2021, Vol. 48扩展功能
文章信息
- 邓斐, 祁贤, 余慧燕, 王慎骄, 黄昊頔, 许可, 鲍倡俊
- DENG Fei, QI Xian, YU Huiyan, WANG Shenjiao, HUANG Haodi, XU Ke, BAO Changjun
- 2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析
- Molecular characteristic of the hemagglutinin of highly pathogenic avian influenza A H5N6 viruses in live-poultry market, 2017–2019, Southern China
- 微生物学通报, 2021, 48(2): 516-523
- Microbiology China, 2021, 48(2): 516-523
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200452
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文章历史
- 收稿日期: 2020-05-10
- 接受日期: 2020-07-24
- 网络首发日期: 2020-10-20
流感病毒分类上归属于正粘病毒科，包括甲、乙、丙、丁4个属[1]。与乙型、丙型和丁型流感不同，甲型流感病毒有多个血清型，能感染人和多种动物，是威胁人类和动物健康的重要病原。血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是甲型流感病毒的2个糖蛋白，位于病毒粒子的囊膜上[1-3]。HA和NA是流感病毒血清型分类的主要依据，已经在自然界中鉴定了18种HA亚型和11种NA亚型，除了存在于蝙蝠中的H17N10和H18N11亚型外，其他亚型(H1-16、N1-9)病毒的自然宿主主要是野生水禽(主要涉及雁形目和鸻形目)[1-2]。自然状态下，流感病毒通常很少外溢跨物种传播，禽流感病毒跨种感染人的事件很少发生[3]。1997年香港禽流感感染人事件发生以来，人感染禽流感病毒的病例时有发生，禽流感病毒逐渐成为重要的人兽共患病原体[4]。已有文献报道人感染的禽流感病毒有多个亚型，包括H5Ny (y=1，6)、H9N2、H7Ny (y=2，3，7，9)、H4N8、H6N1和H10Ny (y=7，8)等[5-6]。
根据禽流感病毒对鸡的健康危害程度，学界将禽流感病毒分为2种致病类型，包括低致病性禽流感病毒(Low Pathogenic Avian Influenza Virus，LPAI)和高致病性禽流感病毒(Highly Pathogenic Avian Influenza Virus，HPAI)[3-4]。HPAI病毒主要在H5和H7亚型中被发现，是由LPAI病毒在HA蛋白裂解位点插入多个碱性氨基酸突变而来[3]。1996年东亚首株HPAI H5N1病毒在我国广东的发病鹅群中被分离到，被命名为A/Goose/Guangdong/1/1996 (Gs/GD)[4]。目前Gs/GD后代病毒已经在全球许多地方流行，包括欧亚、非洲和北美，对全球的公共卫生和动物健康构成了严重威胁[7]。通过分析H5亚型Gs/GD及其子代病毒HA基因在全球的分子进化，WHO/FAO/ OIE等国际组织的相关专家团队绘制了10个主干进化系，包括Clade 0和Clade 1-9，其中部分主干进化系又进一步分出多个亚系[8]。2008年，在我国家禽中发现Clade 2.3.4.4 H5Ny (y=1，2，5，6，8)病毒的出现[7]。随着病毒的持续进化，从2014年开始，H5N6亚型病毒逐渐取代H5N1病毒成为我国家禽和活禽市场中流行的主要病毒[9-11]。
本研究在活禽市场禽流感监测的基础上，对2017-2019年间中国南方地区93株H5N6禽流感病毒HA基因的分子特性进行分析，以期在了解病毒进化规律的基础上制定合理的防控措施。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器H5N1亚型流感病毒核酸分型检测试剂盒，江苏硕世生物科技股份有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司；SuperScript® III First-Strand Synthesis System和High Pure PCR Product Purification Kit，Invitrogen公司；Nextera XT DNA Sample Preparation Kit，Illumina公司。Illumina MiSeq平台，Illumina公司；荧光定量PCR仪，ABI公司。
