EBV是1964年Epstein和Barr在伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)中发现的肿瘤相关DNA病毒，属于人类疱疹病毒γ亚科^[1-2]。人类是EBV唯一的天然宿主，患者和EBV潜伏感染者为传染源，经口密切接触传播，主要感染人类的口咽部上皮细胞和B淋巴细胞^[3]。EBV在人群中的感染非常普遍，流行病学资料显示，成年人的EBV抗体阳性率高达90%以上^[4]。临床上，EBV感染不同地区、不同年龄人群引起的疾病形式多样，预后差异较大；除少数急性EBV感染者呈自限性，预后较好外；大部分慢性潜伏感染者病程较长，迁延不愈；同时，EBV潜伏感染与多种恶性肿瘤密切相关，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)、EBV相关胃癌(Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma，EBVaGC)和免疫抑制患者(如HIV感染或器官移植后)发生的B细胞淋巴瘤等^[5-6]。目前，EBV的具体致病机制尚不明确，EBV慢性潜伏感染及相关恶性肿瘤仍缺乏有效的治疗药物和根治措施，总体预后不佳^[4-6]。

CRISPR/Cas系统又称成簇的规律间隔短回文重复序列及相关核酸酶系统，源于细菌与古生菌中的适应性免疫系统，用于抵御外源噬菌体或质粒DNA入侵^[7-8]。CRISPR/Cas9作为结构简化改造的Ⅱ型CRISPR/Cas系统，可针对目的基因序列按照碱基互补配对原则设计向导RNA (single guide RNA，sgRNA)，在sgRNA引导下，由Cas9核酸酶进行靶向识别剪切，再通过同源重组(homologous recombination，HR)和/或非同源末端链接(non-homologous ending-joining，NHEJ)完成特定基因序列的靶向编辑^[9-10]。作为第三代DNA核酸酶基因编辑技术，相较传统的DNA核酸酶基因编辑技术，如锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)基因编辑技术等，CRISPR/Cas9系统具有简便高效、靶向位点选择灵活以及可同时编辑多个靶点等优势^[10-11]。近年来，越来越多的学者致力于将CRISPR/Cas9技术应用于EBV感染免疫相关研究中并取得了一系列突破性进展。

EBV感染不同人群、不同宿主细胞后引发的疾病类型和临床预后存在较大差异，除宿主遗传背景和地理环境因素之外，不同的EBV致病基因亚型和宿主依赖基因是其关键因素^[12-15]。以往根据基因多态性将EBV基因组粗略分为2个亚型，1型最常见，主要作用于B细胞，使其成为B淋巴细胞永生化细胞系，2型常见于非洲部分地区交叉感染病例；在体外细胞培养条件下，1型转化B淋巴细胞、使其发生癌变的能力强于2型^{[14, 16]}。后有研究发现，EBV潜伏感染时可表达9种潜伏期抗原，包括6种核抗原(EBV nuclear antigens，EBNA1、2、3a、3b、3c和LP)和3种潜伏膜蛋白(latent membrane proteins，LMP1、2a和2b)；根据病毒表达的潜伏期抗原种类，可将EBV基因组分为3型：Ⅰ型仅EBNA1表达，常见于伯基特淋巴瘤；Ⅱ型表达EBNA1和LMPs，见于鼻咽癌、EBV相关胃癌、EBV阳性霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤等；Ⅲ型表达全部EBNAs、LMPs和非编码RNA等，见于淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines，LCLs)、EBV阳性移植后淋巴增殖病和HIV相关淋巴增殖病等^[16-17]。最新研究发现，EBV基因亚型众多，远超上述分类，即使临床特征相近的同一EBV感染疾病类型，其致病基因亚型之间也存在不同程度的基因变异^[12-13]。随着基因测序技术的快速发展和推广应用，针对EBV致病基因序列和宿主依赖基因的研究逐渐开展起来。但人类病毒基因组序列通常较长，EBV双链DNA更是长达175 kb，第一代基因测序技术即传统桑格法难以对其进行完整复制分析；第二代测序技术虽然不受序列长度限制，但因其探针测序较短，难以识别区分EBV基因组中的重要重复片段，如ir1–4和fr等；因此，针对EBV致病基因序列特征的测序技术备受期待^[18-19]。

