重楼是百合科(Liliaceae)重楼属(Paris L.)植物，已被收录入《国家重点保护野生植物名录》。2015版《中华人民共和国药典》仅收载滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)和七叶一枝花(Paris polyphylla)为药材重楼的基源植物^[1]。华重楼是其变种，主要分布在湖北、湖南、江西、贵州、浙江等长江中下游地区^[2]，而另外一种变种狭叶重楼(Paris polyphylla var. stenophylla)主要分布在甘肃、陕西一带^[3]。重楼以干燥根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、抗癌^[4-5]等功效。近年来华重楼需求量逐年增加，加之主产区乱采滥挖，野生种质资源遭到严重破坏。生态种植是保护华重楼资源、满足相关产业可持续发展的首选途径之一^[6]，相较于中药材“Good Agricultural Practices (GAP)”种植，其更加强调过程管理和投入品的使用，禁止化学合成的肥料、农药的使用，鼓励植物源、微生物源等环境友好的生物产品的使用是其基本要求。

重楼生长缓慢，对环境要求苛刻，喜温暖湿润，怕强光直射^[7]，过度光照会抑制光合作用而导致氧化损伤^[8]。此外，根腐病也普遍发生，是危及重楼生长的主要病害之一^[9]。关于重楼内生菌已有研究报道，耿红等^[10]探究了滇重楼根的内生细菌多样性，分离到的内生细菌归属4个门5个纲7个目11个科，通过与小麦幼苗的共培养，筛选获得10株具有促进生长作用的菌株。王艳等^[11]应用Illumina MiSeq PE250高通量测序技术对重楼根际土壤、根及根茎内生真菌进行多样性测定，结果表明根茎内生菌主要分布于51个属，其中相对百分含量前5的有Roseodiscus (占比83.30%)、Cadophora (占比2.89%)、枝孢属(占比2.15%)、Oliveonia (占比1.40%)、曲霉属(占比0.82%)。王茜等^[12]从滇重楼根、块茎、叶中分离内生真菌，基于rDNA ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定，结果表明镰刀菌属(Fusarium)分离率最高(0.87)，优势度为11.62%；曲霉属(Aspergillus)分离率较高(0.16)，优势度为2.14%。综上所述，重楼内生真菌的分离鉴定及多样性研究较多，功能研究报道较少。曲霉属是重楼内生真菌优势属之一，易于分离培养，本研究拟从甘肃分布的华重楼中分离内生真菌，研究曲霉属益生真菌功能，及其对华重楼幼苗生理生化、内源激素水平的影响，以期为促生、抗病益生菌及专用肥的开发提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 试验所用药材及菌种

华重楼采自甘肃省平凉市华亭县关山，海拔2 500 m，由甘肃省科学院生物研究所杨晖研究员根据中国植物志^[3]第15卷第92页对华重楼的形态学描述鉴定为华重楼。华重楼2年生种苗自繁于兰州市和平镇生物苑基地，海拔1 800 m。

根腐病病原真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)分离自根腐病药用植物华重楼，保藏于中国工业微生物菌种保藏中心甘肃分中心，保藏号为GSICC 60612；腐烂病病原细菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum，Pcc ATCC 15713)购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.1.2 主要试剂和仪器及培养基

丙二醛测定试剂盒(分光光度法)、叶绿素测定试剂盒(分光光度法)，苏州科铭生物技术有限公司。Biolog微生物鉴定仪，珠海美华医疗科技有限公司。

马丁培养基(g/L)：蛋白胨5.00，磷酸氢二钾1.00，硫酸镁0.50，酵母浸出粉2.00，葡萄糖20.00，用于真菌的生长培养。阿须贝培养基(g/L)：磷酸二氢钾0.20，硫酸镁0.20，氯化钠0.20，碳酸钙5.00，甘露醇10.00，硫酸钙0.10，琼脂15.00，加入0.5%的刚果红5 mL/L，灭菌后制成平板备用，用于固氮菌活性筛选。NBRIP无机磷固体培养基(g/L)：葡萄糖10.00，磷酸钙5.00，氯化镁5.00，硫酸镁0.20，氯化钾0.20，硫酸铵1.00，琼脂15.00，用于真菌解磷能力的定性测定。虎红固体培养基(g/L)：蛋白胨5.00，葡萄糖10.00，磷酸二氢钾1.00，硫酸镁(无水) 0.50，琼脂20.00，孟加拉红0.03，用于真菌的分离培养。

