布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)感染所致的全球性人畜共患传染性疾病。1886年，David Bruce从马耳他地区死亡士兵体内分离获取了布鲁氏菌^[1]。布鲁氏菌病缺乏特异的临床表现，常见临床表现包括发热、寒战、乏力、关节、肌肉、腰背部游走性疼痛等，可伴有肝、脾、淋巴结肿大。布鲁氏菌可侵犯宿主多个系统；由于临床表现各异，该病易由急性感染转为慢性感染^[2]。目前全球170多个国家报道了布鲁氏菌病。对于人布鲁氏菌病暂无非常有效的疫苗，动物布鲁菌病疫苗的安全性和有效性仍存在不足之处，需要进一步改良或优化。我们的实验研究结果显示，呼和浩特地区分离的人源布鲁氏菌主要为羊种1型和3型，毒力基因分布特征相近，部分克隆株存在流行趋势，流行机制值得进一步探究^[3]。

1 病原学特征

布鲁氏菌为革兰氏阴性杆菌，无荚膜、鞭毛，不释放外毒素，为兼性胞内寄生菌。从20世纪60年代至今已发现布鲁氏菌属分为12个种25个生物型，人类对各种属普遍易感，其中羊布鲁氏菌(3个生物型)致病性最强，猪布鲁氏菌(5个生物型)感染后有化脓倾向，牛布鲁氏菌(8个生物型)致病性较弱^[4]。布鲁氏菌有特殊的细胞膜结构，主要包括脂多糖、外膜蛋白和脂质蛋白等^[5]。

2 主要毒力因子

布鲁氏菌的毒力因子主要包括脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、Ⅳ型分泌系统(Type Four Secretion Systems，T4SS)、外膜蛋白(Outer Membane Proteins，OMP)、双组分调控系统(Two-Component System，TCS)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)等^[6]。

2.1 脂多糖

LPS是革兰氏阴性菌细胞膜的主要成分之一，也是其内毒素的主要成分。由于布鲁氏菌LPS免疫原性较弱，激活补体途径和B细胞的能力较弱，从而使布鲁氏菌激活宿主产生较弱的免疫反应，使其能顺利侵入靶细胞并存活、繁殖^[7]。LPS突变布鲁氏菌株对补体杀伤和多粘菌素B敏感性明显增加^[8]。LPS的结构包括核心多糖、O多糖和类脂A。与常见肠道菌群的典型LPS比较，布鲁氏菌LPS表现出较低的活性和毒性^[7]。布鲁氏菌没有典型LPS，如流产布鲁氏菌类脂A具有二氨基葡萄糖主链(而不是氨基葡萄糖)，酰基长(C18−C19而不是C12−C14)，仅通过酰胺键而不是酯酰胺键与核心多糖相连^[9]，由于非典型的结构使布鲁氏菌LPS成为一种特殊的毒力因子。由于布鲁氏菌病原相关分子模式缺乏特异性，使布鲁氏菌病原相关分子模式无法被模式识别受体识别，进而使宿主的免疫应答减弱^[10]。布鲁氏菌的LPS有2种形式：光滑型(Smooth，S型)和粗糙型(Rough，R型)，R型没有O侧链或者O侧链含量少；布鲁氏菌的R型比S型毒力弱，逃避机体免疫系统的能力较弱^[11]。布鲁氏菌侵入宿主细胞的早期阶段，S型LPS发挥关键作用。据推测，S型LPS与巨噬细胞表面脂筏相互作用，通过一种特殊途径侵入宿主细胞，并能躲避溶酶体融合^[7]。在布鲁氏菌侵入宿主细胞和早期生存中，S型LPS及其O侧链起重要作用^[12]，布鲁氏菌侵入宿主后，布鲁氏菌在前期酸性环境中形成囊泡，称为布氏小体(Brucella-Containing Vacuole，BCV)，成为布鲁氏菌相对安全的生存环境；布鲁氏菌O多糖与肿瘤坏死因子相互作用影响宿主细胞凋亡，因此，坏死细胞不会释放特殊因子来激活宿主免疫系统，使布鲁氏菌逃避免疫系统监测^[13]。