1.2 标本2017年1月-2019年9月，江苏省13地级市CDC流感监测网络实验室收集到活禽市场标本共计17 050份。通过荧光定量PCR技术对标本进行甲型流感病毒及H5、H7和H9亚型分型检测。所有甲型流感病毒核酸阳性标本送到本实验室进行复核和病毒分离。
1.3 病毒分离将H5亚型阳性标本，接种9-11日龄的无特定病原体(Specific Pathogen-Free，SPF)鸡胚尿囊腔。每个标本接种3个鸡胚，每个鸡胚接种标本200 μL。在37 ℃条件下培养，每天观察鸡胚生长情况，72 h收获鸡胚尿囊液。病毒分离工作都在江苏省疾控中心生物安全三级实验室里完成。
1.4 病毒基因组测序病毒基因组RNA的提取按照核酸提取试剂盒操作流程进行。采用以病毒RNA为模板扩增单链cDNA，反转录引物采用甲型流感病毒基因组扩增通用引物U12 (5′-AGCAAAAGCAGG-3′)[12]，反应体系采用单链合成试剂盒。以U12为引物、以病毒8个RNA节段为模板进行反转录PCR扩增，PCR反应条件见文献[12]，采用试剂盒纯化PCR产物。测序文库的构建采用Illumina公司的试剂盒，把800 μL测序文库混合样加到测序平台的样品孔中，按照说明书完成基因测序，测序数据处理分析采用CLC Genomics Workbench (CLC Bio)程序软件。
1.5 进化分析从NCBI和GISAID网站上下载到71株中国其他研究团队上传的H5N6病毒分离株HA序列，这些毒株分离自环境、禽类和人。其他参考株序列分别来自NCBI和GISAID网站，其中，Clade 2.3.4.4的7个毒株被WHO列为H5流感病毒候选疫苗毒株，包括A/Sichuan/26221/2014 (H5N6)、A/gyrfalcon/ Washington/41088-6/2014 (H5N8)、A/duck/Hyogo/ 1/2016 (H5N6)、A/Guangdong/18SF020/2018 (H5N6)、A/chicken/Vietnam/NCVD-15A59/2015 (H5N6)、A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 (H5N6)和A/Hubei/ 29578/2016 (H5N6)。核苷酸和氨基酸序列同源性分析采用MegAlign Program软件(DNAStar)进行。运用ClustalX 1.83法进行序列排列比对，Maximum Likelihood法进行基因进化树分析(MEGA 6.1)[13]。
2 结果与分析 2.1 江苏省活禽市场禽流感病毒流行情况2017年1月–2019年9月，本实验室收集到来自江苏省活禽市场甲型流感病毒核酸检测阳性标本，通过荧光定量PCR进行H5、H7和H9亚型分型检测，其中H9亚型1 662份(9.7%)、H5亚型189份(1.1%)、H7亚型541份(3.1%)。H7亚型病毒的检出主要集中在2017年1月-2017年6月(50株)，2018年1-12月份共检测出15份，从2019年2-9月，没有H7病毒检出。自2017年7月，H9和H5亚型成为江苏省活禽市场流行的主要亚型病毒。此外，2018年江苏省发生一起长三角地区首例人感染H5N6死亡病例。
2.2 病毒分离和序列测定从189份H5亚型禽类/环境标本和一名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒。按照标本采集的时间和地点，对其中有代表性的33株病毒(包括1株人分离株)进行全基因组测序并上传GISAID网站。本研究首先对33株病毒进行初步序列分析，如果有些毒株序列相似性高达99.9%-100%，基因进化树分析遗传关系较近，则只选择1个代表序列。根据这个原则，对最终选出的22株序列进行HA分子特性分析。通过NCBI和GASAID网站的在线软件BLASTn对病毒的8个基因片段序列进行相似性分析，结果表明22株分离株与H5亚型的HA片段高度相似(99%)，初步判定属于H5亚型。此外，22株分离病毒HA片段的核苷酸相似性为99.1%–99.5%。
2.3 HA基因系统发生分析鉴于H5N6病毒在全球的传播和快速进化，2019年WHO等国际组织对2.3.4.4 H5Nx病毒HA基因的分子进化进行分析，命名了8个Sub-Clade (2.3.4.4a–2.3.4.4h)。本研究对2017–2019年中国南方地区93株H5N6病毒(包括本实验室分离测序的22株)的HA基因进行系统进化分析(图 1)，其中93株H5N6病毒有78株属于2.3.4.4h，进一步分为4个亚系：h1 (1株)、h2 (6株)、h3 (7株)和h4 (64株)。此外，9株病毒属于2.3.4.4e，4株H5N6病毒属于2.3.4.4b，1株分离自湖南某环境的H5N6病毒属于2.3.4.4f，1株从江西鸵鸟体内分离的H5N6病毒属于2.3.4.4g。结果表明，2017-2019年间，中国流行的H5N6禽流感病毒主要属于Clade 2.3.4.4h，同时也存在其他一些亚系的散在流行。