1.2 方法

1.2.1 聚多曲霉的分离鉴定

将采收的华重楼种子用自来水流水冲洗10 min，用滤纸吸干表面水分，75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2-3遍，再用0.2%的升汞浸泡10 min，无菌水冲洗3-4遍^[13]，以最后冲洗的无菌水100 μL涂布于虎红固体培养基作为对照。将表面消毒处理后的华重楼种子用灭菌刀片切为小瓣，放置于200 ℃高温干热灭菌处理过的研钵中，加入10 mL灭过菌的生理盐水，充分研磨，吸取上述液体100 μL涂布于虎红固体培养基，重复3次，28 ℃黑暗培养，10 d左右长出不同的真菌。挑少许菌丝到PDA平板上反复纯化4-6代，4 ℃低温保存菌种。

采用Biolog微生物鉴定仪进行生理生化鉴定，将分离内生菌的孢子悬液接种到含有多种碳、氮源及微量成分的微生物鉴定板中，以第一个孔为空白对照，28 ℃培养48 h，750 nm处测吸光值。

采用SDS法提取菌株的DNA^[14]，用引物ITS1 (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) PCR扩增菌株rDNA ITS序列。PCR反应体系(25 μL)：10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1.5 μL，引物ITS 1/4 (10 μmol/L)各1.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1 μL，模板1 μL，ddH₂O 16 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；92 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果提交NCBI数据库BLAST比对，MEGA 7.0构建进化树。

1.2.2 内生菌对玉米种子发芽的影响试验

根据文献[15-16]方法，选择分离出的具有促生、抗病作用的菌聚多曲霉、哈慈木霉(Trichoderma harzianum)进行玉米种子发芽试验。蘸取少量聚多曲霉、哈茨木霉菌体接种到20 mL马丁培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养3 d，将培养好的菌液分别稀释50倍和500倍，分别吸取10 mL加入90 mm×15 mm平皿中，对照为吸取相同体积的无菌水加入平皿中，每个平皿放入100粒玉米种子，每处理重复3次，25 ℃避光培养48 h。计算种子发芽指数(Germination Index，GI)的公式^[17]：GI (%)=(A₁×A₂)/(B₁×B₂)×100

式中，A₁：处理后的种子发芽率(%)；A₂：处理后的平均根长(mm)；B₁：对照种子发芽率(%)；B₂：对照平均根长(mm)。

1.2.3 聚多曲霉的功能分析

固氮活性定性检测：从分离的聚多曲霉jdqmzz-1菌落边缘挑取少量菌丝接种于阿须贝培养基中，28 ℃黑暗培养7 d，观察菌落生长情况。

解磷能力定性检测：将聚多曲霉jdqmzz-1接种于NBRIP无机磷固体培养基上，置于28 ℃培养箱中培养2-5 d，观察有无解磷圈及解磷圈大小，根据解磷圈与菌落比值大小确定其对无机磷的解磷作用。

拮抗性检测：选取根腐病病原菌尖孢镰刀菌(GSICC 60612)与聚多曲霉jdqmzz-1进行平板拮抗试验。将尖孢镰刀菌接种在PDA培养基的正中央，十字对称20 mm处接种聚多曲霉，于30 ℃恒温箱中进行培养。观察菌落生长和抑菌圈状况，计算拮抗指数的公式^[18]：拮抗指数=(抑菌圈半径-拮抗菌半径)/拮抗菌半径。式中，抑菌圈半径为拮抗菌菌落中心至病原菌菌丝边缘的距离。检测聚多曲霉jdqmzz-1菌液对腐烂病病原细菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(ATCC 15713)的抑菌效果。蘸取少量聚多曲霉菌体接种到20 mL马丁培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养3 d，将胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(ATCC 15713)菌液均匀涂布于马丁培养基平板，用无菌滤纸片蘸取聚多曲霉jdqmzz-1菌液并置于马丁平板上，置于28 ℃培养箱中培养2-5 d。

