2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 雷蕾, 冯治洋
- LEI Lei, FENG Zhiyang
- 云南土壤宏基因组文库中替加环素耐药基因的筛选与分析
- Screening and analysis of tigecycline resistance genes from Yunnan soil metagenomic library
- 微生物学通报, 2021, 48(6): 2089-2100
- Microbiology China, 2021, 48(6): 2089-2100
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.201042
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文章历史
- 收稿日期: 2020-11-03
- 接受日期: 2020-11-26
- 网络首发日期: 2020-12-24
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一，自从1929年弗莱明发现青霉素以来，越来越多的抗生素逐渐被人类发现，在人类疾病治疗和动植物养殖业上发挥着重要作用。已知的抗生素作用机制主要包括：(1) 与细菌的细胞膜相互作用从而改变细胞膜的通透性，以这种方式作用的抗生素主要有多粘菌素和短杆菌肽；(2) 抑制细菌细胞壁的合成，如β-内酰胺类抗生素；(3) 抑制核酸的复制和转录，如喹诺酮类抗生素；(4) 干扰蛋白质的合成，如四环素类抗生素[1]。但是随着抗生素的广泛应用，出现了抗生素的不合理使用甚至滥用的现象，耐多种抗生素的多重耐药(multidrug resistant，MDR)菌[2]，甚至几乎耐所有抗生素的广泛耐药(extensively drug resistant，XDR)菌[3]也随之出现，这不仅会造成重大的经济损失，也会导致临床上“无药可用”，因此迫切需要寻找新的可以克服现有耐药机制的抗菌药物[4]。
替加环素(tigecycline)在2005年经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准投入临床使用，于2011年末批准在中国上市，属于第三代四环素，克服了传统的核糖体保护蛋白和外排泵这些四环素耐药机制[5-6]。作为首个被批准用于临床治疗的甘氨酰环素类抗生素，其主要针对的是多重耐药的革兰氏阴性菌引起的感染[7]，比如成人复杂腹腔内感染和皮肤及软组织感染[8]，还能治疗几乎对所有抗生素(如头孢菌素类抗生素、青霉素类抗生素，甚至是碳青霉烯类抗生素)都耐药的新德里金属-β-内酰胺酶1 (New Delhi-Metallo-1，NDM-1)超级细菌引起的感染[8]，被誉为临床上抗感染治疗的最后一道防线。然而，随着广泛投入临床使用，对替加环素耐药性的报道也逐渐增多，比如自2007年以来陆续有文献报道在使用替加环素治疗鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠埃希菌(Escherichia coli)感染时有替加环素耐药菌的出现[9-22]，临床上近4年甚至出现了四环素钝化酶Tet (X)[22]及其变异型Tet (X3)[23]、Tet (X4)[23]、Tet (X5)[24]能钝化替加环素，使菌株产生耐药性。这些耐药基因的出现和传播很可能导致替加环素治疗无效，进一步限制治疗方案的选择，给公众健康造成巨大威胁。
本研究采用功能宏基因组学方法从实验室已构建的云南土壤宏基因组文库中进行替加环素耐药基因的筛选，并对基因编码的蛋白质进行生物信息学分析揭示其功能，同时对携带耐药基因的菌株进行最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的测定，以期为研究替加环素耐药机制提供参考，为临床上新型抗生素的研发提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与载体实验所用的土壤样品采集地位于N23°44′、E101°71′的云南，土壤宏基因组文库为Gu等[25]使用Epicentre公司的pWEB-TNCTM Cosmid Cloning Kit在大肠杆菌EPI100TM-T1R中构建；文库约含克隆1.28×107个，克隆中环境微生物eDNA插入片段平均大小为38 kb；大肠杆菌EPI100TM-T1R细胞和载体pWEB-TNC由本实验室保存。
1.1.2 溶液的配制LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，纯水定容至1 L，1×105 Pa灭菌30 min。
