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)被认为是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子之一，根据CPS抗原的不同，可将肺炎克雷伯菌分为82个血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57型荚膜血清型与hvKP密切相关，是最常见、毒力最强的型别^[7]。随着对肺炎克雷伯菌毒力基因研究的逐步深入，研究人员逐渐结合关键毒力基因型来定义hvKP菌株，iroB、iucA、peg-344、rmpA和rmpA2是目前用于定义hvKP较为准确的分子标记^[6]。

1.2 肺炎克雷伯菌的耐药性

除高毒力菌株的出现为临床带来了巨大挑战外，耐药性菌株的产生更是困扰临床治疗的另一难题。早期研究人员认为高毒力与耐药性不会叠加出现^[8]，但近年来关于高耐药hvKP分离株的报道越来越多。车皓月等^[9]对我国某三甲医院多个科室2019年上半年分离出的672株肺炎克雷伯菌分布情况及细菌耐药特征进行分析发现，菌株呈现出不同程度的耐药性，在某些科室，出现高耐药情况的菌株对常用抗菌药物的耐药率均大于40%。法国、印度和俄罗斯也报道了相关的感染病例^[10-11]。肺炎克雷伯菌耐药问题日渐突出，使得对肺炎克雷伯菌感染的防控困难重重。

目前关于肺炎克雷伯菌的耐药机制尚未完全研究透彻，但关于常见抗生素耐药机制的研究已有进展，目前已知的大致可分为如下几种：肺炎克雷伯菌因其自身产生的β-内酰胺水解酶对β-内酰胺抗生素产生耐受现象^[12]；对于氨基糖苷类抗生素，其耐药性主要是通过产生氨基糖苷类修饰酶，如N-乙酰转移酶、O-核苷酸转移酶和O-磷酸转移酶实现，这些酶通过共价修饰药物上的特定氨基或羟基来灭活氨基糖苷类药物，肺炎克雷伯菌中最常见的修饰酶为aac(3)-II和aac(6′)-Ib^[13-14]；革兰氏阴性细菌对喹诺酮类药物的耐药性主要由喹诺酮类药物耐药性的点突变介导，这些点突变决定了回转酶和拓扑异构酶IV基因的区域，从而导致靶向修饰^[15]；肺炎克雷伯菌对多黏菌素类抗生素的耐药性主要是通过在脂多糖的类脂A中引入了带正电荷的4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖和/或磷酸乙醇胺来实现^[16]；对于更多抗生素耐药机制的研究仍在进一步进行中。

在本课题组的研究中，用商品化标准规格的抗生素药敏试验(纸片扩散法)对实验室现有的多株肺炎克雷伯菌菌株进行多种抗生素耐药性的测定后，如表 1所示，发现所有菌株均呈现不同程度的耐药现象，而且部分菌株对实验中全部抗生素均出现耐药性。

2 噬菌体疗法 2.1 噬菌体疗法的研究进展

噬菌体是一种在自然界中广泛存在并且能够感染细菌等微生物的病毒，是地球上最丰富的实体，其数量可达10³¹之多^[17]。抗生素的大量不当使用，致使细菌耐药问题日益严重，而在探寻预防和控制细菌的替代疗法时，曾经由于抗生素的普及而日渐淡出的噬菌体疗法再次回到人们的视野。几十年来，在格鲁吉亚共和国等国家，噬菌体疗法一直被应用于治疗细菌感染，并且专门建立了噬菌体研发中心，旨在开发噬菌体治疗^[18]。

在本课题组前期的研究中，试图通过噬菌体疗法，包括噬菌体鸡尾酒疗法、噬菌体裂解酶疗法、噬菌体-抗生素联用等策略治疗畜牧业中的常见动物疫病，并且已经取得了一定的成果。近几年我们的研究主要聚焦在奶牛乳房炎的治疗上，我们使用由3种大肠杆菌噬菌体[vB_EcoM_SYGD1 (简称SYGD1)、vB_EcoP_SYGE1 (简称SYGE1)和vB_EcoM_SYGMH1 (简称SYGMH1)]制成的混合鸡尾酒制剂成功治愈了因大肠杆菌感染而引起的奶牛乳房炎^[19]。我们从牛奶样品中分离出5株多重耐药铜绿假单胞菌，并从奶牛场污水中针对性地分离出一株铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_PAJD-1 (简称PAJD-1)，该噬菌体的细胞壁水解酶对多重耐药铜绿假单胞菌蛋白表现出很强的溶菌能力和广泛的抗菌谱，表明噬菌体PAJD-1可作为治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的候选药物^[20]。