1.2.4 聚多曲霉菌液的LC-MS代谢组检测

蘸取少量聚多曲霉jdqmzz-1菌体接种到50 mL马丁培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养3 d，将培养的菌液5 000 r/min离心10 min，取上清液送南京集思慧远生物科技有限公司测定LC-MS代谢组学，检索文献查找相关化合物的功能或潜在功能。

代谢组分析过程如下：(1) 代谢物提取：取5 mL样本于10 mL离心管中，放入冻干机中冻干12 h；向冻干后的样本加入800 μL的80%甲醇，涡旋1 min；4 ℃超声30 min，于-20 ℃静置1 h，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取200 μL上清，加入5 μL内标(二氯苯丙氨酸2.8 mg/mL)，转入进样小瓶中待LC-MS检测分析。(2) 上机检测。(3) 数据处理。

1.2.5 聚多曲霉对华重楼生长的影响

华重楼幼苗叶片内源激素含量检测：以温室无土基质栽培的2年生华重楼种苗为研究对象，采用完全随机试验设计，重复3次；以无菌水喷施处理为对照，待4月中旬出苗后，叶面喷施聚多曲霉jdqmzz-1菌液，浓度为10⁷ CFU/mL，每2周喷施一次，共处理4次。第4次处理后1周，采摘不同处理的叶片，送北京密码子生物科技有限公司测定内源激素含量，通过LC-MS法测定水杨酸(Salicylic Acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)、脱落酸(Abscisic Acid，ABA)、赤霉素(Gibberellic Acid，GA)、细胞分裂素(Cytokinin)、生长素(Auxin)含量。

华重楼幼苗叶片丙二醛、叶绿素含量检测：以2年生大田华重楼种苗为研究对象，采用完全随机试验设计，重复3次。以无菌水喷施处理为对照，待5月上旬出苗后，叶面喷施聚多曲霉jdqmzz-1菌液，浓度为10⁷ CFU/mL，每2周喷施一次，共处理4次。第4次处理后1周，采摘不同处理的叶片，按照叶绿素及丙二醛测定试剂盒所述方法分别进行测定。

华重楼幼苗地下部分生物量测定：11月初待幼苗倒苗后，收集温室苗和大田苗共同测定其地下部分生物量；分别测量华重楼的根数和根长，去除其根后，留下根状茎，测定根状茎百株重。

1.2.6 统计分析

使用SPSS 22.0软件进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析 2.1 聚多曲霉的分离鉴定

从华重楼中分离得到一株真菌jdqmzz-1 (图 1)：菌丝绒状至絮状，致密有同心环，边缘白色，初生颜色为灰绿色，逐渐变为暗蓝褐色，菌落反面暗褐色，有大量渗出液，色素扩散于基质中呈褐色，基本无气味或具轻微霉味；生理生化鉴定结果与Biolog系统数据库比对，初步鉴定为聚多曲霉；此菌株rDNA ITS序列长度为509 bp，通过NCBI BLAST比对发现与曲霉属菌株Z5 (MN 636770.1)序列一致性为100%，分别选取rDNA ITS序列相似性最高的曲霉属菌株Z5、已有文献报道的具有抗菌作用的聚多曲霉菌株SW9^[19]、杀线虫作用的聚多曲霉菌株Snef210^[20]和有促生作用的聚多曲霉菌株DJ515-2^[21]，曲霉属其他菌株包括黄曲霉(Aspergillus flavus) ATCC 16883、烟曲霉(Aspergillus fumigatus) ATCC 1022、构巢曲霉(Aspergillus nidulans) ATCC 10074、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare) CBS 260.67、土曲霉(Aspergillus terreus) W0707、杂色曲霉(Aspergillus versicolor) S66，使用MEGA 7.0构建进化树(图 2)，此菌株与曲霉属菌株Z5亲缘关系最近，其次是聚多曲霉菌株DJ515-2和Snef210。结合形态学、生理生化鉴定结果(表 1)与测序比对结果，可知筛选得到的真菌jdqmzz-1为聚多曲霉，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.19278。