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| 图 1 2017-2019年中国南方H5N6禽流感病毒HA基因进化树 Figure 1 Phylogenetic analysis of HA genes of H5N6 viruses, 2017–2019, Southern China 注：●：2017-2019年江苏分离株；▲：2017-2019从网上下载的除江苏外的H5N6毒株 Note: ●: The H5N6 viruses from Jiangsu, 2017-2019; ▲: The H5N6 viruses from the other regions except for Jiangsu, 2017-2019 |
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多个碱性氨基酸出现在所有93株病毒HA蛋白的裂解位点处，这是高致病性禽流感病毒的分子标记。此外，93株分离病毒的HA裂解位点氨基酸的构成表现为一定的多态性，具有3种构成方式，其中89株是RERRRKR↓G，3株病毒(EV/ Changzhou/088/2017，EV/Fujiansanyuan/08/2017和Fujiansanyuan/21099/2017)为REKRRKR↓G，2株病毒(Quail/GX/GX-2/2017和EV/Guangdong/C17285051/ QY/7017-1-17)为KERRRKR↓G。目前已经鉴定出HA蛋白与受体结合相关的一些氨基酸突变，能够改变病毒对人类受体唾液酸α2-6半乳糖苷(SAα2-6Gal)和禽类受体唾液酸α2-3半乳糖苷(SAα2-3Gal)的亲和力。这些氨基酸位点突变包括S133A、T156S、Q222L、S/R223N、G224S、P235S和E251K等，特别是Q222L和G224S突变在2种不同受体亲和力的转变中发挥的作用最为关键[14]。本研究中，所有病毒HA蛋白的Q222和G224位氨基酸没有发生突变，保留了禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)结合特性；但223位有6种氨基酸突变，分别为：S (69株)、R (17株)、G (5株)、Q (9株)、C (5株)、H (1株)。此外，所有93株病毒HA蛋白都有S133A和T156S突变，表明这些病毒有一定的SAα2-6Gal受体结合能力。93株分离株的HA蛋白160位氨基酸发生突变(T→A)，158N位点失去糖基化，有研究认为这可能增强了HA与人受体SAα2-6Gal的结合力[15-17]。93株中有75株病毒的HA蛋白缺失了126E位氨基酸，导致124N位出现一个新的潜在糖基化位点，这是H5N6禽流感进化的一个新特征。2017-2019年中国南方H5N6禽流感病毒HA蛋白关键氨基酸位点分析见表 1。
| 位点突变 Mutation |
生物学功能 Biological function |
93株H5N6病毒位点突变(毒株数量) The HA mutation of 93 H5N6 viruses (the number of isolates) |
| S133A | 受体结合位点：增强病毒对人受体 SAα2-6Gal的亲和力 Receptor-binding site: enhancing the binding for human receptor SAα2-6Gal |
A (93) |
| T156A | A (93) | |
| Q222L | Q (31) | |
| S/R223N | S (69), R (17), G (5), Q (9), C (5), H (1) | |
| G224S | G (93) | |
| P235S | P (93) | |
| E251K | E (93) | |
| T156A | 丧失154位糖基化位点 Lossing 154 site glycosylation |
A (93) |
| 126E缺失 126E deletion |
获得124位糖基化位点 Having a novel 124 site glycosylation |
Deletion (75), E (18) |
| HA0裂解为HA1和HA2 HA0 divided into HA1 and HA2 |
含有多个碱性氨基酸，病毒对鸡高致病性 Showing multiple basic amino acids and highly pathogenic to chicken |
REKRRK↓G (2), RERRRK↓G (25), REKRRKKR↓G (2), RETR↓G (2) |
