2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 刘叶, 阿依保他·托合达白, 郭楠楠, 柳自清, 张博然, 朱琦, 顾爱星
- LIU Ye, Ayibaota·Tuohedabai, GUO Nannan, LIU Ziqing, ZHANG Boran, ZHU Qi, GU Aixing
- 农杆菌介导的棉花枯萎病菌转化体系的优化
- Optimization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system for Fusarium oxysporum
- 微生物学通报, 2021, 48(9): 2991-3001
- Microbiology China, 2021, 48(9): 2991-3001
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.201161
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文章历史
- 收稿日期: 2020-12-16
- 接受日期: 2021-01-20
- 网络首发日期: 2021-03-25
2. 农林有害生物监测与安全防控重点实验室 新疆 乌鲁木齐 830052;
3. 新疆农业大学农学院 棉花教育部工程研究中心 新疆 乌鲁木齐 830052
2. Key Laboratory of the Pest Monitoring and Safety Control of Crops and Forests of the Universities of the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi, Xinjiang 830052, China;
3. Engineering Research Centre of Cotton, Ministry of Education, College of Agriculture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang 830052, China
新疆是中国唯一的海岛棉产区[1]，近年来，海岛棉种植面积在不断增加，而海岛棉易感枯萎病，使得棉花枯萎病逐渐成为威胁海岛棉产业发展的主要病害[2-3]。目前，我国关于陆地棉的棉花枯萎病的研究主要是通过抗病品种的选育与应用，由于海岛棉缺乏抗病品种，同时其致病机理目前还不是十分明确，因此发病面积逐年增加，目前已成为影响我国海岛棉生产发展的主要问题[4-5]。
棉花枯萎病致病菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)，菌丝透明，有间隔[6]。关于棉花枯萎病的致病机理前人已有相关研究，但是目前还不明确其具体机制，因此有必要建立一套有效的棉花枯萎病菌遗传转化体系为人们从基因水平研究其表达调控机制和进一步的菌株改造提供条件。农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation，ATMT)技术有着操作简单、转化效率高、重复性好等优点，而且利用该方法获得的转化子具有遗传稳定性，在真菌遗传转化研究中被广泛应用[7]。许苗苗等[8]通过ATMT法构建了青色荧光标记的禾谷镰孢(Fusarium graminearum)转化子。黄亚丽[9]通过ATMT构建了含有4 500株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)转化子的突变体库。王梅娟等[10]通过ATMT法构建玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)突变体库。李春强等采用ATMT的方法对西瓜枯萎病菌进行了遗传转化并观察其在西瓜中的定殖情况[11-12]。梁慎等[13]采用ATMT的遗传转化方法实现了西瓜枯萎病菌的转化。侯甲男等[14]利用原生质体转化法(Protoplast Transformatio，PEG)将GFP基因转入棉花枯萎病菌中。然而，利用ATMT介导棉花枯萎病菌并优化其体系的文章还未见报道。同时绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作为一种报告蛋白已被广泛应用于研究植物与真菌的相互作用，用其标记的病原体可以在整个感染过程中进行观察并调查。因此，建立一套高效而稳定的棉花枯萎病菌遗传转化体系，研究棉花枯萎病菌在海岛棉中的侵染和定殖过程有助于培育新的海岛棉抗病品种，同时为棉花枯萎病的防治提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株棉花枯萎病菌是由本实验室保存的中等致病力的7号生理小种st89。双元质粒载体pCH-sGFP由江苏省农业科学院植物保护研究所刘延利老师惠赠，该质粒载体含有绿色荧光蛋白GFP作为报告标记基因，潮霉素B Hyg作为筛选的标记基因。质粒PCH-sGFP以冻融法转入农杆菌LBA4404中备用。