2.2 噬菌体疗法的优势与局限性

噬菌体疗法是使用烈性噬菌体治疗细菌感染的疗法。与其他抗菌疗法相比，噬菌体疗法有以下几个方面的优势：(1) 噬菌体对菌株具有高度特异性；(2) 噬菌体是细菌在自然界的天敌；(3) 噬菌体容易从环境中分离；(4) 噬菌体能够清除特定病原菌而不影响机体内的共生菌群；(5) 由于对真核细胞没有亲和力，噬菌体不能感染真核细胞等。与此同时，由于单一噬菌体本身可能具有抗菌谱窄及可引起机体免疫应答等不足，科学家也采用噬菌体与抗生素联用、噬菌体鸡尾酒疗法、噬菌体裂解酶与抗菌制剂联用等策略提高噬菌体的疗效^[21]。

3 肺炎克雷伯菌噬菌体

目前已有文献对2019年及之前世界各地已报道的109株肺炎克雷伯菌噬菌体的基因组信息进行了整理，这些噬菌体主要从污水及临床患者中分离，基因组大小从19 260-346 602 bp不等，肌尾噬菌体科(Myoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)所占比重较大^[22]。截至目前，NCBI数据库中又陆续公布了许多新分离到的肺炎克雷伯菌噬菌体的基因组信息。我们对2020-2021年报道的含有较为详细信息的99株噬菌体基因组信息进行整理，结果如表 2所示。

关于已测序噬菌体基因组的详细信息，诸多文献中也有相关报道。Sofy等^[23]从埃及食品样品中分离出一株新型噬菌体KPP-5，能够裂解不同来源的多重耐药肺炎克雷伯菌，对其生物学特性及基因组信息分析后发现该噬菌体潜伏期较短，为25 min；其在不同温度和pH水平下表现出较高的稳定性；具有线性的dsDNA基因组，长度为38 245 bp，GC含量为50.8%，预测的开放阅读框为40个，而且未发现噬菌体毒力基因或耐药基因，显示了该噬菌体可作为生物防制剂的潜力。Pertics等^[24]分离并鉴定了一株针对医院K2荚膜血清型肺炎克雷伯菌的噬菌体B1，其在多个温度环境下仍能保持较高的稳定性，研究者们对其解聚酶蛋白进行了表达纯化，肯定了噬菌体B1及其解聚酶作为候选抗菌药物的发展前景。Zhang等^[25]鉴定了一株肺炎克雷伯菌的裂解性噬菌体，将其命名为vB_KpnP_Bp5，该噬菌体潜伏期为5 min，暴发期为40 min，最适pH值为4.0-10.0，可耐受50 ℃高温，系统发育分析显示基因排列和基因含量具有较高的保守性，在肺炎克雷伯菌感染小鼠模型中，噬菌体能显著减轻肺炎克雷伯菌对肺组织的损伤。根据崔泽林等^[26]对NCBI数据库中登录的22株肺炎克雷伯菌噬菌体进行的全基因组分析，肺炎克雷伯菌噬菌体基因组大小不等、跨度较大，目前已注释的开放阅读框表达的相关功能蛋白主要有参与噬菌体组装、裂解、调控、DNA操作、转座、结构组成和一些其他的功能蛋白。

4 噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的临床前研究

在噬菌体特性等研究的基础上，已发现在相关动物感染模型中噬菌体可以用于防控肺炎克雷伯菌引起的感染，并且取得了系列进展。Kumari等^[27]研究发现，在小鼠烧伤感染模型中，应用噬菌体制剂治疗比抗生素或化学物质治疗的效果更显著。Chadha等^[28]在小鼠烧伤感染模型中比较了单种噬菌体与由5种噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒的疗效，发现噬菌体鸡尾酒显示了更好的效果。Cao等^[29]研究表明，在肺部感染后的2 h内，注射噬菌体(10⁹ PFU/小鼠)可明显降低肺部细菌载量，降低细胞炎症因子水平，小鼠存活率从对照组的30%有效提升至80%。Singla等^[30]发现以脂质体材料包被的噬菌体可以在肺部感染发生的3 d前或疾病发生的1 d前对疾病进行有效预防，而非脂质体包被的噬菌体作用有效时间明显缩短。

5 噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的临床研究 5.1 噬菌体治疗细菌感染的临床研究现状

在动物实验中，为了证明噬菌体的有效性，通常会用致命剂量的细菌注射动物，而且噬菌体治疗通常在细菌感染后迅速实施，而临床的实际情况却往往更为复杂。近些年来，随着噬菌体治疗的兴起，相关药代动力学、药效学的研究逐渐增多，噬菌体作为一种特殊的“药物”，具有独特的药代动力学和生物利用度特征。不同的给药途径、噬菌体本身的多样性以及患者(或动物模型)自身的生理差异使噬菌体治疗在临床应用时展示出较大的个体差异，也造成了治疗效果的巨大差异，但目前相关的研究报道较少^[31]。