MH肉汤培养基：称取MH肉汤粉末10.5 g溶解于500 mL纯水中，1×105 Pa灭菌30 min。
在进行MIC测定时，每种抗生素使用的终浓度如下：替加环素为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL；四环素、盐酸多西环素、阿莫西林、萘啶酮酸为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256 μg/mL；米诺环素、庆大霉素、妥布霉素为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128 μg/mL；环丙沙星为0.007 812 5、0.015 625、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL。
1.1.3 主要试剂和仪器氨苄青霉素(ampicillin)和氯霉素(chloramphenicol)，上海捷瑞生物工程有限公司；替加环素，南京迈博生物科技有限公司；四环素(tetracycline)、盐酸多西环素(doxycycline)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、庆大霉素(gentamicin)、阿莫西林(amoxicillin)、环丙沙星(ciprofloxacin)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；米诺环素(minocycline)、妥布霉素(tobramycin)，南京晚晴化玻仪器有限公司；质粒小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；Sau3A I、BamH I、EcoR I、T4 DNA Ligase，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。24孔细胞培养板和96孔细胞培养板，南京姜华化玻有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；凝胶成像仪，上海欧翔科学仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 耐药阳性克隆的筛选配制含有替加环素2 μg/mL、氯霉素15 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL的液体LB培养基和LB固体培养基，用锡箔纸包好备用。取出24孔细胞培养板，每个孔中各加入1.8 mL的LB培养基，再加入20 μL文库菌混匀，将24孔细胞培养板放置在37 ℃培养箱培养1–3 d。挑取单菌落接种在3 mL液体LB培养基中，37 ℃、225 r/min培养16−48 h，提取质粒并进行检测。
1.2.2 耐药亚克隆的构建按1׃1 000稀释好Sau3A I并对耐药阳性克隆质粒进行部分酶切，在140 V电压下进行1%琼脂糖凝胶电泳50 min，紫外凝胶成像仪下检测，切取2–4 kb片段进行胶回收实验。同时进行pWEB-TNC载体的制备，提取pWEB质粒并用BamH I进行酶切，回收5.8 kb大小片段，使用CIAP对酶切后的回收产物去磷酸化。根据载体和目的片段的浓度，选择载体和目的片段摩尔比为1:3的比例4 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌EPI100TM-T1R细胞，涂布在LB固体培养基上，37 ℃培养1–2 d。挑取固体培养基上的单菌落接种于液体LB培养基中，37 ℃、225 r/min培养1–2 d后提取亚克隆质粒。用EcoR I对亚克隆质粒进行酶切，选取验证正确的质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序。
1.2.3 耐药基因的生物信息学分析将测序结果输入Vector NTI 10.0软件寻找开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)并经BLASTx进行同源序列比对；使用Prot Param (https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质理化性质的预测；使用Prot Scale (https://web.expasy.org/protscale/)进行氨基酸序列的亲水性/疏水性分析；使用GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)进行蛋白质二级结构的预测；使用TMHMM Server V. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质进行跨膜区预测；使用ClustalW软件对氨基酸序列进行多序列比对，将比对结果通过MEGA 5.10软件构建系统进化树；参照Putman等[26]寻找氨基酸序列的保守结构域。