1.1.2 培养基实验中使用的培养基有：PDA培养基，LB培养基[8]。
IM诱导培养基(g/L)：K2HPO4·3H2O 3.44，KH2PO4 1.45，NaCl 0.15，MgSO4·7H2O 0.50，(NH4)2SO4 0.50，CaCl2·2H2O 0.067，FeSO4·7H2O 0.002 5，葡萄糖1.80，吗啉乙磺酸7.80，甘油5 mL，pH 5.4；用于农杆菌的稀释。
CM培养基：在IM诱导培养基中加入1.5%琼脂；用于诱导农杆菌侵染棉花枯萎病菌。
1.1.3 主要试剂和仪器潮霉素B、乙酰丁香酮、头孢噻肟钠、利福平、卡那霉素，Solarbio公司；吗啉乙磺酸(Monohydrate，MES)，福瑞克公司；2×San Taq PCR Mix预混液(含蓝染料)，生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由华大基因合成。
高压蒸汽灭菌锅、Easy Cycler PCR仪，济南好来宝医疗器械有限公司；全自动凝胶成像仪，上海土森视觉科技有限公司；智能生化培养箱、高速冷冻离心机，上海仪天科学仪器有限公司；倒置荧光显微镜，北京冠普佳科技有限公司。
1.2 潮霉素B对棉花枯萎病菌生长的影响准备在28 ℃、220 r/min培养7 d的棉花枯萎病菌菌株，在含潮霉素B不同浓度(0、25、50、100、150、200 mg/L)的PDA培养基上，分别接种枯萎病悬浮液100 µL (孢子浓度106个/mL)和直径5 mm的PDA菌饼(沿菌龄一致的菌落边缘打取)，每个浓度各3次重复，28 ℃暗培养5 d后观察菌落生长情况，确定潮霉素B的使用浓度。
1.3 头孢噻肟钠对根癌农杆菌抑菌浓度的测定将含有质粒的根癌农杆菌接种于LB液体培养基中(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)，28 ℃、200 r/min振荡培养，当OD600值为0.6时，取150 μL农杆菌菌液涂布于含头孢噻肟钠分别为0、50、100、150、200 μg/mL的LB平板上，每个浓度3次重复，28 ℃暗培养，1 d后观察平板中菌落的生长情况，确定头孢噻肟钠的抑菌浓度。
1.4 棉花枯萎病菌的遗传转化农杆菌的转化及培养[13]：质粒pCH-sGFP采用冻融法转化到农杆菌LBA4404中。挑取农杆菌单菌落于LB液体培养基中(含50 μg/mL Kan和25 μg/mL Rif)，28 ℃、200 r/min振荡培养过夜。12 h后取1.5 mL菌液，12 000 r/min离心2 min，去上清，用IM诱导培养基(含200 μmol/L Acetosyringone，AS)清洗2次，再用适量IM诱导培养基(含200 μmol/L AS)悬浮菌体，使之稀释至OD600约为0.15，于28 ℃、200 r/min继续振荡培养至OD600为0.6−0.8，备用。
棉花枯萎病孢子悬浮液的制备：将野生型棉花枯萎病菌株st89于PDA培养基28 ℃静置培养7 d，用适量灭菌蒸馏水冲洗菌株得到孢子悬液，血球计数板计数，用无菌水稀释调整至孢子浓度为1×106个/mL后备用。
农杆菌介导棉花枯萎病菌遗传转化[15]：将准备好的农杆菌和孢子悬浮液分别取100 μL后等体积混合均匀；将孔径为0.45 μm，直径为50 mm的微孔滤膜平铺到CM (含200 μmol/LAS)平板上；取200 μL混合液均匀涂布在微孔滤膜上，28 ℃共培养2 d后将微孔滤膜取下，用500 μL无菌水冲洗收集共培养物，按每皿100 μL将共培养物涂布于筛选培养基PDA (含有150 mg/L的潮霉素B及200 mg/L的头孢)中，28 ℃培养约5 d能长出的菌落初步确定为转化子。
1.5 ATMT介导棉花枯萎病菌条件的优化影响ATMT转化效率的主要因子包括：农杆菌起始浓度和预培养时间、孢子悬浮液浓度、孢子悬浮液和农杆菌比例、乙酰丁香酮浓度、共培养介质、共培养时间、培养温度、IM的pH值[16]。本实验后续条件的优化是在前面已确定的优化条件下进行。
(1) 农杆菌起始浓度和预培养时间的优化：将含有质粒的农杆菌LBA4404按1.4方法培养和收集后，以无菌IM液体培养基重悬至3个不同的浓度(OD600为0.1、0.2、0.4)，28 ℃、200 r/min下分别培养0、4、6、8、12 h，然后与等体积的孢子浓度1×106个/mL的棉花枯萎病孢子悬浮液混匀，每皿取200 μL混合液涂于CM培养基(含200 μmol/mL乙酰丁香酮)的微孔滤膜上，28 ℃共培养60 h后，用500 μL无菌水冲洗微孔滤膜转移共培养物至PDA培养基(含头孢200 mg/L及潮霉素B 150 mg/L)，28 ℃培养5 d，筛选转化子，计算转化效率。每处理培养3皿。筛选最佳农杆菌起始浓度和预培养时间。
(2) 孢子悬浮液浓度的优化：在PDA培养基上培养棉花枯萎病菌，待产孢后，用无菌水稀释成104、105、106、107个/mL 4个梯度，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最佳孢子悬浮液浓度。
