苍术(Atractylodes lancea)为菊科苍术属多年生草本药用植物，以干燥根茎入药，是我国的大宗药材之一。其具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效，常用于治疗湿阻中焦、脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿躄、风湿痹痛、风寒感冒、夜盲、眼目昏涩等^[1]。我国南方种植的苍术种类多为茅苍术[Atractylodes lancea (Thunb.) DC.]，主要分布于江苏、浙江、山东、山西、湖北、四川和重庆等地^[2]。随着市场需求的增加，野生资源逐渐枯竭，人工栽培面积逐渐扩大，仅重庆地区的栽培总量就达到200 hm²。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是广泛分布的土壤微生物，能与90%以上的陆生和水生植物形成共生体，参与植物的生理代谢过程^[3-5]。AMF以其庞大的菌丝网络系统将植物与土壤有机地联合起来，增强植物对矿质营养和水分的吸收。郭兰萍等以苍术生物量为基础考察苍术菌根的依赖性，发现苍术对AMF依赖性很强，高达245%，表明接种AMF对苍术幼苗的生长有很大的促进作用^[6]。另外，接种摩西球囊霉(Glomus mosseae)可以促进苍术根系对土壤养分的吸收，提高苍术根际土壤微生物的多样性及代谢活性，促进苍术的营养生长^[6]，促进苍术苗挥发油积累^[7]。曾燕等在对丛枝菌根及其在中药栽培中的应用进行了讨论，认为AMF在药用植物的药效成分、抗逆性、连作障碍等方面具有积极作用，AMF在中药材栽培研究领域具有广泛的应用前景^[8]。目前国内外未见对茅苍术根际土壤AMF多样性研究的报道。

为了揭示重庆茅苍术主产区土壤AMF的结构与组成，解析土壤因子对AMF类群的影响，本研究以重庆不同地区种植的茅苍术根际土壤为材料，利用Illumina MiSeq 2500测序平台进行真菌扩增子测序，研究重庆地区茅苍术主产区AMF类群的结构组成、丰度和遗传多样性，并解析土壤因子对AMF类群的影响，以期为AMF资源发掘和物种多样性研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

NucleoSpin 96 Soil，Macherey-Nagel (MN)公司；KOD FX Neo，东洋纺(上海)生物科技有限公司；Phusion高保真酶、Monarch DNA胶回收试剂盒，NEB公司；DNA纯化试剂盒，Omega公司。96 Well PCR仪，AB公司；酶标仪，基因有限公司；NanoDrop 2000，Thermo公司；显微镜，Olympus公司；pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；火焰光度计，上海精科实业有限公司。

1.2 样地概况及样品采集

土壤样品于2019年9月采自重庆境内茅苍术主产区的5个区县，包括彭水县、秀山县、石柱县、南川区和酉阳县，栽培面积占重庆茅苍术总栽培面积的2/3。每个区县设一个采样点，随机选取3个茅苍术栽培地块，每个栽培地按5点取样法挖取5株茅苍术根际土混合均匀取一个样。每个区县取3个重复，共15个土壤样品，分别记为：PS (彭水县棣棠乡)、XS (秀山县回星村)、SZ (石柱县三河乡三店村)、NC (南川区金山镇小河坝社区)、YY (酉阳县木叶乡梨耳村)。所采样品均为以种根栽植2-3年的茅苍术根际土壤，均为砂壤土。取样时去除土壤表层的杂草、草根、石砾等杂物，挖出茅苍术植株，连带土壤一起装入无菌自封袋，随即带回实验室处理。收集粘附于根系表面的土壤作为根际土壤，用于检测分析AMF多样性，多余的土壤样品置于低温通风处风干保存，用于检测土壤基本理化性质、孢子密度，采样点基本信息见表 1。同时，将茅苍术新鲜的须根系剪下用FAA固定液固定，用于AMF菌丝及侵染情况观察。

1.3 土壤理化性质测定

pH值用pH计进行测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；速效钾采用乙酸铵-火焰光度计法测定；有机质采用重铬酸钾法测定。