1.2.4 最低抑菌浓度的测定采用微量肉汤稀释法，实验操作及结果评定均依据欧盟药敏试验标准(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)[27]，标准菌株为大肠杆菌ATCC 25922，对照菌株为含质粒pWEB-TNC的大肠杆菌EPI100TM-T1R。先将替加环素母液用MH肉汤培养基按照10倍比稀释为10个梯度，依次为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL，备用。将菌液接种至2 mL液体LB培养基中，37 ℃、225 r/min培养过夜，按照1%接种量接种至10 mL的MH肉汤培养基中，培养至OD625值为0.5–1.0，用MH肉汤培养基稀释菌液至麦氏浊度0.5，此时OD625值为0.08–0.13，菌液浓度为(1–2)×108 CFU/mL，再将其稀释100倍备用。
采用96孔细胞培养板，取含64.0 μg/mL的替加环素MH肉汤培养基100 μL加入第1列孔，第2–10列孔中按照浓度从高到低分别加入剩余9个浓度的替加环素MH肉汤培养基。吸取菌液100 μL分别加入含有替加环素不同浓度的孔板中。第11列加菌液作为对照，第12列加MH肉汤培养基作为空白对照，试验重复3次。封板后37 ℃培养箱避光培养16–18 h后读取药敏结果。以无细菌生长所在孔的最低替加环素浓度作为该菌株的最低抑菌浓度。
1.2.5 外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(Carbonyl Cyanide 3-Chlorophenylhydrazone，CCCP)对MIC的影响实验选用CCCP作为本次实验的外排泵抑制剂，这类抑制剂主要能够显著抑制Major Facilitator Superfamily (MFS)型、Small Multidrug Resistance (SMR)型外排泵蛋白活性。向装有稀释好替加环素(按1.2.4所述方法和浓度)的微型离心管中加入CCCP，使其终浓度分别达到5 μg/mL和4 μg/mL (此浓度经过预实验得出，除此之外预实验还进行了CCCP浓度为3 μg/mL和2 μg/mL的实验)。测定外排泵抑制剂CCCP存在的情况下菌株对替加环素MIC的变化情况，MIC值降至原值的1/4或者更低，则说明该浓度可以抑制外排泵的外排作用，该菌株为外排泵阳性株[28]。
2 结果与分析 2.1 耐药阳性克隆的筛选和亚克隆的构建实验通过筛选云南文库得到一个阳性克隆，对这个阳性克隆进行耐药亚克隆的构建，得到亚克隆314-6-11，使用EcoR I酶切亚克隆质粒，根据pWEB-TNC的图谱寻找酶切位点，发现其有3个EcoR I的酶切位点，用EcoR I酶切载体应该能够切出3 029 bp和2 702 bp两段固定大小的片段和另一条2.0–2.7 kb的插入片段。酶切亚克隆质粒图谱正确，送通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。
2.2 耐药基因的生物信息学分析 2.2.1 替加环素耐药基因的比对及分析将返回的基因序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI)网站上进行blastx分析，结果表明314-6-11基因全长2 453 bp，主要分为一个功能区段，包含全长1 452 bp (314–1 762 bp)大小的开放阅读框，编码483个氨基酸(GenBank序列号为ASU06811.1)，314-6-11蛋白与Streptomyces来源的四环素抗性MFS外排泵(WP_018529066.1)相似性高达89%，推测314-6-11基因也为四环素抗性MFS外排泵基因，携带该基因的菌株也对四环素产生耐药性，甚至可能对其他四环素类抗生素也产生耐药性。
2.2.2 314-6-11蛋白的理化性质和二级结构预测将氨基酸序列输入在线软件Prot Param和Prot Scale进行蛋白质理化性质的预测和氨基酸序列的亲水性/疏水性分析。结果表明，314-6-11蛋白理论分子量为49.98 kD，原子总数为7 151，分子结构式为C2262H3641N601O624S23，理论等电点为7.71，碱性蛋白；不稳定系数为28.31 (< 40)，该蛋白比较稳定；含有20种基本氨基酸，其中酸性氨基酸残基(Asp+Glu)为26个，碱性氨基酸残基(Arg+Lys)为27个；脂肪系数为119.67，亲水性总平均值为0.827 (> 0)，为疏水蛋白。