(3) 孢子悬浮液和农杆菌比例的优化：将1×105个/mL枯萎病菌孢子悬浮液和经诱导后的农杆菌按1:1、1:2、2:1这3个比例混合，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最佳孢子悬浮液和农杆菌比例。
(4) 乙酰丁香酮浓度的优化：将CM培养基中AS浓度设置为0、100、200、300、400 μmol/mL，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最适乙酰丁香酮浓度。
(5) 共培养介质的优化：设置铺有微孔滤膜、玻璃纸及定性滤纸的CM培养基，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最佳共培养介质。
(6) 共培养时间的优化：将混合液涂布于CM平板上后，28 ℃分别共培养1、2、3、4、5、6 d，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最佳共培养时间。
(7) 培养温度的优化：设置培养温度为24、26、28、30 ℃这4个梯度，其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选最佳培养温度。
(8) IM培养基pH值的优化：将IM培养基用HCl分别将pH值调整为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0。其余步骤同1.4且在上述已优化的条件下进行，每处理各3皿。筛选出最佳IM培养基的pH值。
1.6 转化子PCR检测和荧光观察为了进一步验证阳性转化子，取少量菌丝置于100 μL NaOH溶液(l50 mmol/L)中沸水浴10 min，再加入10 μL Tris-HCl缓冲液(1 mol/L pH 8.0)，12 000 r/min离心2 min后，上清用作PCR的DNA模板[17]，分别用GFP和潮霉素引物进行PCR验证。引物为GFP-F (5′-GACGTAAACGGC CACAAGTT-3′)和GFP-R (5′-GAACTCCAGCAGG ACCATGT-3′)；Hyg-F (5′-GATGTAGGAGGGCGT GGATA-3′)和Hyg-R (5′-CTCTGATAGAGTTGGTC AAG-3′)。PCR反应体系(25 μL)：10 μmol/L的GFP及10 μmol/L Hyg引物F/R各1 μL，2×San Taq PCR Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，退火温度(GFP引物退火温度为58 ℃，Hyg引物退火温度为55 ℃) 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，观察记录结果。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
取PCR鉴定结果为阳性的转化子的菌丝和分生孢子样品制作临时玻片，在倒置荧光显微镜下观察是否有绿色荧光。
2 结果与分析 2.1 农杆菌介导棉花枯萎病菌遗传转化 2.1.1 潮霉素B对棉花枯萎病菌的敏感性棉花枯萎病菌在含不同浓度潮霉素B的PDA培养基上培养后，其生长受到不同程度的抑制。当潮霉素B的浓度为0 μg/mL时，棉花枯萎病菌培养7 d后菌落已覆盖全皿；25−100 μg/mL潮霉素B使菌株生长受到强烈抑制，在150 μg/mL潮霉素B上的菌丝完全不能生长。因此，本研究以150 μg/mL潮霉素B来筛选转化子。
2.1.2 头孢噻肟钠对根癌农杆菌抑菌浓度的测定农杆菌菌液涂于含有不同浓度头孢噻肟钠的LB培养基上，28 ℃培养3 d后，在浓度为0、50、100、150 μg/mL的处理中均能出现菌落，200 μg/mL的处理无菌落出现。因此，筛选转化子时选择头孢浓度为200 μg/mL作为农杆菌的抑菌浓度。
2.1.3 农杆菌起始浓度和预培养时间对转化效率的影响实验结果发现在其他条件不变的情况下，当农杆菌起始浓度OD600为0.2，预培养时间为6 h时，可以得到108.33个转化子/105个孢子，当农杆菌浓度OD600为0.1，预培养时间为8 h时，可以得到127.67个转化子/105个孢子，结果发现适当增加农杆菌的起始浓度至OD600为0.2，并且在预培养时间至8 h的转化率最高，得到217.33个转化子/105个孢子。若将农杆菌起始浓度增加至OD600为0.4，预培养时间为8 h时，仅能得到42.67个转化子(图 1)。
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| 图 1 农杆菌起始浓度和预培养时间对转化效率的影响 Figure 1 Effect of Agrobacterium tumefaciens initial concentration and preculture time on conversion efficiency |