1.4 茅苍术根系中AMF的侵染情况观察及根际土壤中AMF孢子密度(spore density)检测

采用墨水醋染色法测定菌根侵染率(公式1)^[9]：取FAA固定液固定后的根系，用自来水清洗干净，剪成1 cm小段。先用10% KOH溶液90 ℃水浴0.5-1.0 h，然后用蒸馏水漂洗干净；再用碱性双氧水(1 mL 10% NaOH+10 mL 10% H₂O₂加H₂O定容至200 mL)室温脱色30 min，用蒸馏水漂洗干净，控干水分；再用墨水醋(95 mL家用白醋+5 mL蓝黑墨水)煮开染色3-5 min，清水冲洗3-4次，此时的根段可放在水中保存；制片后在显微镜下检查每条根段的侵染情况(包括入侵点、菌丝、丛枝、泡囊等)，并记录拍照。

其中，0表示整条根段均未被侵染，10表示有10%长度根段被侵染形成菌根，20表示有20%长度根段被侵染形成菌根，以此类推，100则表示整条根段全部被侵染。

采用湿筛倾析-蔗糖离心法^[10]分离AMF孢子，在解剖镜下记录孢子数量(1个孢子果按1个孢子计数)。计算根际土壤中AMF的孢子密度(spore density)，以每10 g风干土样中含有的孢子数表示；采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行统计分析。

1.5 土壤总DNA的提取与测序

根际土中微生物DNA采用试剂盒NucleoSpin 96 Soil进行提取。提取的DNA在1.0%琼脂糖凝胶中通过电泳检测其质量，同时利用NanoDrop 2000测定其浓度，合格后用于构建文库。以各样品总DNA为模板，进行融合引物PCR。PCR扩增引物为丛枝菌根真菌AMF的特异性引物AMV4.5NF (5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′)和AMDGR (5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)^[11]。PCR反应体系(10 μL)：样品基因组DNA 50 ng，引物AMV4.5NF (10 μmol/L)和AMDGR (10 μmol/L)各0.3 μL，2×KOD FX Neo Buffer 5 μL，dNTPs (2 mmol/L) 2 μL，KOD FX Neo (1.0 U/μL) 0.2 μL，ddH₂O补足至10 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共25个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的纯度，采用DNA纯化试剂盒进行过柱纯化，纯化后作为二轮PCR扩增的模板，按PCR产物浓度进行等量混样，并再次纯化，用1.8%琼脂糖凝胶回收目的片段，在Illumina MiSeq 2500测序平台进行高通量测序。由北京百迈客生物科技有限公司完成测序，再对原始数据进行拼接，将拼接得到的序列进行质量过滤，并去除嵌合体，得到高质量的Tags序列。在相似性97%的水平上对序列进行聚类，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU。并使用BLAST比对MaarjAM分类学数据库，移除非AMF的OTU，再次比对，对OTU进行分类学注释。

1.6 分析方法

采用Mothur (V1.30)软件对样品α多样性指数进行评估。采用ANOVA对土壤理化性质、AMF多样性指数以及物种的组间差异进行统计分析。用到的绘图工具有R语言、Python语言等。

2 结果与分析 2.1 土壤理化性质

由表 2可知，重庆地区茅苍术主产地土壤均为酸性土壤，pH范围是4.63-6.32。除秀山的栽培地土壤碱解氮为缺氮水平，其余4个区县均属中等水平。5个区县采样点土壤有效磷和速效钾含量均为丰富，而从有机质来看，除石柱的栽培地土壤属于中等肥力水平外，其余4个区县茅苍术栽培地土壤均属于高肥力水平。

(1)

2.2 茅苍术根系的AMF侵染率及土壤孢子含量

重庆5个区县的茅苍术栽培地均存在AMF，而且茅苍术根系受到AMF的侵染(表 3)。5个区县茅苍术的AMF侵染率均在50%以上，秀山(XS)和酉阳(YY)的茅苍术菌根侵染率均大于90%。另外，各采样点AMF土壤孢子含量丰富，均在每10 g风干土壤50个以上，最高达到144个。此外，茅苍术菌根侵染率与土壤AMF孢子含量变化趋势基本相同，XS、SZ和YY地区的茅苍术菌根侵染率和孢子密度均显著高于PS和NC地区。

