2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 吴昊, 黄嘉苇, 张文立, 沐万孟
- WU Hao, HUANG Jia-Wei, ZHANG Wen-Li, MU Wan-Meng
- 重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖
- One-pot production of D-mannose from D-glucose by recombinant co-expressing Escherichia coli cells
- 微生物学通报, 2020, 47(7): 2151-2160
- Microbiology China, 2020, 47(7): 2151-2160
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200226
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文章历史
- 收稿日期: 2020-03-13
- 接受日期: 2020-05-24
- 网络首发日期: 2020-06-15
2. 江南大学食品安全国际合作联合实验室 江苏 无锡 214122
2. International Joint Laboratory on Food Safety, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
近年来，超重和肥胖正成为全球性的健康问题，因为其增加了患心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和代谢综合征的风险[1]。这些疾病的原因多是因为不良的饮食习惯以及高糖和高脂肪食物的过量摄入[2]。因此，寻找低甜度的蔗糖替代品，开发具有生理价值的功能食品成为了食品工业的重要目标[3]。
D-甘露糖是D-葡萄糖在C-2位的差向异构体，也是D-果糖的醛糖异构体。其甜度相当于蔗糖甜度的60%，并且甜度不会随浓度的增加而增加[4]。此外，D-甘露糖热值为3.75 kcal/g，低于其他糖类[5]。自然界中D-甘露糖天然存在于甘露聚糖、半纤维素和纤维素中[6]。D-甘露糖具有的这些重要的生理功能，使其可作为膳食补充剂对人体健康做出贡献。D-甘露糖已被证明是合成维生素[7]、抗肿瘤药[8]和免疫刺激剂[9]的重要前体。此外，D-甘露糖也被认为是工业生产功能性甜味剂D-甘露糖醇的最佳原料[10]。因此，D-甘露糖在食品和医疗工业中得到广泛应用，近年来引起人们的广泛关注。
目前，D-甘露糖的生产方法主要是天然提取法和化学合成法。例如，利用微波辅助结合硫酸处理法从脱蛋白的棕榈仁中提取D-甘露糖，当底物与溶剂的质量体积比为1:49.69时，在148 ℃条件下连续处理约10 min，D-甘露糖的回收率达到92.11%[11]。在98 ℃、pH 2.0条件下，55%浓度的D-葡萄糖加入钼酸铵催化剂反应约150 min后，可获得32.6%的D-甘露糖[12]。然而，天然提取法由于被提取植物细胞壁中较高的结晶度和聚合作用，使用酸水解和热水解从含甘露聚糖的材料中提取D-甘露糖又需要高温等严格的条件，大大提高了提取成本[6]。另外，D-甘露糖的化学合成涉及复杂的反应，该反应通常在高温和强酸性环境下进行，并且需要用到一种或几种催化剂的参与，在制造过程中增加了副产物和有害污染物的产生[6]。
生物转化法因其温和的反应条件和较少的有害副产物，越来越受到广泛的关注。目前，以D-果糖或D-葡萄糖为底物，可以使用4种类型的酶来生产D-甘露糖：包括D-来苏糖异构酶(D-lyxose isomerase，D-LIase，EC 5.3.1.15)[13-14]、D-甘露糖异构酶(D-mannose isomerase，D-MIase，EC 5.3.1.7)[15-16]、纤维二糖2-差向异构酶(cellobiose 2-epimerase，CEase，EC 5.1.3.11)[17]和D-甘露糖2-差向异构酶(D-mannose 2-epimerase，D-MEase，EC 5.1.3)[18]。其中，D-LIase和D-MIase可以催化D-果糖异构化为D-甘露糖。然而，D-果糖的价格略高于D-葡萄糖，这将增加工业生产的成本。此外，尽管D-MEase和CEase可以催化D-葡萄糖向D-甘露糖的差向异构化，但是该过程产生了较多的副产物D-果糖。
当前，两步异构化法反应可利用较廉价的单糖转化生产得到较高价值的糖，因此可作为工业上生产重要糖的替代方法。例如Patel等利用D-木糖异构酶(D-xylose isomerase, D-XIase)和D-LIase体外催化，以D-木糖为底物生产D-来苏糖[19]。其中，D-XIase可将D-木糖转化为D-木酮糖，随后D-LIase将中间体D-木酮糖转化为D-来苏糖。类似地，可使用D-葡萄糖异构酶(D-glucose isomerase，D-GIase)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase)从D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖[20]。D-GIase将D-葡萄糖转化为D-果糖，然后通过DPEase将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖。因此，理论上利用D-GIase和D-LIase从D-葡萄糖生产D-甘露糖是一种可行的策略(图 1)。
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| 图 1 D-葡萄糖异构酶和D-来苏糖异构酶组成的共表达系统由D-葡萄糖生产D-甘露糖反应示意图 Figure 1 The reaction diagram of D-mannose production from D-glucose using co-expression system consisting of D-glucose isomerase (D-GIase) and D-lyxose isomerase (D-LIase) |
