植物病害是降低农业生产能力的主要因素之一^[1]。平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌能引起许多禾本科植物的严重病害，导致叶斑、根腐、穗腐、种子变色、霉变等，造成巨大的经济损失；除引起植物病害外，其个别种类能够引起人或动物的病害^[2-3]。弯曲平脐蠕孢是平脐蠕孢属真菌的一种，主要引起玉米弯孢叶斑病^[4]。

作为世界三大谷类作物之一，玉米(Zea mays L.)在世界农业生产中占有举足轻重的作用，可以粮饲兼用。玉米是我国三大粮食品种之一，在玉米生产中，病虫害等多种因素严重制约着玉米的产量和品质。玉米病害已成为我国玉米种植业减产、减收的最主要问题，严重影响着玉米的产量^[5]。玉米弯孢叶斑病是近年来发生在我国玉米生产上的一种新型病害^[6]。该病发生在玉米成株期，主要危害叶片，有时也危害叶鞘和苞叶^[7]，是突发性病害，蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，重病地块病株率及病叶率高达50%，已成为我国玉米产区的重要病害之一^[8-9]。17世纪70–80年代我国出现有关玉米弯孢叶斑病的描述性记载，1956年国外出现该病发生的报道^[10]。20世纪90年代以来，玉米弯孢叶斑病先后在辽宁、河南、河北、山东等多省暴发流行，造成严重玉米产量损失^[11]。作为引起玉米弯孢叶斑病的主要病原，弯曲平脐蠕孢的防治迫在眉睫^[12]。

由于化学杀菌剂引起的植物病原真菌耐药性增强，以及农药残留产生的环境污染等问题，农业病害的生物防治逐渐成为国内外研究的热点^[13-16]。细菌由于种类多、分布广、繁殖速度快、易于人工培养扩繁、对植物的微生态比较适宜、既能防病又能促进植物生长等特点，成为生物防治的理想工具^[17-18]。

目前成功应用于植物病害防治的生防细菌主要来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)；此外，沙雷氏菌属(Serratia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和巴氏杆菌属(Pasteuria)也常用作生防菌^{[17, 19-20]}。例如，芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A13菌系表现出对多种植物病原菌的抑菌效果，并且促进燕麦、胡萝卜和花生高效增产；芽孢杆菌Rb2和Rb6菌液浸种处理，对小麦苗期纹枯病表现出较高防效，其代谢产物浸种防效可达70%^[18]。枯草芽孢杆菌B916发酵液对水稻纹枯病的防效可高达80%^[21]。生防细菌在防治植物病害、提高农业产量方面获得了显著成就。

本研究从玉米田地表下土壤分离获得22株细菌菌株，通过平板对峙法从中筛选出一株对玉米弯孢叶斑病具有较高拮抗活性的菌株L-14，并对其抑菌机理进行了初步研究，以期获得该菌株的基本信息，丰富玉米叶斑病的生物防治资源，为新型抗菌药物的研究奠定理论基础，并为其实际应用提供基础平台。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

弯曲平脐蠕孢(Bipolaris papendorfii)、层出镰孢(Fusarium proliferatum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)均由本实验室保存。

1.2 培养基

LB培养基(g/L)：胰化蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。1×10⁵ Pa高压灭菌20 min，用于后续拮抗细菌的发酵。

PDA培养基(g/L)：葡萄糖20.0，土豆200.0，琼脂糖13.0。1×10⁵ Pa高压灭菌20 min，用于弯曲平脐蠕孢的培养。

1.3 主要试剂和仪器

基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；2×PCR Mix，北京擎科生物技术有限公司；细菌理化性质检测试剂条，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR仪、凝胶成像系统，Bio-Rad公司；电泳仪EPS 300，上海天能科技有限公司；超净工作台，北京半导体设备一厂。

1.4 菌株的分离

采取稀释法，将玉米田地表以下5-25 cm处土壤样品(1 g)用无菌水(10 mL)制备土壤稀释液(1 g/10 mL)，分10倍浓度梯度涂布于LB固体培养基上，室温培养2 d。根据菌落形态，挑取不同类型单菌落在相同培养基平板上进行划线培养并纯化菌株。