本研究表明，自2017年7月开始，江苏省活禽市场H7亚型病毒的检出率急速下降，从2018年到2019年1月间，仅有散在的H7阳性标本检出。从2019年2月到2020年9月没有检出H7亚型病毒。2017年7月开始，中国在家禽中推广使用H7/H5双价灭活疫苗用来预防H7N9和H5亚型禽流感。2017年下半年以来，H7亚型病毒在江苏活禽市场的减少乃至消失可能与上述家禽H7/H5疫苗免疫行动有关。与H7亚型不同，虽然我国家禽业长期使用H5亚型疫苗且疫苗株随着流行株抗原性的改变不断更新，但H5N6病毒自2014年以来一直在活禽市场中存在。最近Bai等[18]研究发现，2014年以来，广东活禽市场上的H5N6病毒HA蛋白已经发生抗原漂移，2018年的流行株对疫苗株A/Chicken/Guizhou/4/ 2013的抗原匹配性下降，需要制定新的防控措施。
自2008年Clade 2.3.4.4 H5Ny禽流感病毒出现以来，H5N6病毒逐渐取代H5N1病毒成为东亚地区流行的优势亚型。Lee等根据H5Ny (主要是H5N6和H5N8亚型)的进化情况将HA基因划分出4个进化组，包括Group A (Buan-Like)、Group B (Gochang-Like)、Group C和Group D[7, 19]。病毒在之后的传播过程中其HA基因快速进化，出现了许多新的基因亚型。2019年WHO等国际组织对Clade 2.3.4.4病毒重新分为8个Sub-Clade (2.3.4.4a– 2.3.4.4h)。目前，2.3.4.4a病毒主要在南亚的印度和孟加拉国流行。2.3.4.4b (Group B)和2.3.4.4c (Group A)主要由H5N8组成，最先于2013年末在中国和韩国被检出。2014年末，2.3.4.4c H5N8病毒在韩国禽类中暴发，同时传播到北美和欧洲。2.3.4.4a (Group D)最早于2013–2014年在中国出现，并于2014年在中国四川引致首例人感染H5N6病例(A/Sichuan/26221/2014)；之后，我国大陆没有关于2.3.4.4a病毒的流行的报道，但近年来在中国台湾的家禽中有检出的报道(H5N2/N5)。自2014年以来，中国和东南亚家禽中流行的H5Ny主要是Group C H5N6病毒，目前已经由Group C进化出5个WHO命名的Sub-Clade (2.3.4.4d–2.3.4.4h)。本研究发现，2017年以来，这5个Sub-Clade在中国大陆都有流行，其中Clade 2.3.4.4h是占优势的H5N6基因型且该基因型有了进一步分化的趋势，未来该类病毒的进化值得关注。2013-2014年2.3.4.4b H5N8病毒首次在禽类中出现，此后较长一段时间里没有再发现此类病毒的流行。2016年5–6月，2.3.4.4b H5N8病毒出现在我国青海湖和跨境蒙古与俄罗斯2国的乌布苏湖的候鸟中，不久此类病毒通过候鸟迁徙等途径传播到中亚国家、欧洲大陆以及北非[7, 20]。2017年末，HA基因来源于2.3.4.4b H5N8的基因重配H5N6亚型禽流感病毒在欧洲、日本和韩国禽类中被检出，而且病毒的基因组构成有一定的基因多样性特点[21]。值得注意的是，本研究发现4株H5N6病毒属于2.3.4.4b，其中1株病毒引起人的感染(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)，这也是该基因型首次感染人的毒株。显然，在野禽中流行的Clade 2.3.4.4b H5N8病毒已经通过基因重配方式在我国家禽中产生新的H5N6病毒。目前尚不清楚Clade 2.3.4.4b H5N6病毒在中国家禽和野禽中的流行情况，未来需要进一步加强监测。
HA蛋白在病毒感染细胞、跨种传播和宿主免疫应答中发挥重要作用[3, 14]。因此，HA蛋白的突变在病毒的进化过程中最受关注。HA唾液酸受体结合特性和糖基化特征是流感病毒跨种传播的关键[14, 22]。本研究中，虽然93株病毒HA蛋白的Q222位和G224位氨基酸未发生突变，对禽类受体SAα2-3Gal结合力较强；但同时发现有S133A和T156S突变，表明这些病毒对人受体SAα2-6Gal也有一定的结合能力，跨种感染人的能力在增强。此外，93株分离株HA蛋白的158位点丧失糖基化，同时124位出现一个新的潜在糖基化位点，这一新的糖基化特征对病毒致病性和传播力的影响尚不清楚。
截止到2019年，中国共发生24例人感染HPAI H5N6病例[23]。与人感染H5N1 (病死率52.8%)和H7N9 (病死率39.2%)相比，人感染H5N6禽流感的病死率略高(65%)[23-24]。H5N6病毒在我国活禽市场中持续存在，对人类健康和公共卫生造成重大威胁，需要继续加强对禽流感病毒的监测，密切关注病毒的演化。
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