EBV感染宿主B淋巴细胞后，可使其恶变转化为伯基特淋巴瘤和淋巴母细胞系等，在其恶变转化过程中，EBV致病基因亚型和宿主依赖基因如何发挥作用目前仍不明确。Ma等^[19]利用CRISPR/Cas9技术，对EBV感染阳性、B细胞发生恶变转化的BL和LCLs基因组进行基因亚型筛选，分别检测出与肿瘤细胞生长和存活至关重要的57个BL基因和87个LCLs基因；进一步通过基因功能缺失对比研究证实，EBV潜伏膜蛋白LMP-1诱导的cflip是LCLs抵御TNF-α介导的程序性细胞死亡的关键因子；除此之外，EBV诱导激活的batf/irf4是LCLs中抑癌基因bim抑制和癌基因myc激活的决定因素。在另一项研究中，Guo等^[20]利用全基因组CRISPR/Cas9筛选技术在BL细胞中筛选出一个以宿主基因myc为中心的关键基因网络，其包括fact、staga和mediator等基因，它们相互协作，抑制关键基因bzlf1启动子。bzlf1是EBV溶细胞性裂解反应的主要调控基因，其编码的ZEBRA蛋白是激活EBV溶细胞性裂解级联反应的重要转录因子^[21]。该基因表达下调可使B淋巴细胞免于溶细胞性裂解死亡，持续处于潜伏感染状态，最终介导宿主B淋巴细胞恶变转化^[20-21]。上述研究表明，CRISPR/Cas9全基因筛选技术的应用有助于发现及分析EBV相关BL和LCLs的关键致病基因亚型和宿主依赖基因，从而加深对EBV致病机理的认识。

EBV除诱导B淋巴细胞恶变转化外，也可引发上皮细胞恶变^{[5, 12]}。研究显示全球约10%胃癌患者存在EBV感染，EBVaGC每年新发病例超过8万人^[22]。相较其他EBV非相关胃癌(Epstein-Barr virus non-associated gastric carcinoma，EBVnGC)，EBVaGC基因特征包括bart miRNA高表达、ebna-1低表达、lmp1缺失等^[23-24]。bart miRNA为EBV关键非编码基因，可通过靶向调控DNA双链断裂修复基因atm、抑癌基因tp53和胞核输入受体ipo7基因等机制，抑制细胞凋亡和逃避免疫杀伤，促进肿瘤演变进展^[25-27]。Kanda等^[28]将从胃癌患者分离培养的EBV阳性的胃癌细胞株SNU719和YCCEL1作为研究对象，利用CRISPR/Cas9技术，以bart miRNA病毒开放阅读框(bart miRNA viral open reading frames，bvrf1)作为靶点，用以往验证有效的pX330-sgEBV作为引导RNA，精准识别病毒基因组中的bart miRNA致病基因序列，对其进行靶向剪切和同源修复，再结合第三代测序技术PacBio单分子测序对包含重复片段的基因组进行完整读取，并进一步利用Western blotting蛋白免疫印迹等实验进行验证^[29]。此方法克服了传统二代测序技术的缺陷，加深了对胃癌相关EBV致病基因亚型的认识；提示CRISPR/Cas9技术可用于不同疾病相应的EBV基因组异质性和表型变异的鉴别分析，进而阐明不同EBV致病基因亚型的生物学意义^[30]。该研究也存在一些待改进的地方，首先用bvrf1作为CRISPR/Cas9技术的识别靶点，聚焦在BART miRNA病毒开放阅读框，而不是完整的EBV全基因组^[30]。另外，缺少正常的健康组作为对照，而且相应的胃癌细胞类型只来源于亚洲病例(韩国)，未涵盖其他地区和人群标本，无法综合且全面分析胃癌相关EBV基因变异特征；因此，只有CRISPR/Cas9技术和其他技术相互补充，才能全面深入地分析EBV相关疾病的致病基因亚型和宿主依赖基因^[30-31]。