1.5 弯曲平脐蠕孢拮抗菌株的筛选

根据平板对峙法^[22]，将弯曲平脐蠕孢菌盘接种在PDA固体培养基中心，距离菌盘3 cm处接种已纯化的细菌，25 ℃黑暗连续培养15 d，观察抑菌效果。

1.6 拮抗细菌形态观察及生理生化特性分析

对细菌菌落形态大小、菌落表面光泽、凹凸度、菌落边缘平整性以及透明度进行观察；通过结晶紫染色法对菌体及芽孢进行形态学观察。参照《常见细菌系统鉴定手册》^[23]对菌株进行生理生化性质测定。

1.7 拮抗细菌16S rRNA基因检测

采用SDS-CTAB法提取细菌基因组DNA^[24]。以细菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增菌株的16S rRNA基因，所用引物为27F (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CTACGGC TACCTTGTTACGA-3′)。PCR反应体系(50 μL)：27F (10 μmol/L) 1 μL，1492R (10 μmol/L) 1 μL，DNA模板2 μL，2×PCR Mix 25 μL，dd H₂O 21 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共34个循环；72 ℃ 15 min，16 ℃ 10 min。

PCR扩增产物经纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将所测得的16S rRNA基因序列在GenBank数据库中，通过核酸BLASTn相似性比对，通过MEGA 5.0软件进行DNA多序列同源性分析，采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育进化树，确定菌株的分类地位^[25]。

1.8 拮抗细菌生长曲线的测定

挑取单克隆接种于20 mL/50 mL LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h后获得种子液。将菌株种子液按2%的接种量扩大培养至50 mL/250 mL基础培养液中，37 ℃、200 r/min继续振荡培养，每隔2 h取出2 mL菌液检测OD₆₀₀吸光度。平行设置3组试验，获取数据后绘制菌株的生长曲线。

1.9 拮抗细菌对弯曲平脐蠕孢菌丝形态的影响

采用平板对峙法，25 ℃恒温培养箱内将菌株与弯曲平脐蠕孢对峙培养，15 d后分别挑取抑菌圈边缘基内菌丝和气生菌丝进行显微观察。试验设置3个重复。

1.10 拮抗细菌对弯曲平脐蠕孢孢子萌发的影响

取培养15 d的弯曲平脐蠕孢，向平皿中加入5.0 mL的无菌水，去尖枪头刮取病菌分生孢子制备孢悬液。取灭菌的凹玻片，加入弯曲平脐蠕孢孢悬液与细菌发酵粗提液以等体积混合制备混合液，以只加弯曲平脐蠕孢孢悬液为对照，25 ℃孵育4 h，观察孢子萌发情况。

1.11 拮抗细菌的抗菌谱测定

通过平板对峙法，将筛选得到的14号菌株与直径为8 mm的供试植物病原真菌进行对峙培养，25 ℃恒温孵箱连续培养15 d后观察抑菌效果。每组试验均设置3次重复。

2 结果与分析 2.1 弯曲平脐蠕孢拮抗细菌的筛选

从土壤中分离到22株细菌，通过平板对峙法检测每株菌对弯曲平脐蠕孢菌(B. papendorfii)的拮抗作用，发现菌株L-14对弯曲平脐蠕孢菌具有较明显的抑菌效果(图 1)。

2.2 拮抗细菌的抗菌谱

利用平板对峙法，发现菌株L-14具有较广的抗菌谱，表现出对层出镰孢(F. proliferatum)、大斑凸脐蠕孢(E. turcicum)、禾谷镰孢(F. graminearum)、弯曲平脐蠕孢菌(B. papendorfii)和灰霉病菌(B. cinerea)等5种植物病原真菌均有强烈的拮抗作用(图 2)。

2.3 拮抗细菌的形态观察及生理生化特性分析

2.3.1 形态特征

菌株L-14在LB固体培养基上呈现有光泽的白色菌落，菌落隆起但不明显，表面干燥且边缘不规则(图 3)。结晶紫染色表明其菌体呈直杆状，圆形芽孢，芽孢中生。因此，根据菌落形态初步鉴定菌株L-14为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

2.3.2 生理生化特性

参照《常见细菌系统鉴定手册》^[23]鉴定方法，对菌株L-14进行生理生化鉴定，结果显示该菌株淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐利用、过氧化氢还原酶、V.P.测定等为阳性，与枯草芽孢杆菌具有相同的生理生化特性(表 1)。

