内生细菌广泛分布于各种植物组织或细胞间隙内，与宿主互惠共生^[1]。该类微生物具有多种生物学作用，包括植物促生^[2]、提高植物抗逆能力^[3]、增加宿主植物的他感作用^[4]等。植物病原菌侵染是农业发展中的关键问题，而内生细菌存在抑菌方式多样、种类和数量众多、容易培养等特点，因此，筛选和研究内生生防细菌具有重要的现实意义^[5]。

当前应用较多的内生生防细菌有气单胞菌属(Aeromonas)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属等细菌，其中应用最为普遍的是芽孢杆菌属细菌^[6]。陈虹娇等将枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis S37)接种到棉苗上，测定其对棉苗立枯病(Cotton Rhizoctoniosis)的防治效果，结果表明该菌株具有一定的拮抗作用^[7]。此外，内生细菌还具有促生作用，促生特性包括产生吲哚乙酸、固氮、溶解磷、铁载体生物合成等^[8]。

地锦草(Euphorbia humifusa)为大戟科大戟属的一年生草本植物，有地瓣草、乳汁草等多种别名^[9]，是一种常用的中药材，一般夏、秋季节采收全株。种子细小、卵形，茎纤细，长约20 cm，表面略带红色，采收季节带紫红色，长圆形叶片，叶绿色或带紫红色。该植物资源丰富、分布广泛，含有萜类^[10]、甾醇类、鞣质及酚酸^[11]等主要化学成分，该植物作为中药材多用于抗炎以及抑菌等方面，显示出重要的生物学潜力^[12-14]。有研究表明，地锦草对多种植物致病菌及动物致病菌有一定抑制作用，抗菌能力强且抗菌谱较广^[15-17]。除药理作用外，地锦草也具有重要的经济价值。例如，可以利用地锦草的抗菌作用来提高真丝织物的抗菌活性^[18]。在韩国，该植物用于生产许多功能性饮品如清热消炎的草药茶，以及护肤、防止脱发的产品，还利用其提取物生产缓解宿醉的饮料^[19]。

目前，地锦草的研究主要集中在成分分析、化合物的含量测定及生物学活性研究等方面，而对地锦草内生细菌的研究还未见报道。因此，本研究对地锦草内生细菌进行分离鉴定，以3种常见的植物病原菌为指示菌筛选拮抗菌株，并验证内生细菌产吲哚乙酸(Indole Acetic Acid，IAA)、固氮、溶磷、铁载体合成能力，挖掘优异的拮抗、促生内生菌资源，以期有益于内生细菌的综合利用。

供试植物：2016年7月在新疆和田地区吉亚乡地锦草培养点采集地锦草健康品种。采样点位置为：80°0′10.44′′E，37°9′42.12′′N。采样时将整株植物拔出，4 ℃下保存带至实验室后立即进行处理。供试病原菌：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum FG-389)、棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani AG-4)和玉米小斑病菌(Bipolaris maydis JC2530)均来自新疆农业大学农学院。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，琼脂粉20.0，pH 7.2；NA培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂粉20.0，pH 7.4；PDA培养基(g/L)：去皮马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂粉20.0，pH 7.0；高氏一号培养基(g/L)：可溶性淀粉20.0，硝酸钾1.0，磷酸氢钾0.5，氯化钠0.5，七水合硫酸镁0.5，七水合硫酸亚铁0.01，琼脂粉15.0，pH 7.4；NBRIP培养基(g/L)：葡萄糖10.0，磷酸三钙5.0，氯化镁5.0，七水合硫酸镁0.25，氯化钾0.2，硫酸铵0.1，琼脂粉15.0，pH 7.0；Ashby无氮培养基(g/L)：甘露醇10.0，磷酸二氢钾0.2，七水合硫酸镁0.2，氯化钠0.2，二水合硫酸钙0.1，碳酸钙5.0，琼脂粉15.0，pH 7.0。

主要试剂和仪器：铬天青(Chromeazurol S，CAS)、革兰氏染色试剂盒，青岛海博生物技术有限公司；细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AG AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′)，生工生物工程(上海)股份有限公司。超声波清洗机，宿迁华诺超声科技有限公司；PCR仪，Biometra Gmbh公司；紫外分光光度计，Eppendorf公司。