EBV通过唾液传播进入体内后，主要感染人B淋巴细胞，也可感染上皮细胞、T淋巴细胞及NK细胞等^{[3-4, 32]}。根据宿主细胞的转归，EBV感染可分为两类^[33-37]：(1)溶细胞性感染(lytic infection，Lysis)：主要在B淋巴细胞中，病毒DNA在宿主细胞核中复制、转录、成熟，编码大量病毒蛋白，促进宿主细胞“爆炸式增殖”，同时病毒编码蛋白可被体内抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)识别，最终在细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)作用下引起宿主细胞溶解、死亡，并释放大量新生病毒颗粒，常见于急性感染如儿童传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)；(2)潜伏感染(latent infection，Latency)，可见于B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞等，病毒DNA双链在宿主细胞核中完成克隆复制，但病毒蛋白编码基因大部分不表达，仅少量免疫原性低的抗原蛋白表达，可在宿主细胞中长期存活、持续存在，最终导致宿主细胞恶变转化，常见于慢性活动性EBV感染、EBV相关肿瘤如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌等。EBV感染宿主细胞后的转归类型并非静止不变，呈潜伏感染状态的EBV在B细胞受体交联作用(BCR cross-linking)或化学诱导物激活后，可转变为溶细胞性感染，即溶细胞性重激活(lytic reactivation) (图 1)^[36-37]。EBV感染机体后，病毒与宿主细胞之间通过多种关键基因及信号通路交互作用，最终引起不同类型的感染和疾病转归^{[3, 17, 38-39]}。利用CRISPR/Cas9技术对其中的关键基因进行功能缺失(loss of function)和调控干预，再通过对比研究和综合分析，有助于阐明EBV感染的具体致病机理^[40]。

图 1　EBV感染过程及其类型 Figure 1　The process of EBV infection and its types

图选项

在终生感染EBV的记忆B细胞和相关肿瘤细胞中，如何使EBV长期维持在潜伏期，其相关机制仍不明确。以往研究发现，高免疫原性的EBNA2和LMPs在EBV新近感染的B淋巴细胞中显著高表达，而在既往感染过的记忆B细胞和伯基特淋巴瘤中明显下调^[36]。为了了解高免疫原性病毒蛋白在潜伏感染期的调控机制，研究者将合并EBV感染的伯基特淋巴瘤细胞作为研究对象，利用CRISPR-Cas9技术靶向敲除调控组蛋白泛素化的prc1基因，使H2AK119Ub1泛素化受抑制，继而稳定lmps启动子，使lmps基因免于基因沉默，正常发挥作用^[41]。同理，敲除DNA甲基化调控基因uhrf1和dnmt1可引起LMP1、EBNA2和bzlf1编码蛋白含量显著上调^[41]。LMP1、LMPs和EBNA2均为高免疫原性病毒蛋白，其上调可触发机体免疫细胞对宿主细胞的识别杀伤；EBV裂解关键基因bzlf1的编码蛋白可激活宿主细胞溶细胞性裂解反应；这一系列级联效应最终可引起伯基特淋巴瘤细胞表型发生转变，使其无法维持在持续潜伏感染状态^{[21, 36]}。有研究证实，在合并EBV感染的伯基特淋巴瘤中，DNA甲基转移酶1 (DNA methyltransferase，DNMT1)、泛素样含PHD和环指域1蛋白(ubiquitin-like ringfinger domains，UHRF1)和多梳抑制蛋白复合物1 (polycomb repressive complex 1，PRC1)可抑制高免疫原性病毒蛋白表达和bzlf1编码蛋白介导的EBV溶细胞性级联反应，从而有利于宿主细胞逃避免疫识别和免疫应答，长期维持潜伏感染状态，为其恶变转化提供前提条件^[41]。