2.2 Ⅳ型分泌系统

T4SS是布鲁氏菌重要的毒力因子，并在毒力因子分泌过程中发挥重要作用。T4SS是由VirB操纵子编码的一种多蛋白复合物家族^[14]。VirB1−VirB12蛋白参与布鲁氏菌囊泡的发育，布鲁氏菌侵入和寄生宿主细胞内往往利用T4SS^[15]；T4SS的核心部分由VirB7、VirB8和VirB10相互作用构成，T4SS作为横跨细菌外膜和内膜的通道；VirB蛋白通过分泌毒力效应蛋白至宿主细胞内，干扰正常细胞内信号传导，进而使病原体逃避免疫监测^[16]。VirB操纵子会依据环境的变化激活T4SS的转录；宿主胞内酸化是诱导VirB操纵子的重要信号，表明T4SS是布鲁氏菌感染早期酸性环境下所激活的；T4SS在胞内转运中起重要作用，参与调节布鲁氏菌从吞噬体到内质网的转运，VirB缺失突变体不能与内质网相互作用，进而被溶酶体消灭^[17]。可见VirB参与阻止吞噬体和溶酶体相互融合，有利于布鲁氏菌在宿主胞内存活。BCV与内质网(Endoplasmic Reticulum，ER)互相融合，形成一种与内质网相关的特殊细胞器^[18]，有利于布鲁氏菌在宿主细胞内繁殖；VirB突变体不能获得与ER融合的标志物，所以在吞噬体被溶解^[19]。T4SS和一种宿主细胞因子Sar1有利于布鲁氏菌获取ER膜，具体机理不详。T4SS除了参与BCV的胞内转运，还参与宿主的免疫应答，并且影响细菌的外膜特性^[20]。

2.3 外膜蛋白

OMP是布鲁氏菌重要的毒力因子，同时在免疫性和保护性抗原方面发挥作用^[21]。20世纪80年代发现了布鲁氏菌OMP，根据大小分为3组^[22]：(1) 外膜蛋白与布鲁氏菌细胞膜的构成有关，在结构稳定性方面具有重要作用，包括OMP10、OMP19蛋白；(2) 外膜蛋白与布鲁氏菌的膜孔有关，参与营养物质运输，主要是指OMP2蛋白；(3) 外膜蛋白主要参与构成布鲁氏菌外膜结构，主要是指OMP25、OMP31。OMP25和OMP31有利于维持布鲁氏菌抗原和细胞结构完整性^[23]，有一定的免疫原性和抗原保护作用；OMP31与布鲁氏菌摄取铁密切相关^[24]。OMP25在布鲁氏菌结构、感染和致病过程中发挥重要作用；同时，OMP25参与布鲁氏菌激活人绒毛膜滋养层细胞(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信号通路，利于其在宿主细胞中的存活^[25]。研究表明，OMP10或OMP19基因缺失突变使布鲁氏菌毒力减弱，外膜结构发生改变；在布鲁氏菌的不同物种、生物型中OMP25基因高度保守，可见OMP25与布鲁氏菌在宿主细胞内存活、复制中扮演重要角色；OMP25基因缺失突变体感染小鼠的毒力明显减弱，证明OMP25与布鲁氏菌的毒力密切相关；此外，OMP25蛋白还能够抑制宿主机体对TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)的分泌，有利于布鲁氏菌的胞内存活^[26]。

2.4 双组分调控系统

TCS主要参与调控布鲁氏菌感知和处理环境信号，是重要的毒力调控系统，在稳定细胞内环境中必不可少^[27]。其组成包括组氨酸激酶传感器(BvrS)和细胞质反应调节因子(BvrR)，BvrR主要参与调控布鲁氏菌外膜稳态；该系统由组氨酸蛋白激酶(Histidine Protein Kinase，HK)和反应调控蛋白(Response Regulatory Protein，RR)组成^[28]。布鲁氏菌在酸性和营养限制条件下会激活TCS，通过BvrR的磷酸化，使BvrR激活^[29]。HK蛋白的组氨酸残基发生磷酸化，然后将磷酸基团传递给RR蛋白的天冬氨酸残基，进而激活RR蛋白，激活的RR蛋白具有调控靶基因表达的功能；RR蛋白调控的靶基因在细菌的代谢、分裂、运输等过程中发挥重要作用；TCS调控了细菌生存繁殖相关的多个过程，有利于细菌的生存；BvrR/BvrS可影响OMP25和OMP22等蛋白质的表达，并影响LPS的结构(特别是类脂A的脂肪酸)^[30]。实验证实BvrR/BvrS系统在多种布鲁氏菌中是高度保守的，与其毒力密切相关；布鲁氏菌BvrR/BvrS突变株感染靶细胞的能力减弱，使吞噬体与溶酶体融合的能力增强^[31]。此外，BvrR/BvrS还影响VirB操纵子及其转录因子VjbR的表达水平，BvrR/BvrS在与宿主细胞相互作用的前期被激活；实验证明BvrR-P/VjbR/VirB毒力通路在体外激活，使布鲁氏菌摆脱了巴伐洛霉素的抑制作用，证明BvrR-P/VjbR/VirB毒力通路与布鲁氏菌在宿主细胞内存活和繁殖密切相关^[32]。总之，布鲁氏菌通过BvrR/BvrS感知并调节从细胞外到细胞内的环境变化，从而使布鲁氏菌顺利到达复制位。