取植物全草进行表面消毒，具体步骤如下：(1)冲洗表面泥土，超声波清洗机清洗15−20 min；(2) 0.1%的吐温-20浸泡1 min；(3)有效氯含量为5%的次氯酸钠溶液处理5 min，无菌水清洗3次；(4)灭菌的2.5%硫代硫酸钠溶液处理10 min，无菌水冲洗3次；(5) 70%乙醇处理3 min，最后用无菌水将全草样品冲洗5次，置于无菌环境中自然干燥^[20]。

取100 μL最终冲洗地锦草的水在NA培养基上进行涂布，28 ℃培养5 d，根据有无菌落的生长确认表面消毒是否充分。

上述处理后的全草样品用提前灭好菌的研钵进行研磨，称1 g于49 mL的生理盐水中，28 ℃、180 r/min摇床培养2 h，培养后的菌液进行6个梯度的10倍比稀释^[21]。不同浓度的菌悬液各取150 μL于分离培养基上，28 ℃培养2−7 d，重复3次。平板上有菌长出后，观察菌落及细胞形态，选取单菌落在各培养基上反复进行纯化，得到的菌株视为纯分离株，在各分离培养基的斜面上临时保藏。菌株用无菌生理盐水制成细菌悬液，无菌条件下取等体积的菌悬液和50%的甘油溶液，倒入离心管中，于−20 ℃进行长期保藏^[22]。

对已保存好的菌株进行形态、革兰氏染色，以及分子系统学特征鉴定。

首先提取细菌总DNA，选用煮沸法。参照文献[5]进行细菌16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：2×TSINGKE Master Mix 25 μL，模板DNA 1 μL，27F和1492R引物(100 μmol/L)各0.7 μL，ddH₂O 22.6 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34个循环；72 ℃ 8 min。

PCR扩增后所得产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测，将条带清晰的PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。得到的序列结果进行序列比对，按序列相似度大于97%的标准选择参考菌株。采用邻接(Neighbor-Joining，NJ)法构建系统发育树，进行系统发育学分析^[23]。

采用平板对峙法^[24]，首先活化内生细菌和植物病原菌，小麦赤霉病菌用NA培养基，其余2个病原菌用PDA培养基；然后在培养基中间接入直径为6 mm的供试菌菌饼，同时在菌饼两旁2 cm处对称接种内生细菌，每组重复3次，28 ℃培养5−7 d，对照组只接病原菌，根据公式计算抑菌率。抑菌率(%)=(对照菌落半径−处理菌落半径)/对照菌落半径×100。对不同菌株抑菌率进行单因素方差分析，并用Duncan法对数据进行多重比较。

(1) 内生固氮细菌的筛选

将已活化好的菌株接种于NA液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养1 d，菌悬液以1:50的比例加到Ashby液体培养基中，培养5−7 d；如果实验组变浑浊则为阳性，具有固氮活性；将具有固氮活性的菌株在固体Ashby培养基上连续继代3次，第3次仍有活性即可视为具有稳定固氮活性。

(2) 内生溶磷细菌的筛选

用NBRIP固体培养基测试细菌溶解磷酸盐的能力^[25]，首先进行菌株活化，随后接种于上述培养基上，在28 ℃培养5−7 d，测定溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，根据能否产生溶磷圈与D/d值的大小初步判断菌株的溶磷能力。

(3) 产吲哚乙酸内生细菌的筛选

产吲哚乙酸细菌的筛选：将试验菌株用NA液体培养基暗培养4 d，该培养基含有L-色氨酸(200 μg/mL)；将菌悬液和Sallcowski比色液同体积滴到白色陶瓷板上，立即避光静置30 min，以50 μL浓度为50 mg/L的吲哚乙酸标准品液作对照。如果菌株产吲哚乙酸，颜色会变红。

吲哚乙酸的定量测定：将已筛选出的能产IAA的菌按照上述方法暗培养4 d，发酵液浓度调为一致，OD₆₀₀值都调为1.0。取适当的发酵液，8 000 r/min离心10 min后取上清液转入EP管中，Sallcowski比色液取同样体积于EP管中，立即置于避光条件下，30 min之后测定其OD₅₃₀值，重复3次，测定功能菌株产生的吲哚乙酸含量^[26]。