使用GOR4软件对314-6-11蛋白的二级结构进行分析，结果如图 1所示。可知该蛋白的二级结构由以α-螺旋和无规卷曲为主和β-折叠为辅共同构成。其中41.20%部分是α-螺旋(Hh)，36.23%是无规卷曲(Cc)，还有22.57%是β折叠(Ee)。根据Skolnick等[29]所述分型标准，314-6-11蛋白属于α-β型。
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| 图 1 314-6-11蛋白质二级结构的预测 Figure 1 Predicted secondary structure of 314-6-11 protein 注：h：α螺旋；e：β折叠；c：无规卷曲 Note: h: α helix; e: β pleated sheet; c: Random coil |
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使用TMHMM Server v2.0软件对314-6-11蛋白的跨膜区进行分析，结果如图 2所示，可以推测该蛋白存在14个跨膜区域。使用Vector NTI 10.0软件参考Putman等[26]所述寻找314-6-11蛋白保守结构域的氨基酸序列，结果如图 3所示。图 3中有下划线且标有不同颜色的区域是找到的保守结构域，这些结构域都属于14次跨膜螺旋结构域，并且每个结构域之间的位置和氨基酸数目与典型的14次跨膜螺旋MFS外排泵基本一致，所以印证了跨膜区的分析结果，判定314-6-11蛋白属于14次跨膜螺旋MFS外排泵。
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| 图 2 314-6-11蛋白跨膜区的预测 Figure 2 Predicted transmembrane regions of 314-6-11 protein 注：红色部分：跨膜区域；蓝色部分：细胞膜内区域；粉色部分：位于细胞膜表面；横轴数值：氨基酸个数；竖轴数值：可能性 Note: Red section: transmembrane region; Blue section: intracellular area; Pink section: located on the cell membrane surface; Horizontal axis value: number of amino acids; Vertical axis value: probability |
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| 图 3 314-6-11蛋白保守结构域氨基酸序列 Figure 3 Amino acid sequence of conserved structure from 314-6-11 protein 注：第一行淡紫色部分加下划线区段：motif D1；第二行红色部分加下划线区段：motif A；第三行绿色部分加下划线区段：motif B；第四行粉色部分加下划线区段：motif C；蓝色部分加下划线区段：motif H；第五行黄色部分加下划线区段：motif E；倒数第二行草绿部分加下划线区段：motif F Note: The lavender part of the first line: motif D1; The red part of the second line: motif A; The green part of the third line: motif B; The pink part of the fourth line: motif C; The blue part: motif H; The yellow part of the fifth line: motif E; The grass green part of the penultimate line: motif F |