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孢子悬浮液浓度在104、106、107个/mL时转化率分别为182、174、133个转化子/105个孢子，孢子悬浮液浓度在105个/mL时转化率最高，可以得到217.66个转化子/105个孢子(图 2)，过高的孢子悬浮液浓度可能造成转化子假阳性较高。
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| 图 2 孢子悬浮液浓度对转化效率的影响 Figure 2 Effect of spore suspension concentration on conversion efficiency 注：a、b、c为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a, b, c are significant difference markers (P < 0.05) |
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分别设置孢子悬浮液和农杆菌的体积比为1:1、1:2、2:1，当孢子悬浮液与根癌农杆菌的体积比为1:1时，转化效率为236.33个转化子/105个孢子，将农杆菌增加1倍二者体积比达到1:2时，转化子的数量显著降低为163.67个转化子/105个孢子，当孢子悬浮液增加1倍二者体积比例达到2:1时，转化子的数量显著降低为144.67个转化子/105个孢子(图 3)。
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| 图 3 孢子悬浮液和农杆菌比例对转化效率的影响 Figure 3 Effect of spore suspension and Agrobacterium ratio on conversion efficiency 注：a和b为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a and b are significant difference markers (P < 0.05) |
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分别设置AS浓度为0、100、200、300、400 μmol/mL，当AS浓度为0 μmol/mL时只有26个转化子/105个孢子出现，随着AS浓度的增加转化率有所提高，当AS浓度为200 μmol/mL时，转化率显著高于其余AS浓度的转化率，可以得到246.33个转化子/105个孢子(图 4)。
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| 图 4 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响 Figure 4 Effect of AS concentration on conversion efficiency 注：a、b、c为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a, b, c are significant difference markers (P < 0.05) |
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分别设置铺有微孔滤膜、玻璃纸及定性滤纸的CM培养基。结果发现在定性滤纸上的转化效率为44个转化子/105个孢子，玻璃纸的转化效率81个转化子/105个孢子，微孔滤膜的转化效率为245个转化子/105个孢子(图 5)，显著高于玻璃纸及定性滤纸的转化效率。
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| 图 5 共培养介质对转化效率的影响 Figure 5 Effect of co-culture medium on conversion efficiency 注：a、b、c为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a, b, c are significant difference markers (P < 0.05) |
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本实验设置共培养时间分别为1、2、3、4、5、6 d，研究发现，共培养时间4 d为最佳，可以得到247个转化子/105个孢子(图 6)，此时的转化效率显著高于其他培养时间，若是继续增加共培养时间，转化效率逐渐降低。
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| 图 6 共培养时间对转化效率的影响 Figure 6 Effect of co-culture time on conversion efficiency 注：a、b、c、d、e为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a, b, c, d, e are significant difference markers (P < 0.05) |