干扰素调节因子8 (interferon regulatory factor，IRF8)，又名干扰素共有序列结合蛋白，作为IRF家族的重要转录因子，在正常B细胞分化中发挥关键调控作用^[42-43]。Lv等^[33]将EBV感染的B淋巴细胞系Akata作为研究对象，利用CRISPR/Cas9技术对其中的irf8基因进行靶向敲除，发现宿主细胞中的凋亡蛋白酶Caspase-1、Caspase-3和Caspase-8均显著下降，继而使KAP1、PAX5和DNMT3A等蛋白稳定性增加，免于裂解清除。KAP1、PAX5和DNMT3A可通过与TRIM28、bzlf1编码蛋白等共同作用，抑制宿主细胞溶细胞性裂解和重激活过程^[44-46]。以上研究^{[33, 44-46]}表明，在EBV感染的Akata细胞中，IRF8通过上调凋亡蛋白酶表达，诱导KAP1、PAX5和DNMT3A等蛋白裂解，此类蛋白的降解可使宿主细胞由潜伏感染向溶细胞感染转变，最终导致EBV的溶细胞性重激活。

EBV可以单独感染宿主细胞，也可与其他病原体或病毒共同感染于同一宿主细胞，它们之间相互作用，共同促进疾病的演变进展^{[5, 47]}。伯基特淋巴瘤常伴有EBV和疟原虫的同时感染^{[35, 48]}。研究发现疟原虫消化降解血液产物疟原虫色素可通过激活Toll样受体-9 (TLR-9)抑制伯基特淋巴瘤细胞中的EBV溶细胞性裂解，而其具体机制仍不明确^[48]。研究者利用CRISPR/Cas9技术分别靶向编辑Akata细胞中的tlr9、myd88、irak4基因；经过对比分析发现，TLR9-MyD88-IRAK4信号通路激活后，通过翻译后修饰方式使bzlf1编码蛋白含量显著下降，从而抑制EBV溶细胞性裂解，使其维持潜伏感染状态；研究表明在EBV与疟原虫共同感染宿主细胞过程中，疟原虫色素通过激活宿主细胞的TLR9-MyD88-IRAK4信号通路，下调溶细胞裂解基因bzlf1编码的蛋白含量，使EBV处于持续潜伏于宿主细胞体内免于破坏，继而促进EBV和疟原虫共同感染后的病变进展^[35]。

临床资料显示，成人体内EBV感染以潜伏感染为主。目前，EBV持续潜伏感染的宿主细胞仍缺乏有效的预防和治疗手段，预后较差^{[5, 47]}。传统预防性疫苗是以EBV的包膜糖蛋白GP350或其他潜伏蛋白作为靶蛋白，刺激机体产生中和抗体，从而阻止病毒感染，干预疾病进展；治疗性疫苗则主要针对病毒感染相关恶性肿瘤，以潜伏感染过程中产生的核抗原和潜伏膜蛋白作为靶点，刺激机体产生特异性细胞免疫应答，提高CTLs对肿瘤细胞的杀伤能力^[49-50]。但EBV基因组序列较长，基因亚型种类多、差异大，编码蛋白种类繁杂；而且由于程序性死亡受体1 (programmed death factor-1，PD-1)/程序性死亡受体配体1 (programmed death factor ligand，PD-L1)等肿瘤免疫逃逸分子作用，导致预防性疫苗和治疗性疫苗研制存在诸多限制^[49-50]。另外，传统抗病毒药物仅可缓解部分急性感染患者症状，却难以彻底清除体内病毒，对慢性感染和潜伏感染患者疗效欠佳^{[5, 47]}。因此，开发新型EBV感染治疗新策略成为目前研究热点和难题。近年来，随着CRISPR/Cas9技术在人类疾病治疗方面研究的深入，一些临床疗效不佳、预后较差的疾病，如病毒相关性疾病、基因遗传性疾病和肿瘤相关疾病等有望在治疗领域取得新突破^{[9-10, 40, 51-54]}。利用新型CRISPR/Cas9基因编辑技术，对EBV致病基因序列进行靶向编辑，可有效降低EBV基因含量，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性，干预肿瘤进展^[10]。