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将314-6-11蛋白(ASU06811.1)的氨基酸序列、MFS外排泵相关的氨基酸序列以及已报道的替加环素耐药基因编码的氨基酸序列用ClustalW软件进行多序列比对，将比对结果用MEGA 5.10软件构建系统进化树，如图 4所示。选取的氨基酸序列有：与AcrAB外排泵过表达有关的ramA基因编码蛋白(ADA62491.1)、局部调节蛋白AcrR (WP_015571247.1)和全局调节蛋白SoxS (NP_418486.1)的氨基酸序列；与AdeABC外排泵过表达有关的调节蛋白AdeR (WP_033917517.1)和AdeS (WP_043041662.1)的氨基酸序列；编码SAM依赖性甲基转移酶的trm基因编码蛋白(AOR52433.1)的氨基酸序列；四环素抗性核糖体保护蛋白Tet (M) (WP_060470565.1)的氨基酸序列；rpsJ基因编码的核糖体S10蛋白(NP_417780.1)的氨基酸序列；四环素钝化酶Tet (X) (M37699.1)以及其变体Tet (X3) (MK134375.1)、Tet (X4) (MK134376.1)和Tet (X5) (CP040912.1)的氨基酸序列等。
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| 图 4 314-6-11蛋白及已知替加环素耐药蛋白的氨基酸序列的系统进化树 Figure 4 A phylogenetic tree of the amino acid sequences of 314-6-11 protein and the reported tigecycline resistance protein 注：分支处数值表示Bootstrap值；括号内表示氨基酸序列在GenBank中的登录号；标尺表示进化距离 Note: Numbers at branch nodes represent bootstrap value; The GenBank accession number of amino acid sequences are shown in the brackets; Bar (0.01) represents sequence divergence |
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利用NCBI数据库对314-6-11蛋白的氨基酸序列与上述所选择的氨基酸序列进行BLASTp比对后发现，314-6-11蛋白与Actinocorallia herbida来源的MFS转运蛋白的相似性最高，达到91.44%，与Streptomyces lasaliensis、Nocardioides lianchengensis、Streptomyces sp. HB202和Nocardioides sp. CF479来源的MFS转运蛋白的相似性较高，分别为90.4%、88.54%、84.66%和83.05%，与Streptomyces来源的四环素抗性MFS外排泵的相似性为84.66%，与肺炎克雷伯菌来源tetA基因编码的蛋白相似性为55.56%。但是，314-6-11蛋白与图 4所示其他替加环素耐药基因编码蛋白的氨基酸序列的比对结果为“未发现重大相似性(No Significant Similarity Found)”，而与AcrAB外排泵过表达有关的ramA基因编码蛋白和其全局调节蛋白SoxS的相似性为45%，Tet (X)与Tet (X3)的相似性为85.57%，Tet (X3)、Tet (X4)、Tet (X5)之间的相似性为89.62%−91.78%。AcrAB外排泵的过表达会引起肠杆菌科细菌对替加环素产生耐药性，Tet (X)及其变异型也会导致菌株对替加环素产生耐药性，并且是由不同机制引发的，但是314-6-11蛋白与这些不同的引发替加环素耐药的蛋白相似性较低，甚至未发现重大相似性。结合图 4系统进化树分析，314-6-11蛋白与Actinocorallia herbida、Streptomyces lasaliensis、Nocardioides lianchengensis来源的MFS转运蛋白还有Streptomyces来源的四环素抗性MFS外排泵处于同一分支且相似性较高，说明314-6-11蛋白与大部分MFS外排泵的进化距离较近；与Acinetobacter baumannii来源的Tet (X3)、trm编码蛋白以及大肠杆菌来源的Tet (X4)等已报道的替加环素耐药基因的编码蛋白处于不同的分支，进化距离较远，而且未发现重大相似性。推测某些MFS外排泵属于另一类介导替加环素耐药蛋白。