(4) 合成铁载体内生细菌的筛选

用CAS检测固体平板测定菌株能否产生铁载体。将已活化菌株点接于已配好的CAS检测固体平板上，28 ℃培养3 d，观察菌落周围是否形成橙黄色晕圈，如有则为能产铁载体。

课题组于7月份采集地锦草样品，正值该植物结果。共采集40多株地锦草健康植株。分离内生菌时选择地锦草全草，包括根、茎、叶和未成熟果实，植株高度分布在12−20 cm。由于该植物根、茎纤细，叶片细小，果实很小，采用全草研磨法分离内生菌。

消毒处理后的全草进行研磨，称1 g于49 mL生理盐水中，28 ℃、180 r/min摇床培养2 h，随后进行10倍比稀释菌悬液，6个梯度的菌悬液各取150 μL于分离培养基上，培养2−7 d。根据形态差异，从4种不同的培养基中获得133株细菌，其中革兰氏阳性菌株有59株、阴性菌株74株，各占总菌株的44.36%和54.14%。根据培养基的不同对菌株命名DHL、DHP、DHN、DHG，分别为LB、PDA、NA、高氏一号培养基上筛选的菌株。初步判定：133株菌分属于4门5纲8目13科25属。优势门和优势属分别为变形菌门(52.63%)和芽孢杆菌属(15.79%)。此外，相似性小于98.65%的潜在新种菌株有8个，是否新种需进一步研究(表 1)。

133株菌经传代后93株活化成功，选用3种常见的植物病原菌进行拮抗实验。每种病原菌单独为一批实验，培养时间为5−7 d，期间观察抑菌圈及对照组的生长状况，待抑菌圈稳定且对照组长满平板时计算抑菌率。玉米小斑病菌组和小麦赤霉病菌培养到第5天，棉花立枯丝核菌组培养到第7天，22株内生细菌对3种病原菌有不同程度的抑制作用(表 2)。其中，19株菌能抑制棉花立枯丝核菌，DHL56抑制作用最强，抑制率为74.60%；8株菌能抑制小麦赤霉病菌，DHP3抑制作用最强，抑制率为75.40%；11株菌能抑制玉米小斑病菌，DHP8抑制作用最强，抑制率为61.70%。菌株DHL56、DHP8、DHP3、DHN17对3种病原菌都有抑制作用，其中菌株DHP8对3种病原菌综合抑制作用最强，对棉花立枯丝核菌和小麦赤霉病菌抑制率分别为73.80%和71.25%，对玉米小斑病菌抑制率为61.70%。

结合分子生物学鉴定，22株拮抗菌株属于5门7属，芽孢杆菌属占优势(图 1)。

图 1　拮抗菌系统发育分析 Figure 1　The phylogenetic analysis of antagonistic bacteria 注：A、B、C、D分别为香味菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、变形菌门菌株的系统发育树；括号内数值为菌株在GenBank中的登录号；分支点上数字为重复1 000次的自展值；标尺0.020为核苷酸替换率；选择的外群分别是：A：Sphingobacterium spiritivorum DSM2582；B：Staphylococcus pasteuri ATCC51129；C：Clostridium bowmanii DSM14206；D: Helicobacter pylori ATCC43504 Note: A, B, C, D are phylogenetic trees of Myroides, Micrococcus, Bacillus and Proteobacteria respectively; Numbers in parentheses are GenBank accession numbers; Numbers at the nodes indicate the level of bootstrap values based on 1 000 replications; The scale bar indicates 0.020 substitutions per nucleotide position; The selected out-groups are A: Sphingobacterium spiritivorum DSM2582; B: Staphylococcus pasteuri ATCC51129; C: Clostridium bowmanii DSM14206; D: Helicobacter pylori ATCC43504

图选项

93株内生细菌活化后接种于Ashby培养基，结果显示76株菌能够使Ashby液体培养基变浑浊，并能在Ashby固体培养基上生长，说明有固氮能力(表 3)，占所用菌株的81.72%。这76株分别属于25个属，芽孢杆菌属占优势。