2.5 环β-1, 2葡聚糖(Cyclic β-1, 2-Glucans，CβG)

胞质渗透调节葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucans，OPGs)是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分，共有4个家族。OPGs缺乏突变株会使病原体的趋化性、运动能力发生变化，使细胞膜的稳定性降低；然而布鲁氏菌的CβG属于OPG第2家族，缺失CβG突变布鲁氏菌株在早期吞噬体中被溶酶体消灭^[33]。布鲁氏菌CβG通过脂筏与宿主细胞膜相互作用，可防止BCV被溶酶体融合，利用一种新的胞内转运途径进一步与内质网相互作用，营造细菌繁殖的特殊环境^[34]。表明布鲁氏菌的CβG与毒力因子相关。

2.6 应激反应蛋白

吞噬细胞内环境不利于大部分病原体的存活，它们为了适应巨噬细胞内恶劣环境而选择性诱导了很多应激反应蛋白。目前发现，在布鲁氏菌中重要的应激反应蛋白包括胞质蛋白分子伴侣、周质蛋白酶、超氧化物歧化酶、重组调节蛋白等。其中，SOD与布鲁氏菌毒力密切相关^[35]。目前已发现有3种SOD，即铜、锌、铁超氧化物歧化酶(Cu，Zn，Fe，Superoxide Dismutases，Cu-SOD、Zn-SOD和Fe-SOD)，在细菌中Cu-SOD、Fe-SOD多见，但Zn-SOD少见，而布鲁氏菌具有Zn-SOD^[36]。实验证明，宿主细胞限制布鲁氏菌胞内复制的机制中活性氧中间体(Reactive Oxygen Intermediate，ROIs)起关键作用^[37]。很多病原体在抵御ROIs的损害方面都有特殊机制，如利用过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等直接解毒的酶。SOD可催化超氧化物(O₂^–)分解为过氧化氢(H₂O₂)和氧气(O₂)；在羊和猪布鲁氏菌中发现了2个编码SOD的基因，Fe-Gu协同SOD可在氧代谢中发挥解毒作用，而Gu-Zn协同的SOD在巨噬细胞呼吸暴发中具有保护作用；布鲁氏菌Gu-Zn超氧化物歧化酶突变株对小鼠具有减毒作用^[38]。

2.7 密度感应系统(Quorum Sensing SystemQSs)

QSs通过依赖细胞密度来进行细胞间信号传递，通过该系统细菌可以产生毒力因子、适应环境等。QSs作为总体调控系统，参与很多基因的表达，例如GntR、VjbR等转录调控子的表达^[39-40]。布鲁氏菌中也有QSs。研究表明，QSs参与调控VirB的表达，是布鲁氏菌重要的毒力基因调控子。TCS调控细菌个体与环境的关系，而QSs可从整体水平调控细菌。目前发现的VjbR和BlxR这2个转录调控子与QSs相关，并且与布鲁氏菌毒力密切相关。