2.3 最低抑菌浓度的测定和外排泵抑制剂的抑制实验最低抑菌浓度的测定结果如表 1所示，根据EUCAST的判定结果，菌株对替加环素的MIC > 0.5 μg/mL判定其对替加环素产生耐药性，314-6-11菌株对替加环素的MIC高达16 μg/mL，则其对替加环素产生耐药性。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institude，CLSI)文件[30]的判定结果，菌株对四环素的MIC≥16 μg/mL判定其对四环素产生耐药性，314-6-11菌株对四环素的MIC为32 μg/mL，其对四环素产生耐药性，所以推测其对四环素类抗生素均产生耐药性。因此特选取第二代四环素——米诺环素与多西环素作为代表药物进行MIC的测定。根据CLSI文件的判定结果，菌株对米诺环素或多西环素的MIC≥16 μg/mL，判定其对米诺环素或多西环素产生耐药性，314-6-11菌株对米诺环素和多西环素的MIC为8 μg/mL (< 16 μg/mL)，但是与对照菌株对米诺环素和多西环素的MIC比较，若比值≥4或以上，也判定314-6-11菌株对米诺环素和多西环素产生耐药性。除此之外，314-6-11菌株对环丙沙星、妥布霉素、阿莫西林、庆大霉素、萘啶酮酸的MIC测定结果显示，314-6-11菌株对这5种抗生素敏感。因此推测携带这个四环素抗性MFS外排泵基因的菌株只对四环素类抗生素耐药。
| Item | ATCC 25922 | E. coli EPI100 | pWEB-TNC vector | 314-6-11 |
| TGC | 0.03−0.25 | ≤0.25 | ≤0.25 | 16.0 |
| TGC+CCCP 5 (μg/mL) | < 0.25 | < 0.25 | ≤0.25 | < 0.25 |
| TGC+CCCP 4 (μg/mL) | < 0.25 | < 0.25 | ≤0.25 | 4.0 |
| TET | 0.5−2.0 | 2.0 | 1.0 | 32.0 |
| TET+CCCP 5 (μg/mL) | 1.0 | < 1.0 | 1.0 | < 1.0 |
| TET+CCCP 4 (μg/mL) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| DOX | 0.5−2.0 | 1.0 | 2.0 | 8.0 |
| DOX+CCCP 5 (μg/mL) | 1.0 | < 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| DOX+CCCP 4 (μg/mL) | 1.0 | < 1.0 | ≤1.0 | 2.0 |
| MIN | 0.25−1.0 | 0.5 | 2.0 | 8.0 |
| MIN+CCCP 5 (μg/mL) | 0.5 | < 0.5 | < 0.5 | < 0.5 |
| MIN+CCCP 4 (μg/mL) | 1.0 | 0.5 | 2.0 | 2.0 |
| 注：TGC：Tigecycline；TET：Tetracycline；DOX：Doxycycline；MIN：Minocycline Note: TGC: Tigecycline; TET: Tetracycline; DOX: Doxycycline; MIN: Minocycline | ||||
除此之外，还进行了外排泵抑制剂CCCP分别抑制替加环素、多西环素、米诺环素和四环素的实验，并观察CCCP加入前后菌株MIC的变化情况，均做了2次重复实验。实验结果如表 1所示：当CCCP浓度为4 μg/mL时，314-6-11菌株对替加环素、米诺环素、多西环素的MIC值降到1/4，对四环素的MIC值降到1/4以下；当CCCP浓度为5 μg/mL时，314-6-11菌株对替加环素、米诺环素、多西环素和四环素的MIC值均降到1/4以下，表明4 μg/mL及以上浓度的CCCP可以抑制外排泵对这几种抗生素的外排作用。
3 讨论与结论自从在临床上发现替加环素耐药菌以来，科学家们逐渐开始了对其耐药机制的研究，研究大多集中在革兰氏阴性菌中，多见于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌。但是细菌对替加环素的耐药机制十分复杂，至今尚无充足的研究可以阐明，通过查阅文献，发现主要有以下3类耐药机制：(1) 外排泵的过表达。研究比较多的是AcrAB外排泵和AdeABC外排泵。AcrAB外排泵广泛存在于肠杆菌科细菌中，其受全局调节蛋白MarA-SoxS-Rob系统和局部调节蛋白AcrR的调控[31-32]，研究发现其过表达可以导致肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)[13, 33]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[34]以及其他肠杆菌科细菌如阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等[14]对替加环素耐药。