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共转化时过高的转化温度会使农杆菌的转化功能丧失，过低的温度会导致各种菌体活性降低[18]。分别设置培养温度为24、26、28、30 ℃ 4个梯度，由图 7可以看出，其最佳共培养温度为26 ℃，可以得到249.67个转化子/105个孢子。当温度为24、28和30 ℃时，转化率分别为191、224、187个转化子/105个孢子。
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| 图 7 共培养温度对转化效率的影响 Figure 7 Effect of co-culture temperature on conversion efficiency 注：a、b、c为差异显著性标记(P < 0.05) Note: a, b, c are significant difference markers (P < 0.05) |
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在固定温度和时间培养条件的基础上，共培养时IM固体培养基的pH值对转化子的转化效率也有相当大的影响。当IM固体培养基的pH值为5.3时转化效率达到最高，转化子可达到252个/105个孢子左右，而当pH 5.0或6.1时，几乎没有转化子。由表 1可以看出当pH值为5.3时转化效率达到最高，显著高于pH 5.4及5.2，极显著高于pH 5.2及5.5。
| IM培养基pH pH value of IM medium |
每105个孢子获得的转化子数 Number of transformants per 105 spores |
差异显著性 Significance of difference |
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| P < 0.05 | P < 0.01 | ||
| 5.0 | 7.33±1.45 | f | E |
| 5.1 | 47.67±8.74 | e | D |
| 5.2 | 176.67± 6.69 | c | B |
| 5.3 | 252.00±7.37 | a | A |
| 5.4 | 233.00±5.77 | b | A |
| 5.5 | 181.33±4.10 | c | B |
| 5.6 | 179.00±5.29 | c | B |
| 5.7 | 86.33±3.48 | d | C |
| 5.8 | 44.33±6.69 | e | D |
| 5.9 | 8.33±2.40 | f | E |
| 6.0 | 1.00±0.58 | f | E |
| 注：字母均为差异显著性标记 Note: Letters are significant difference markers |
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对随机选取的13个转化子进行PCR扩增，野生型st89及质粒PCH-sGFP分别作为阴性和阳性对照，从图 8可以看出，随机挑选的13个转化子均可扩增出与载体大小一致的片段(712 bp)，说明这些转化子极有可能都是阳性克隆。将扩增后的PCR产物测序结果在NCBI进行BLAST，其与Hyg及GFP的基因序列一致性为100% (图 9和图 10)，证明GFP基因已成功转入棉花枯萎病菌中。
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| 图 8 阳性转化子PCR鉴定结果 Figure 8 PCR identification results of positive inverters 注：M：2000 DNA Marker；1：阳性对照质粒PCH-sGFP；2：阴性对照野生型菌株st89；3：清水对照；4−16：转化子 Note: M: 2000 DNA Marker; 1: Positive control PCH-sGFP; 2: Wild-type st89; 3: CK; 4−16: Transformants |
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| 图 9 潮霉素B引物下转化子PCR产物序列在NCBI比对结果 Figure 9 PCR product sequences of inverters with hygromycin B primer were compared at NCBI |
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| 图 10 GFP引物下转化子PCR产物序列在NCBI比对结果 Figure 10 PCR product sequences of inverters with GFP primers were compared at NCBI |