2.3 序列统计分析

所有样品经PCR检测合格后构建文库并测序。由表 4可知，各采样点的土壤样品获得的有效序列数差异明显，均在5万条以上，以酉阳县茅苍术根际土壤测得的有效序列数最多，为60 751条。各采样点土壤样品的有效序列百分比均在90%以上，平均序列长度在217-220 bp之间。

2.4 稀释曲线分析

Shannon指数稀释曲线反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。由图 1可知，各采样点供试样品的稀释曲线已趋于平滑，表明样品测序数据量足够大，测得的数据能反映土壤中AMF群落的真实情况，可进行数据分析。另外，由图 1可知，各采样点土样的Shannon指数XS > YY > PS > NC > SZ，说明各采样点AMF多样性由高到低依次为XS、YY、PS、NC、SZ。

2.5 α多样性分析

统计了各样品的OTU覆盖率(coverage)，均在0.999 3-0.999 7之间，说明本次检测结果能代表样本中AMF的多样性。α多样性用于反映样品物种丰度及多样性，多样性指标包括均匀度指数ACE、丰度指数Chao1、多样性指数Simpson和Shannon。由表 5可知，各采样点间OTU和均匀度指数ACE无显著性差异。丰度指数Chao1显示，茅苍术根际土壤的AMF丰度依次为SZ > XS > YY > NC > PS。除SZ地区显著高于PS地区外，其余采样点间差异性均不显著。另外，Shannon指数显示XS地区显著高于其他采样点，其他采样点间Shannon指数差异不显著；而Simpson指数则相反，XS地区显著低于其他采样点。Simpson和Shannon指数均表明XS地区茅苍术根际土壤的AMF多样性最高，其次为YY地区。这与图 2中各采样点的AMF种类统计结果一致，XS地区土样中AMF种类最多，共检测到73种；其次为YY地区，共66种。

2.6 OTU聚类及物种注释分析

从5个采样点的15个土样中共获得461个OTU，除6.47%未注释到的OTU外，其余OTU经序列比对归为球囊菌门(Glomeromycota)的3纲4目8科9属83种AMF (图 2、表 6)。其中，Glomus相对丰度最高，占所有AMF总量的67%，是所有样品的优势属；其次是Paraglomus和Claroideoglomus，3属之和在所有土样中占AMF总量的96%。

如图 3所示，将已对比的序列按属分类水平进行统计分析可知，5个样地的供试样品中AMF属组成不同，采样点SZ和YY的供试样品中9个属的AMF均被检测到，采样点NC和PS未检出Acaulospora，采样点XS未检出Diversispora和Scutellospora，其余6个属为5个采样点共有。由图 3可知，不同采样点各属的相对丰度也存在差异，说明茅苍术根际AMF群落结构存在地理分布差异。

2.7 土壤因子与AMF相关性分析

冗余度分析(redundancy analysis，RDA)土壤因子pH、有机质(organic matter)、碱解氮(available N)、速效钾(available K)、有效磷(available P)与AMF多样性之间的相关性(图 4)可知，两轴累积解释信息量达42.5%，所有环境变量中土壤pH对AMF多样性和丰度影响最大。pH、有机质、碱解氮、速效钾与AMF多样性(Shannon指数)呈正相关，而有效磷与之呈负相关；5个土壤因子均与丰度(Chao1指数)呈负相关；pH和有机质与均匀度(ACE指数)呈正相关，而碱解氮、速效钾、有效磷与之呈负相关。另外，图 4横坐标从左至右表示Shannon指数逐渐增加，表明各采样点的AMF多样性XS > YY > PS > NC > SZ。