93株内生细菌中19株菌能在NBRIP固体培养基上形成透明圈(表 4)，说明对磷酸钙有溶解效果，它们分属于8个属，芽孢杆菌属占优势。同时，这19株菌都具有固氮能力，即93株菌中有19株菌同时具有溶磷和固氮能力。

Sallcowski比色液加到菌悬液中立即避光静置，观察变色来确定此菌是否产生吲哚乙酸。结果显示37株菌产吲哚乙酸，占所用菌株的39.78%，菌株产吲哚乙酸的量如表 5所示。它们分别属于4门19属，假单胞菌属和泛菌属占优势。菌株DHL55产吲哚乙酸量最多，为105.67 mg/L，其属于变形杆菌属；产吲哚乙酸量大于50 mg/L的菌株有DHL25、DHG27、DHL36、DHL2、DHN29、DHL12、DHG28；其他29株菌的吲哚乙酸产量在0.67−49.98 mg/L之间。其中，有9株菌同时具有固氮和溶磷能力(DHL2、DHL14、DHL24、DHL25、DHL26、DHL53、DHG18、DHG27和DHG28)。

使用CAS蓝色检测平板，通过观察菌株周围是否有橙黄色晕圈来判断是否能合成铁载体。结果显示，DHL51、DHL56、DHP3、DHP8、DHP12、DHP13和DHP14这7株菌能合成铁载体，占所用菌株的7.52%，均为芽孢杆菌属。其中DHL56合成铁载体的能力最强(图 2)，DHP8同时还具有固氮和解磷功能。

图 2　菌株DHL56合成铁载体能力 Figure 2　Siderophore activity of strain DHL56

图选项

植物内生菌在多数情况下与宿主植物是互惠共生的^[27]。在从宿主那里获得稳定生活环境的同时，内生菌可从以下几个方面对宿主产生积极作用：(1)内生菌可以提高宿主抗性。主要是通过产生抗生素等代谢产物或通过诱导宿主系统抗性来帮助宿主应对生物胁迫，也可提高宿主抗性基因表达，进而促进宿主体内与抗性相关代谢物的积累，比如，有研究表明油菜内生菌Heteroconium chaetospira能诱导宿主对油菜疟原虫的抗性，进一步研究发现，该内生菌通过上调宿主中与茉莉酸、乙烯、生长素及PR-2蛋白生物合成相关的基因来诱导宿主对疟原虫的抗性^[28]；一些内生细菌通过自身代谢产物，如脱落酸(Abscisic Acid，ABA)等来提高宿主植物在非生物胁迫下的抗逆性^[29]。(2)内生菌能够促进宿主生长。一些内生细菌通过调节生长相关激素、帮助宿主获得氮磷等限制性植物营养来促进宿主生物量的增加，从而发挥促生作用^[30]。(3)内生菌能产生与宿主相同或相似的代谢产物，甚至有些天然代谢产物是内生菌与宿主相结合而产生的物质。例如，我国珍稀中药龙血竭是在内生菌侵染条件下激活龙血树免疫系统产生的防御性产物。我国学者从龙血树产生天然血竭部位分离出优势内生菌镰孢霉菌(Fusarium proliferatum)，在云南等地采用为植物“输液”的办法将真菌孢子输入龙血树体内，在较短的时间内产生高质量的血竭^[31]。

内生菌对宿主植物有广泛的生物学作用，宿主植物的优良性状与内生菌功能息息相关。因此，深入研究植物内生菌的种群结构以及生物学功能具有重要意义^[32]。

本研究中共分离到133株地锦草内生细菌。通过16S rRNA基因分子鉴定，所有菌株分属4门5纲8目13科25属，具有较丰富的多样性。研究表明，植物中分离到的内生细菌大部分属于芽孢杆菌属^[33-34]。本研究中优势属为芽孢杆菌属，占15.79%。这与其他研究者的结果一致，但本研究中分离到的Kerstersia、Paenalcaligenes、Kosakonia等属很少见，增加了植物内生可培养细菌范畴。