5.2 噬菌体成功治疗肺炎克雷伯菌感染的临床应用实例

国外噬菌体治疗的临床案例主要集中在格鲁吉亚Eliava研究所噬菌体治疗中心、波兰科学院免疫与实验性治疗研究所等老牌机构^[32]。Nir-Paz等^[33]报道了一名由耐药鲍曼杆菌和肺炎克雷伯菌引起的左胫骨感染患者在接受了噬菌体治疗后，可以观察到阳性菌落总数的减少和组织的愈合，成功避免了患者被截肢。Taha等^[34]报道了一株从埃及吉萨淡水中分离出来的噬菌体ZCKP1，其对从糖尿病患者足部分离出来的肺炎克雷伯菌KP/01具有杀菌活性，展现了噬菌体对糖尿病所引起的并发症(糖尿病足)具有潜在的治疗价值。在中国，成立于2017年的上海噬菌体与耐药研究所于2018年初启动了国内首个伦理审批的噬菌体治疗临床试验。石鑫^[35]使用肺炎克雷伯菌噬菌体鸡尾酒制剂(JD902、JD905、JD908和JD910-2)，在经过4个阶段的治疗后，成功治疗了一名由泛耐药性肺炎克雷伯菌引起的泌尿系统感染患者。曾毅刚等^[36]使用噬菌体混合液，同时联合应用美罗培南、阿米卡星，以膀胱灌注的方式进行2次治疗，成功治愈了上海噬菌体与耐药研究收治的一例泌尿道复杂性泛耐药肺炎克雷伯菌感染患者。

6 噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的挑战与展望

作为抗生素治疗的有效补充手段，噬菌体用于临床抗感染治疗在越来越多的国家和地区受到重视，因此亟须系统深入的基础研究以推动噬菌体临床应用的规范化及安全性。除了噬菌体治疗目前存在的通用问题如携带毒力基因、诱导机体产生免疫反应、抗菌谱窄等，关于噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的现有挑战还包括：(1) 比起金黄色葡萄球菌噬菌体等，国内外关于肺炎克雷伯菌噬菌体基因组的研究还停留在早期阶段，数据量较少，没有建立较为系统的肺炎克雷伯菌噬菌体库，许多未知功能蛋白的存在也成为噬菌体使用的潜在威胁。(2) 对于肺炎克雷伯菌噬菌体的安全性评价，不论是环境安全性还是机体安全性目前仍无统一的标准。(3) 截至目前报道的关于肺炎克雷伯菌噬菌体治疗的可参考临床案例较少，临床治疗中使用的噬菌体的具体滴度无可靠资料以供参考，只能根据临床的使用效果进行经验性施用。(4) 在临床治疗中，噬菌体通常直接从自然界中分离，在进行临床试验之前，仅对其裂解能力进行评估，但在有限的治疗时间内无法对噬菌体的其他性能如分子水平的安全性做进一步评估。(5) 在临床治疗中，通常是噬菌体与抗生素联用治愈患者，二者相辅相成，较难区分单一组分的具体疗效。在仅使用噬菌体制剂的过程中也有出现病情反复情况的报道。(6) 在本课题组的研究中，我们发现肺炎克雷伯菌会产生抗噬菌体的突变株，也为后续研究和应用带来了极大挑战。当然，这些挑战也将成为未来应用噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的主要研究方向。

基于以上挑战，我们提出如下解决方向：(1) 丰富肺炎克雷伯菌噬菌体库，增加可供选择的噬菌体数目。(2) 积极探索肺炎克雷伯菌噬菌体的相关功能蛋白，如裂解酶、解聚酶等。(3) 基于生物信息学分析从基因水平上提高噬菌体使用的安全性。(4) 推动噬菌体产业化进程，明确产品安全标准，协同有关部门建立标准的生产和制造相关法规。(5) 积极探索噬菌体与抗生素、功能肽、酶类等联用的杀菌效果。(6) 噬菌体各研究单位间应积极进行优势资源整合，加强校企合作产学研融合，共同推动噬菌体产业在我国的发展。

尽管噬菌体疗法的广泛使用是一个具有挑战性的过程，但将带来远超出其本身的社会、商业和经济效益。随着噬菌体制剂的完善和标准化，以及动物和临床试验数据的不断积累，我们相信噬菌体将成为未来抗击超级细菌的新型重要武器。