3 讨论与结论 3.1 茅苍术根际土壤AMF资源丰富，二者能很好地形成共生体

AMF是土壤微生物区系中分布最广泛的一类菌根真菌，地球上90%的维管植物都能形成丛枝菌根^[12]。但AMF在中药材研究领域的应用时间较短，主要集中在已知的AMF对中药材中生长、物质积累的影响及对病虫害防治的作用等方面^[13-14]，而且基本都处于起步阶段，有待更深入的研究。国内学者采用传统的形态鉴定法对40多种药用植物进行了丛枝菌根研究，共分离鉴定到20多种AMF^[15]。传统培养法无法准确反映土壤中真菌的真实情况，仅能反映占土壤真菌总量1%的可培养真菌的状况^[16]。因此，本研究首次采用高通量测序技术检测分析了重庆地区中药材茅苍术根际土壤AMF多样性，发现各采样点AMF群落组成相似，相对丰度存在较大差异，所有样品共检测到8科9属AMF。其中Glomus相对丰度最高，达到67%，是所有样品的优势属。王永明等对中国区域内已报道的AMF进行了归类总结，发现我国境内已报道的AMF有145种，隶属于8科12属，而且Glomus为我国境内AMF的优势属，占所有种的71%^[17]。本研究检测到的AMF种占我国已知AMF种的57.24%，且优势属与王永明等的研究结论一致。结合茅苍术的菌根侵染率和土壤孢子含量可以得出结论：茅苍术根际土壤AMF资源丰富，能与AMF很好地形成共生体，而且对AMF具有较高菌根依赖性。

3.2 土壤因子与AMF物种多样性的关系

AMF是土壤习居菌，其生长发育和生理功能取决于自身和寄主植物的特性、环境因子以及农业措施等^[12]。有研究发现土壤理化性质和环境条件对AMF群落的影响比寄主植物更大^[18-19]。本研究中同一植物不同采样点AMF的丰度(Chao1)指数、多样性指数Simpson和Shannon均存在显著差异，说明土壤理化性质和环境因子对AMF的分布影响较大。相关性分析结果显示，土壤pH对AMF多样性和丰度影响最大，pH与Shannon指数呈正相关，与丰度(Chao1)指数呈负相关。郭兰萍等的研究表明茅苍术在生长发育过程中土壤酸化严重^[20]，本研究中5个采样点的土壤pH均为酸性，在4.63-6.32之间，与其研究结果一致。一般来说，中性至微酸性土壤有利于AM菌根的发育^[12]。这可能是重庆地区茅苍术菌根侵染率高，根际土壤AMF多样性丰富的重要原因之一。

另外，AMF作为土壤中的主要微生物群体，其群落组成及丰度必然会受到土壤中有机质、N、P、K含量的影响。本研究结果表明有机质、碱解氮和速效钾与AMF的Shannon指数呈正相关，与丰度(Chao1)指数呈负相关。研究报道AMF在土壤中具有一定的腐生生长能力，而有机质在这一过程中可能起着重要作用，在一定范围内AMF的丰度会随有机质含量的升高而增大^[14]。与张之为等对马铃薯的研究结果一致，在一定范围内土壤N和K含量增加会使AMF丰度和多样性增高^[21]。可能是由于根部药材茅苍术在温度较高的九月时，植株生长和根部膨大需要大量的N和K，共生菌AMF帮助寄主吸收更多的N和K，寄主茅苍术再为AMF提供更多的养分使其增长繁殖，从而使AMF丰度和多样性增加。本研究结果中有效磷与Shannon和Chao1指数均呈负相关，而且AMF丰度和多样性较高的2个采样点有效P含量均显著低于其他3个采样点，这与Tawaraya等的研究结果^[22]一致，土壤磷含量过高往往会抑制AMF的发育和功能。总之，土壤速效养分对AMF群落结构和丰度影响显著，各采样点间土壤养分的差异可能是导致AMF群落结构地理格局差异的重要原因之一。本研究可为今后研究AMF与植物之间的共生，筛选其共生体适宜的培养基质提供参考。

综上所述，茅苍术根际土壤AMF资源丰富，不同地理分布的AMF群落组成和丰度存在差异，土壤pH和速效养分与AMF群落结构的地理格局差异密切相关。深入研究土壤因子与AMF多样性和丰度的关系，可为进一步探索AMF在中药材栽培中的作用提供良好的基础。