随着农业的不断发展，某些植物病害的发生呈逐渐上升趋势，需要一些无病害、资源丰富的生防剂。内生菌凭借来源广泛、易于培养、与植物互惠共生等优势，成为近年来生防菌剂研发的热点。本研究测定内生细菌对3种常见植物病原菌的拮抗活性，发现22株菌有不同程度的拮抗活性。其中19株菌抑制棉花立枯丝核菌、8株菌抑制小麦赤霉病菌、11株菌能抑制玉米小斑病菌。菌株DHL56、DHN17、DHP3、DHP8对3种原病菌都有抑制作用，是芽孢杆菌属的不同物种。这与前人的研究结果吻合^[35-37]。本研究虽然在实验室水平上分离得到具有较强拮抗功能的菌株，但是选用的病原菌数目较少。筛选生防内生菌时，用作供试菌的病原菌种类应当较多，防止筛选的功能菌株生防能力单一、应用范围窄，也可将多种菌剂配合使用，提高内生细菌的综合应用效果^[38]。

采用4个指标进行促生潜力研究，初步筛选分离到76株具有固氮能力的菌株，占所用菌株的81.72%，多数为芽孢杆菌属。7株菌能合成铁载体，占7.52%，均为芽孢杆菌属。芽孢杆菌属是目前生防菌中研究较多的一类细菌，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等均为生物防治中重要的菌种资源^[39]。芽孢杆菌属不仅对一些植物病害有较好的防治效果，并且对植物的生长具有促生作用，这可能与芽孢杆菌属具有较强的抗逆性有关。19株菌具有解磷能力，占所有菌株的20.4%。国内外已经研究发现假单胞菌属、泛菌属、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)是常见的解磷内生细菌^[40]，本研究结果中也出现能解磷的假单胞菌属、泛菌属，与该研究结果相似。37株菌具有产吲哚乙酸能力，占39.78%，吲哚乙酸产量在0.67−105.67 mg/L之间；菌株DHL55产吲哚乙酸量的达到105.67 mg/L，能力最强，属于变形杆菌属。9株菌同时有固氮、解磷、产吲哚乙酸能力。DHP8不仅对本研究中3种植物病原菌有明显的抑制作用，也具有多种促生特性，需进一步研究。

本研究对内生细菌促生特性只进行了初步分析，需进一步对固氮酶活性、溶磷量等进行测定。本研究中通过无氮培养基初筛得到较高比例的内生固氮菌，但只是对内生细菌有无固氮能力作了初步判断，没有进一步测定固氮酶活性，因此结果可靠性不强。固氮酶活性是衡量生物固氮效率的重要指标之一。除了体外固氮能力的测定，还应该将固氮菌回接到植物体内研究其促生效应。此外，最新研究表明能否高产胞外多糖也成为了固氮菌筛选的一种指标^[41]。因为固氮菌所含的固氮酶对氧极其敏感，在一切氧条件下固氮酶均会失活，从而丧失了固氮催化反应的能力，而胞外多糖可以控制进入固氮菌菌体细胞的氧浓度^[42-43]。近年来，国内外研究者对各类植物中的内生固氮菌及其固氮能力进行了研究，发现许多植物中都存在较高比例的内生固氮菌。例如，从尼瓦拉野生稻中共分离到57株内生细菌，其中44株为内生固氮菌，固氮酶活性在5.79−899.72 nmol/(mL·h)之间^[44]；采用高通量测序技术对巨菌草不同生长时期的内生固氮菌群组成进行分析，结果表明该植物含有丰富的固氮菌群种类和丰度^[45]。溶磷圈法常用于溶磷菌株的筛选，该方法常用于初步判断菌株是否有溶磷能力，该方法容易出现假阴性结果，平板筛选时可能会因菌落较多以及菌落间竞争，使一些原本具有溶磷能力的菌株未出现溶磷圈；对菌株的溶磷能力进行定量时常用液体培养法，而且液体培养时溶磷细菌可以利用多种难溶性的无机磷，理论上更严谨、合理^[46]。本研究中缺少盆栽试验环节，此外，能否在植物体内定殖是生防细菌发挥其生防作用的重要影响因素之一，可以在后期试验中加入内生细菌定殖以及定殖的追踪与监测。