2.2 内生菌对玉米种子发芽的影响

分别将分离得到的华重楼内生真菌聚多曲霉jdqmzz-1、哈茨木霉CL1的菌液稀释50倍和500倍进行种子发芽试验，对照为无菌水处理。玉米种子的发芽指数GI统计结果如表 2所示，根据统计结果可知，聚多曲霉jdqmzz-1相较于哈慈木霉CL1，可极显著(P < 0.01)促进玉米种子的萌发生长。

2.3 聚多曲霉的功能分析

将分离得到的内生真菌聚多曲霉jdqmzz-1接种到无氮阿须贝培养基上，如图 3A所示，聚多曲霉可以固氮，无氮培养基上菌落清晰可见；聚多曲霉jdqmzz-1在NBRIP无机磷固体培养基上生长无明显溶磷圈，表明其不解磷。聚多曲霉jdqmzz-1与尖孢镰刀菌平板拮抗如图 3B所示，其菌落浓密，呈圆形或椭圆形，与病原菌的接触面呈凸出月牙形，抑菌平板呈黄褐色，病原菌生长抑制明显，拮抗指数是42.50%。如图 3C所示，聚多曲霉jdqmzz-1菌液对病原细菌的抑菌作用明显。

2.4 聚多曲霉菌液LC-MS代谢组检测

聚多曲霉jdqmzz-1菌液正负离子色谱图见图 4。芬克洛宁为内参物质，菌液代谢物质组成及相对内参物的峰面积比值见表 3，比值越大，表示含量相对越高。由表 3可知，聚多曲霉jdqmzz-1菌液含有多种促生、杀虫、抑菌物质。促生作用的物质主要有玉米赤霉烯酮、甜菜碱、对硝基苯酚；抑菌物质主要有邻苯二甲酸酐、对硝基苯甲酸、N, N-二乙基乙醇胺、2-乙基已酸、水苏碱、儿茶酸、杜鹃花酸、异辛酸、马来酸、壬二酸、氯霉素、乳酸；杀虫物质主要有邻苯二甲酸酐、邻苯二甲酸二丁酯、4-乙基苯胺、白僵菌素、邻苯二甲酸苄丁酯、硬脂胺、尼古丁、己二酸、月桂酸；抗氧化功能物质主要有壬基酚、儿茶酸、羟基脯氨酸。

2.5 聚多曲霉对华重楼生长的影响

聚多曲霉jdqmzz-1菌液处理的华重楼幼苗，叶片内源激素含量如图 5A所示，菌液处理较对照水杨酸、茉莉酸、脱落酸、细胞分裂素的含量极显著下降(P < 0.01)，分别下降了16.11%、40.00%、24.44%、20.90%；赤霉素和生长素的含量极显著升高(P < 0.01)，分别达到了1 598.72 ng/g和35.80 ng/g，是对照的54.1倍和2.3倍，促进生长的激素含量上升，胁迫相关激素含量下降，尤其是赤霉素的绝对含量远高于其他激素。菌液处理的华重楼幼苗丙二醛和叶绿素含量如图 5B所示，较对照差异均达到极显著水平(P < 0.01)，丙二醛含量降低了15.20%，叶绿素含量增加了48.80%，达到了209.88 mg/g鲜重。丙二醛含量下降，叶绿素含量升高，表明jdqmzz-1菌液处理起到了胁迫保护和增强光合作用的效果。聚多曲霉jdqmzz-1处理的华重楼幼苗平均根数、平均根长及平均百株重如表 4所示，较对照有显著差异(P < 0.05)，平均根长增加了47.70%，平均根数增加了54.00%，平均百株重增加了67.60%。