EBV感染是非洲儿童地方性伯基特淋巴瘤最主要的致病因素，并可通过多种方式促进肿瘤的恶变进展。van Diemen等^[55]研究发现ebna1 (EBV核抗原位点)和orip (EBV复制起源位点)均可以控制EBV复制和维持游离病毒存活，其中orip包括了ebna1的结合位点和部分双重对称原件^[56-57]。通过设计针对ebna1区域的CRISPR/Cas9系统，对致病基因序列进行靶向敲除，发现EB病毒感染的伯基特淋巴瘤Akata-Bx1细胞系中的病毒基因含量降低了40%−60%；进一步对比研究发现，设计联合针对ebna1区域和orip特定区域的靶向编辑系统，可使细胞内病毒基因含量下降超过95%以上，伴随病毒荷载量的显著下降，该淋巴瘤细胞增殖速度显著抑制，进而导致细胞凋亡；该研究表明通过联合设计针对不同识别位点基因区域的靶向RNA，CRISPR/Cas9技术可以最大程度地消除伯基特淋巴瘤中的潜伏感染病毒，从而抑制肿瘤细胞生长增殖^[55]。

原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma，PEL)起源于B细胞，常伴有EBV和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus，KSHV)的共同感染^{[5, 58-59]}。Bigi等^[59]研究发现，将外源性EBV作用于单独KSHV感染的PEL细胞中，KSHV基因组稳定性和KSHV潜伏相关核抗原(latency-associated nuclear antigen，LANA)含量均可显著上调；再通过构建针对EBV基因组的CRISPR/Cas9质粒，将其转染到KSHV和EBV双重感染的PEL细胞中，检测其中EBV含量显著下降的同时，经对比研究发现，该肿瘤细胞活力、KSHV基因组拷贝数及潜伏相关核抗原均显著下调，而导入EBV核抗原-1位点基因ebna1则可逆转上述表型变化。该研究表明在原发性渗出性淋巴瘤中，EBV和卡波西肉瘤相关疱疹病毒相互作用，共同促进疾病进展；利用靶向EBV基因组的CRISPR/Cas9技术，去除EBV含量的同时，可显著下调LANA含量和KSHV荷载量，降低肿瘤细胞活力，为探索临床治疗合并EBV感染的原发性渗出性淋巴瘤提供理论依据^[59]。

在我国华南地区，鼻咽癌发病率与长期慢性EBV感染密切相关，其转移和复发率较高，预后欠佳^{[3, 5-6]}。研究发现，bart miRNA含量在鼻咽癌、胃癌等EBV阳性上皮肿瘤组织中显著高表达。Yuen等^{[53, 60]}设计出针对EBV基因组中bart启动子区域的引导RNA，利用CRISPR/Cas9技术对EBV阳性鼻咽癌细胞系C666-1进行靶向编辑，结果证实bart 编码的病毒miRNA含量显著下降，荧光素酶报告基因检测结果显示，bart基因表达活力也显著降低，进一步深度基因测序证实未发现脱靶效应。如前所述，作为EBV关键非编码基因，bart miRNA可通过抑制细胞凋亡和逃避免疫杀伤等机制，促进肿瘤恶变进展^[25-27]。该研究通过靶向编辑降低bart含量，为探索干预鼻咽癌进展新策略提供理论支持^{[53, 60]}。该研究团队另一项研究发现，设计针对EBV DNA基因组不同位点的靶向CRISPR/Cas9系统，对鼻咽癌细胞系C666-1进行靶向基因编辑，可使其中的EBV DNA含量下降50%，虽不能将感染的C666-1细胞系直接杀死，但可显著增强它们对化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的化疗敏感性，表明CRISPR/Cas9技术虽不能直接阻止鼻咽癌进展，但可为其辅助治疗(如化疗)提供新的治疗窗^[61]。