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转化子在含有潮霉素B的PDA培养基中为白色，在不含潮霉素B的PDA培养基中为紫色(图 11)。分别挑取转化子和野生菌株菌丝制作临时玻片，在荧光显微镜下观察结果表明，野生菌株的菌丝和分生孢子没有观察到任何荧光，而转化子的菌丝和分生孢子均能发出稳定的绿色荧光(图 12)，证明GFP基因已成功转入棉花枯萎病菌中。
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| 图 11 部分转化子形态图 Figure 11 Part of the transformants morphology 注：A：含潮霉素B的PDA培养基；B：不含潮霉素B的PDA培养基 Note: A: PDA medium containing hygromycin B; B: PDA medium without hygromycin B |
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| 图 12 转化子连续继代培养5次后的荧光鉴定 Figure 12 Fluorescence identification of transformant after 5 consecutive subcultures 注：A1：转化子菌丝在488 nm的波长下视野(200×)；A2：明场视野(200×)。B1：转化子分生孢子在488 nm的波长下视野(200×)；B2：明场视野(200×)。C1：野生型菌丝及分生孢子在488 nm的波长下视野(200×)；C2：明场视野(200×) Notes: A1: Mycelium of transformants in the field of view at 488 nm (200×); A2: Bright field (200×). B1: Conidia of transformants in the field of view at 488 nm (200×); B2: Bright field (200×). C1: Mycelium and conidia of wild type in the field of view at 488 nm (200×); C2: Bright field (200×) |
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ATMT法是丝状真菌遗传转化的一种有效方法，现已利用ATMT实现了多种丝状真菌的遗传转化[19]，虽然转化步骤上没有太大差异，但是对于不同真菌最佳转化条件的要求却有很大区别，转化效率高低与多种因素有关，如：农杆菌浓度、孢子悬浮液浓度、农杆菌和真菌孢子的比例、诱导和共培养阶段的时间长度、AS浓度、温度以及共培养介质等因素有关[20]。
就潮霉素的使用浓度而言，侯甲男等[14]完全抑制棉花尖孢镰刀菌的潮霉素B最低浓度为300 μg/mL；肖荣凤等[21]发现完全抑制西瓜尖孢镰刀菌的潮霉素浓度为150 μg/mL。本研究发现抑制枯萎病菌生长的潮霉素浓度为150 μg/mL。
多数研究表明AS在农杆菌与受体材料共培养期间是不可缺少的，不加AS诱导就不能获得转化子且随着AS浓度的增加转化子数目也明显增加[22]。同时有研究表明若期望得到高比例单拷贝的转化子，共培养时AS浓度不宜太高[23]。本研究表明，AS浓度在0−200 μmol/L范围内，农杆菌LBA4404浓度对棉花枯萎病菌的转化效率呈正相关，若AS浓度增加到300 μmol/L时，转化效率显著降低。
在AGL-1转化Penicillium digitatum过程中发现，当孢子浓度低于104个/mL会严重影响转化效率[9]。本文发现当孢子浓度为104个/mL时转化子数量为182个转化子/105个孢子，当孢子浓度为105个/mL时转化子数量为217.67个转化子/105个孢子，但若继续增加孢子浓度，转化子数量逐渐降低。
一般而言，共培养时间越长，所得到的转化子就越多[24]。本文发现转化时间在4 d时棉花枯萎病菌的转化效率达到247个/105孢子，4 d后转化效率逐渐降低，这可能是由于CM平板中头孢的作用效果逐步下降从而造成农杆菌严重污染，产生农杆菌斑干扰转化子的纯度和增加筛选转化子的难度，以及假阳性克隆的产生给转化子筛选带来难度。在农杆菌介导的其他真菌转化体系中也有类似现象发生[25]。
此外，在本研究中发现，转化子在PDA培养基(含有潮霉素B 150 μg/mL)进行初次继代培养一段时间后，其菌丝均为白色，但培养时间过长时平板中心区域呈现和未经转化的枯萎病菌一样的紫红色，经过第2次的继代培养不会出现紫红色。这可能是由于转化子的不稳定导致的，但经过5次继代的筛选，此现象不再出现，转化子在含有潮霉素的PDA上均为白色，因此多次继代筛选就显得尤为必要。
本研究对影响ATMT转化棉花枯萎病菌的条件进行了优化，转化效率达到252±7.37个/105个孢子，为构建大规模的棉花枯萎病菌ATMT突变体库奠定了基础。
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