2.6 不同指标的相关性分析

聚多曲霉jdqmzz-1处理差异显著的指标进行相关性分析如表 5所示。水杨酸与脱落酸、丙二醛呈正相关，而与赤霉素、生长素、平均根数、平均根长、平均百株重、叶绿素呈负相关；茉莉酸与脱落酸、丙二醛呈正相关，而与赤霉素、生长素、平均根数、叶绿素呈负相关；脱落酸与丙二醛呈正相关，而与赤霉素、生长素、平均根数、平均根长、平均百株重、叶绿素呈负相关；赤霉素与丙二醛呈负相关，而与生长素、平均根数、平均根长、平均百株重、叶绿素呈正相关；细胞分裂素与丙二醛正相关，与叶绿素负相关；生长素与丙二醛负相关，与平均根数、平均根长、平均百株重、叶绿素呈正相关；丙二醛与叶绿素负相关；平均根数、平均根长、平均百株重彼此之间正相关，分别与丙二醛负相关，而与叶绿素正相关。相关系数绝对值较大，表明相关性较强。

3 讨论与结论

氮素是植物生长发育过程中的必需元素，微生物可以通过固氮作用直接促进植物生长^[22]。重楼是一种喜氮作物，氮素能促进华重楼光合速率提高和生物量累积^[23]。本研究分离到的内生真菌分别属于镰刀菌属、曲霉属、木霉属(Trichoderma)、新赤壳属(Neocosmospora)，其中一株曲霉属菌株聚多曲霉jdqmzz-1具有固氮作用，分泌促生和抑菌杀虫物质，对根腐病病原菌尖孢镰刀菌(GSICC 60612)、细菌性软腐病病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(ATCC 15713)具有拮抗作用。Niu等^[24]从深海中分离到一株聚多曲霉MCCC 3A00324，可以产生单萜类和聚酮类化合物，具有抗菌作用。本研究聚多曲霉jdqmzz-1产生的抗菌杀虫物质不同，主要为苯环型化合物、有机酸类化合物、聚酮类化合物、吡啶类化合物等。

聚多曲霉jdqmzz-1促进华重楼幼苗生长的作用显著，其分泌的促生成分有玉米赤霉烯酮、甜菜碱、对硝基苯酚，抗氧化剂有壬基酚、儿茶酸、羟基脯氨酸。玉米赤霉烯酮有促进萝卜黄化子叶变绿和增重的作用^[25]，甜菜碱具有植物促生作用^[26]，对硝基苯酚对生根具有促进作用；壬基酚和儿茶酸激活植物抗氧化酶系统，从而减轻过度光照对作物产生的氧化损伤^[27-28]，羟基脯氨酸是最主要的抗胁迫物质之一。综上所述，聚多曲霉jdqmzz-1菌液具有直接的促生和胁迫保护作用。聚多曲霉jdqmzz-1处理华重楼幼苗，叶绿素、赤霉素、生长素含量显著提高，丙二醛、水杨酸、茉莉酸、脱落酸含量显著降低。叶绿素、赤霉素、生长素与植物生物量存在正相关关系是本领域的公知常识，也有报道认为赤霉素可以提高叶绿素含量，从而提高植物叶片的光合性能^[29]，本研究结果也表明赤霉素与叶绿素存在正相关关系。水杨酸、茉莉酸、脱落酸这3种胁迫相关激素及丙二醛含量显著降低，从植物生理生化的角度印证了其分泌物具有直接的胁迫保护作用，不激活抗性基因的过表达，避免了生物量受到影响。当植物生长过程中遭受生物和非生物胁迫时，水杨酸、茉莉酸、脱落酸大量合成，诱导抗病相关和非生物胁迫抗性相关基因表达，提高抗性生理功能，降低生长速率^[30-31]，而聚多曲霉jdqmzz-1没有激活水杨酸、茉莉酸、脱落酸的上调表达，但显著促进生长、提高胁迫抗性，除了与其分泌物有关外，深层机理有待通过组学联用技术深入研究。