2.4 菌株L-14的16S rRNA基因序列分析

将菌株L-14的16S rRNA基因测序结果提交GenBank，获得登录号为MT131171，序列长度为1 417 bp。在NCBI数据库中对菌株16S rRNA基因序列进行BLASTn比对，比对结果显示菌株L-14与编号为ATCC 6633的枯草芽孢杆菌序列相似度高达100%。通过MEGA 5.0软件对相近序列构建系统发育树，结果显示菌株L-14与枯草芽孢杆菌可聚在同一进化分支上(图 4)。综上所述，通过菌落形态特征、生理生化指标分析以及分子进化分析，鉴定菌株L-14为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。

2.5 生长曲线的测定

菌株L-14的生长曲线分布为：0-4 h为延迟期，4-12 h为菌体对数生长期，14-26 h为稳定期，26 h后菌体生长进入衰亡期(图 5)。因此取10 h的对数生长期发酵液作为种子液进行发酵试验。

2.6 菌株L-14对弯曲平脐蠕孢菌丝形态的影响

实验结果表明，菌株L-14发酵液的蛋白粗提物对弯曲平脐蠕孢气生菌丝形态无明显影响，但对基内菌丝影响显著。与未处理的基内菌丝作为对照，菌株L-14发酵液的蛋白粗提物处理的基内菌丝细胞膨大，呈现明显畸变的呈串珠状排列(图 6)。

2.7 菌株L-14对弯曲平脐蠕孢孢子萌发的影响

如图 7所示，菌株L-14发酵液蛋白粗提物能显著抑制弯曲平脐蠕孢分生孢子萌发。将未处理组作为对照，培养至20 h，对照组孢子已萌发，而菌株L-14发酵液蛋白粗提物处理组中的弯曲平脐蠕孢孢子末端仍呈现末端膨大，出现囊泡状结构，未正常萌发。

3 讨论与结论

芽孢杆菌是自然界分布较为广泛的细菌，不仅存在于土壤、植物根际和体表，还是常见的植物内生细菌。研究表明，芽孢细菌不仅可促进植物生长，其产生的抗菌物质也已成功应用在植物病害防治领域^[26]。芽孢杆菌对人畜无毒害作用、不污染环境、抗逆性极强，是目前极有应用前景的一类微生物。分离芽孢细菌拮抗植物病原菌物质并研究其拮抗机制，对植物病害防控具有重要的应用价值，而且为抗菌物质信号途径的基因克隆、进一步构建转基因工程菌以及应用菌株的改造奠定基础。

本研究筛选得到的弯曲平脐蠕孢拮抗细菌L-14为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)，其对层出镰孢(F. proliferatum)、玉米大斑病菌(S. turcica)、禾谷镰孢(F. graminearum)和灰霉病菌(B. cinerea)等均具有较好的拮抗活性，其胞外活性物质可导致弯曲平脐蠕孢菌丝及芽管膨大、畸形。而且，菌株L-14发酵液粗提物能导致弯曲平脐蠕孢的基内菌丝显著畸变，呈现无功能的串珠状，分生孢子萌发异常，阻断其附着胞的发育，推测菌株L-14的分泌物可能通过破坏弯曲平脐蠕孢的细胞壁完整性，造成其菌丝畸形及芽管无法正常延伸。有研究^[27]表明，芽孢杆菌会通过影响真菌细胞壁，从而破坏其菌丝形态。孔建等^[28]研究发现，来自枯草芽胞杆菌B-903的抗生素可溶解镰刀菌菌丝细胞壁，造成菌丝畸形。翟茹环等^[29]曾报道枯草芽胞杆菌G8发酵滤液可使黄瓜菌核病菌菌丝溶解，造成原生质渗漏，形成空泡细胞。邢介帅等^[30]发现枯草芽胞杆菌T2所产生的蛋白酶能显著降解棉花枯萎病菌细胞壁蛋白，产生畸形菌丝。Deleu等^[31]研究表明枯草芽胞杆菌所产生的脂肽类抗菌物质能直接作用于病原菌细胞膜，改变细胞膜的结构，从而达到抑菌效果。冯俊涛等^[32]利用枯茗酸抑制辣椒疫的研究中发现其作用靶点可能为细胞膜和细胞壁。对于菌株L-14的作用机理，我们将在进一步的实验中通过更多的生物化学实验及分子生物学方法加以验证。