3 逃避宿主免疫反应

布鲁氏菌以“隐形”模式感染宿主机体，即：可以干扰免疫系统，然后逃避宿主细胞免疫监测，最终导致长期感染^[41]。布鲁氏菌利用特殊策略可抵抗和逃避吞噬细胞的杀伤作用，并能调节宿主免疫应答。布鲁氏菌的致病机制关键在于能够在专职吞噬细胞中存活、复制和持续性感染^[42]。侵入宿主细胞后布鲁氏菌能够驻留在BCV中，成为布鲁氏菌安全的复制环境，从而避免吞噬体与溶酶体融合；后期BCV通过多种策略转运到达内质网后，布鲁氏菌在内质网的保护下可以逃避宿主免疫系统的监测和吞噬细胞的有效杀灭，从而在内质网提供的安全复制环境中长期存活；当病原体感染宿主时，机体能够迅速发现入侵的病原体，并诱导初始炎症反应来控制疾病；宿主先天免疫系统通过不同病原体的病原相关分子模式进行识别，在宿主细胞上有不同的受体，包括细胞膜样受体(TLRs)或胞浆样受体(NLRs)，这些受体具有检测细菌特有产物的能力，例如LPS、OMP等；布鲁氏菌利用特殊机制逃避TLRs和NLRs的检测，在胞内持续感染^[10]。此外，LPS的非典型结构也限制了TLR4的识别。布鲁氏菌LPS具有抵抗补体C3聚集作用，从而阻止C3a和C5a的产生；研究表明，布鲁氏菌鞭毛素缺乏受体识别过程中重要的结构域，所以能够逃避TLR5的检测；TLR4、TLR2和TLR9均参与了布鲁氏菌的感染^[43]。布鲁氏菌基因组编码了一种含有Toll-白介素-1受体(TIR)的蛋白，即Btp1/BtpA和TcpB；TLR2和TLR4需要BtpA/TcpB降解MyD88适配器；BtpA/TcpB能够抑制树突状细胞的成熟和促炎细胞因子的产生，从而使布鲁氏菌持续感染；布鲁氏菌效应蛋白BtpB比BtpA具有更强的TLR信号拮抗剂活性，同时干扰MyD88依赖的信号转导；同时，布鲁氏菌T4SS、CβG和主要外膜蛋白影响树突状细胞成熟及抗原递呈^[44]。

4 毒力因子在布鲁菌检测及治疗药物研发中的应用

在布鲁氏菌病的检测和治疗中，诊断方法和疫苗发挥着重要作用。布鲁氏菌的外膜蛋白即是毒力因子，也可作为布病血清学诊断中重要工具。由于布鲁氏菌缺乏经典毒力因子，相关免疫蛋白、细胞成分可能成为检测布鲁氏菌和相关疫苗研发的重要物质。布鲁氏菌VirB12蛋白是一种细胞表面蛋白，能在动物感染过程中诱导产生抗体，可作为血清学诊断的潜在靶点。研究表明重组VirB12蛋白与布鲁氏菌患者血清有较强的免疫反应，与目前临床使用的ELISA试剂盒相关，VirB12蛋白参与的ELISA检测的准确性、特异性、敏感性、阴性预测值和阳性预测值分别为90.0%、94.0%、87.8%、80.0%和96.6%，表明VirB12蛋白具有抗原性，可用于人布病诊断的候选靶点^[45]。通过研究具有诊断意义的膜蛋白，有望为布鲁氏菌病提供敏感、特异的诊断方法。其中，重组牛种布鲁氏菌544苹果酸脱氢酶蛋白在牛种布鲁氏菌病血清学诊断中具有潜在的应用价值^[46]。用重组外膜蛋白2b (OMP2b)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn Superoxide Dismutases，Cu-Zn SOD)分别作用小鼠后，小鼠的IgG、IFN-y和IL-4水平明显增加，而OMP2b免疫小鼠产生的IgG和IgM明显高于SODC^[47]。这2种蛋白可能具有潜在的无脂多糖蛋白的诊断价值。OMP25是布鲁菌重要毒力因子，在激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路过程中起重要作用^[28]。实验结果显示，布鲁氏菌分离株对WHO推荐的治疗布鲁氏菌病的抗菌药物体外实验普遍敏感；定期评估布鲁氏菌对抗菌药物的敏感性有助于进行流行病学调查及抗菌药物耐药性监测^[48]。敏感性和特异性高的诊断方法将有助于布鲁氏菌病的早期诊断及治疗。

5 总结与展望

布鲁氏菌主要利用其毒力因子在宿主细胞内生存和繁殖。布鲁氏菌具有特殊的策略，能在宿主细胞内持续感染。感染宿主早期，布鲁氏菌通过逃避机体的免疫应答，进入宿主靶向细胞，在胞内改变自身膜结构来适应恶劣环境、避免被溶酶体融合，存活的布鲁氏菌在胞内运输到内质网进行繁殖。宿主细胞内酸性环境、营养限制等环境可以刺激布鲁氏菌毒力相关基因，使其在胞内顺利运输，并使宿主细胞失去抗原提呈能力，抵抗宿主细胞凋亡。布鲁氏菌毒力因子在感染机体过程中相互协同，但目前对毒力因子如何使机体致病机制的研究尚有不足，随着分子学、基因组学的不断发展，有望发现新的毒力因子、毒力基因，可为布鲁氏菌病的早期诊断和新型疫苗的研发提供新的思路。