近来，免疫细胞检查点抑制剂PD-1和PD-L1的临床应用开启了肿瘤免疫治疗的新时代，也引起了人们对免疫疗法治疗各种癌症的广泛关注。EBV相关性胃癌相较于EBV非相关性胃癌，具有淋巴细胞浸润率高、PD-L1扩增率高等特点。Su等^[62]将EBV-LMP2A诱导的CTLs作为研究对象，利用CRISPR-Cas9技术靶向破坏其中的PD-1，经体外实验证实，改造后的CTLs可显著增加对EBV-LMP2A抗原的免疫应答反应，从而增强对EBVaGC细胞的杀伤毒性；更为重要的是，当结合低剂量放疗时，这种靶向破坏PD-1的CTLs在EBVaGC移植瘤小鼠模型中发挥出显著的抗肿瘤作用；他们利用CRISPR-Cas9技术构建出新型细胞毒性T细胞CTLs，并证实其在EBVaGC动物模型中具有抗肿瘤作用，为进一步利用T细胞过继疗法治疗EBVaGC提供了新思路。

综上所述，EBV感染疾病种类多，关键致病基因亚型差异大。病毒在宿主细胞中的感染状态并非单一固定，在疾病演变过程中可通过多种途径及机制逃避体内免疫监控，促进疾病进展^[63-64]；另外，EBV感染也可合并其他病原体、寄生虫共同感染，而其中的关键基因及信号通路也并非静止不变，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以实时动态监测宿主细胞内的EBV致病基因亚型和宿主依赖基因，深入探讨致病基因的作用机制，联合设计针对不同致病基因序列的引导RNA，构建多靶点CRISPR/Cas9系统，为临床治疗EBV相关疾病，尤其是EBV相关恶性肿瘤提供新型临床干预靶点和策略。

CRISPR/Cas9技术应用于EBV相关研究领域仍存在以下几个问题：(1)如何选取安全合适的运输载体。目前，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、慢病毒(lentivirus，LV)和质粒作为相应CRISPR/Cas9系统运输载体存在诸多弊端，如整合基因组到靶细胞时具有潜在的诱导癌变风险，缺少靶细胞特异识别机制和代价昂贵等。最近研究发现，微囊泡、外泌体以及人工合成脂质体等载体系统有望成为有效、安全、经济可行的CRISPR/Cas9系统运输载体^[65-67]。(2) CRISPR/Cas9技术的脱靶效应和副作用问题。目前研究认为，选择高效和特异的靶向引导RNA至关重要，研究者需要通过对靶基因序列与人类完整基因组进行比对，找寻尽量多的潜在靶基因识别序列，充分完备相应实验验证，争取找到最高效、毒副作用最小的靶向sgRNA序列^{[10, 68-69]}。(3)生物安全性仍是目前CRISPR/Cas9技术用于临床转化前最值得慎重思考的问题^[70-71]。近来有报道利用CRISPR/Cas9技术对人类胚胎直接进行编辑，虽然其初衷是使其编辑的胚胎后代免遭HIV病毒感染，但却严重违反了相关法律法规，更违反了医学伦理基本原则^[72-73]。

CRISPR/Cas9系统因其技术优势，自问世以来便被寄予厚望，经过不断改造和深入探索，目前已在EBV致病机理与潜在治疗研究方面取得了一系列进展。但我们要理性地认识到这种从基础到临床的转化并非一蹴而就，需要充分考虑和验证其潜在副作用，尤其在生物安全性方面对其潜在影响进行综合分析，在充分证实安全有效的前提下，谨慎推行CRISPR/Cas9技术在人类疾病相关研究领域的实践与探索，促进人类健康事业可持续发展。