AdeABC外排泵主要存在于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)中，受双组分调节系统AdeRS调节[35]，研究发现，在adeS基因前插入序列ISs或者是adeR和adeS基因的点突变介导替加环素耐药，会影响adeB或者adeJ基因的表达，进一步导致adeABC的过表达，从而使鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)对替加环素耐药[17, 36]。(2) 编码1-酰基-3-丙三醇磷酸酰基转移酶的plsC基因[37]、编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基转移酶的trm基因[38]、编码核糖体S10蛋白的rpsJ基因[21]也和替加环素耐药有关，前者在细菌外膜主要成分合成中起着重要作用，其突变会导致菌株膜通透性的改变，进而引起替加环素耐药；后两者的突变会降低细菌对替加环素的敏感性。(3) 近几年还发现了四环素钝化酶Tet (X)[22]及其变异型Tet (X3)[23]、Tet (X4)[23]、Tet (X5)[24]介导替加环素的抗性。
本实验室先前构建好的土壤宏基因组文库的采样地点是云南树林土壤，海拔2 100 m，采样处没有抗生素的使用情况，在这种情况下筛选得到一个对替加环素耐药(MIC值16 μg/mL)的亚克隆314-6-11，证实了功能宏基因组学技术在挖掘抗生素耐药基因的可行性，也给近十几年科学家们研究发现的耐药基因起源于土壤[39-42]提供借鉴。此前关于大肠埃希菌中替加环素耐药的相关报道并不是很多，并且在没有抗生素筛选压力的土壤中挖掘替加环素耐药基因的研究更少，采用功能宏基因组学方法有助于挖掘土壤中新的抗生素耐药基因和发现新的耐药机制，有助于在耐药基因传递到临床前给人以预警。
对314-6-11基因进行BLASTx比对发现，其编码蛋白属于四环素抗性MFS外排泵，推测314-6-11菌株也具有四环素抗性，对其进行最低抑菌浓度实验发现同时具有四环素、米诺环素、多西环素和替加环素抗性，但是对其他种类抗生素无抗性，推测有些四环素抗性MFS外排泵只对四环素类抗生素有作用；接着进一步进行生物信息学分析，跨膜区结果表明314-6-11蛋白含有14个跨膜区域，属于14次跨膜螺旋MFS外排泵；系统进化分析表明其与其他介导替加环素耐药基因的编码蛋白亲缘关系较远，属于另一类介导替加环素耐药的蛋白，可为替加环素耐药机制的研究提供借鉴；使用MFS外排泵抑制剂CCCP抑制外排泵的过表达，发现当CCCP浓度为4 μg/mL时能够降低细菌对四环素类抗生素的MIC值，抑制细菌耐药。
MFS属于五大主动外排系统中的一大类[43]，分布广泛，在细菌、古生菌和真核生物中[44-45]均存在，通常通过膜融合蛋白与外膜蛋白组成三联复合体，从而形成一个连续的通道，排出包括抗菌药物在内的各种有毒化合物。膜融合蛋白一般通过一个跨膜域或者一个N端脂质组固定在内膜处[46]。MFS蛋白多由400−450个氨基酸残基组成，含有12个或者14个跨膜的α-螺旋结构，跨膜区有大量高度保守的氨基酸序列，这些序列在结构维持和功能发挥上起重要作用[47]。本研究对314-6-11蛋白的保守结构域分析表明其含有典型的14次跨膜螺旋MFS外排泵保守结构域A (GxLaDrxGrkxx(x)1)、B (1xxxRxxqGxgaa)、C (gxxxGPxxGGx1)、D1 (1DxTvxnvAlP)、E (DxxGxxL)、F (1gxxxGxavxgx1)、H (WxwxF11NvPig)，括号中表示的是保守结构域序列，大写字母表示的是出现在70%以上比对序列的氨基酸，小写字母表示的是出现在40%左右比对序列的氨基酸，小写字母x表示任意氨基酸，(x)表示的是不常见的氨基酸。其中，保守结构域A位于第2跨膜结构和第3跨膜结构之间，含有β-turn结构，可能与运输通道的开启和关闭所需的可逆构象变化有关；保守结构域B位于第4跨膜结构，可能与质子转移有关。此外，在多重耐药转运蛋白以及特殊的药物外排泵中均发现的保守结构域C处在第5跨膜结构，可能决定了药物运输的方向；保守结构域F位于C端，含有保守结构域C的重复序列，推测其功能可能与保守结构域C类似[28, 48-50]，这些保守结构域的存在给带电荷药物的结合、运输以及质子转移带来了巨大好处。要想更准确地了解314-6-11蛋白的功能机制需要进行结构生物学分析，但是由于膜转运蛋白处于高度运动状态，加上现有实验条件的限制，科学家们只获得了极少数MFS蛋白成员的晶体结构[51]，而且绝大多数分辨率都较低，要想深入了解转运机制和功能需要获得分辨率更高的结构，这成为了研究的难点和热点。
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