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来源于Acidothermus cellulolyticus的D-GIase在高温和弱酸环境中稳定，并且当Co2+和Mg2+存在时，在80 ℃和pH 6.5条件下表现出最大活性[21]。来源于Peptococcaceae bacterium 1109的D-LIase在70 ℃和pH 7.5条件下加入Co2+显示出最大活性[22]。在本研究中，将上述两种已报道的D-GIase和D-LIase重组酶基因片段克隆并转化连接至质粒中，所形成的重组质粒pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI进一步导入到Escherichia coli BL21(DE3)中共表达。之后对共表达反应体系生产D-甘露糖的最适温度、pH和金属离子依赖性进行研究。此外，还利用构建的共表达细胞E. coli BL21(DE3)以D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。我们的研究提供了利用在同一细胞中共表达D-GIase和D-LIase，并通过一锅法从D-葡萄糖生产D-甘露糖的新思路，这项研究以期为在工业生产D-甘露糖提供了可行的应用前景。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒实验室所用菌株E. coli BL21(DE3)和E. coli DH5α购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。表达载体pCDFDuet-1购买自上海捷瑞生物工程有限公司。
1.1.2 培养基LB液体培养基(g/L)：酵母提取物5.0，氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0。pH到7.0，1.0×105 Pa灭菌20 min。链霉素终浓度为100 μg/mL。
LB固体培养基(g/L)：酵母提取物5.0，氯化钠10.0，胰蛋白胨10.0，琼脂粉15.0。pH到7.0，1.0×105 Pa灭菌20 min。链霉素终浓度为200 μg/mL。
1.1.3 主要试剂和仪器酵母提取物、胰蛋白胨、链霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，生工生物工程(上海)股份有限公司；D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖，Sigma-Aldrich公司；其他化学试剂为分析纯。
pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；蛋白电泳设备、凝胶成像系统，Bio-Rad公司；高效液相色谱仪(HPLC)、Carbomix Ca-NP10色谱柱、示差折光检测器(RI)，Waters公司。
1.2 方法 1.2.1 共表达体系的构建D-GIase来自A. cellulolyticus (GenBank登录号为ABK53836)，经测算其基因片段全长1 224 bp，可编码407个氨基酸。D-LIase来自P. bacterium (GenBank登录号为KLU40859.1)，经测算其基因片段全长为543 bp，可编码180个氨基酸。将D-GIase和D-LIase基因序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因序列中分别含有Nco I和Hind Ⅲ及Nde I和Xho I酶切位点。将合成的基因片段运用双酶切手段依次将D-GIase和D-LIase基因片段连接至同样双酶切后的pCDFDuet-1质粒，并分别插入到限制性酶切位点Nco I和Hind Ⅲ及Nde I和Xho I，得到重组质粒pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI (图 2)，具体实验操作可参考文献[21]。
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| 图 2 重组质粒pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI的构建 Figure 2 Constructed recombinant plasmid pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI |
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将重组质粒导入到E. coli BL21(DE3)中，并涂布在含链霉素终浓度为200 μg/mL的LB固体培养基平板上，37 ℃培养过夜，由于pCDFDuet-Acce- DGI/Deba-DLI载体上含有抗链霉素基因片段，成功转化的菌体会在平板上形成菌落。挑取成功转化的重组菌单菌落，接种到4 mL含链霉素终浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中，并在37 ℃、200 r/min培养过夜，然后将4 mL种子液全部转移到200 mL含链霉素的LB液体培养基中，同样条件下继续培养到OD600约为0.6-0.8时，添加IPTG至终浓度为1 mmol/L，将摇瓶转移至28 ℃、200 r/min诱导培养6 h，并且在0、2、4、6 h取样保留。之后8 000 r/min离心5 min收集菌体，并用超纯水洗涤2次以除去残留的培养基，将重组菌体放在低温冷藏。
1.2.2 D-GIase和D-LIase的蛋白分子量测定通过SDS-PAGE电泳检测D-GIase和D-LIase的表达效果，分离胶和浓缩胶的丙烯酰胺以12% (质量体积比)和4% (质量体积比)比例配制，将1.2.1中在0、2、4、6 h的取样样品处理后上样完成SDS-PAGE过程。电泳结束后用考马斯亮蓝染色1-3 h至深蓝色，然后用脱色液脱色至透明，通过与标准蛋白Marker以及分别表达纯化的D-GIase和D-LIase来确定细胞内重组蛋白的成功表达。
1.2.3 共表达体系酶活性测定构建反应体系1 mL：50 mmol/L PBS (pH 6.0)，50 g/L D-葡萄糖，1 mmol/L Co2+，20 g/L湿重菌体细胞[20, 23]。将反应体系在70 ℃下反应30 min后通过10 min沸水浴终止反应，使用HPLC检测D-甘露糖的生成量。
D-甘露糖检测：将反应体系4 ℃、12 000 r/min离心5 min取上清液，用0.22 μm微滤膜过滤，将过滤液稀释进行HPLC检测。检测条件：Waters高效液相色谱仪，示差折光检测器(RI)，Carbomix Ca-NP10离子色谱柱(10 μm，7.8×300 mm)，流动相为超纯水，柱温85 ℃，流速0.6 mL/min。
1.2.4 温度对共表达体系酶活性的影响测定最适温度测定：将pH 6.0的1 mL反应体系(50 mmol/L PBS，50 g/L D-葡萄糖，1 mmol/L Co2+，20 g/L湿重菌体细胞)分别在40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃的水浴锅环境中反应，并将结果中的最高活性设定为相对活性100%。
热稳定性测定：将共表达体系大肠杆菌细胞在50、55、60、65 ℃条件下孵育，定时取样加入到1 mL反应体系中，测定不同温度取样的活性，并将初始酶活设定为相对活性100%，对相对活性作图，研究大肠杆菌细胞中共表达酶的热稳定性。
1.2.5 pH对共表达体系酶活性的影响测定配制3种缓冲液系统(50 mmol/L)：醋酸盐缓冲液(pH 5.0–6.0)，磷酸盐缓冲液(pH 6.0–7.5)和Tris-HCl缓冲液(pH 7.5–9.0)。将反应体系置于70 ℃不同pH条件下进行反应，并将结果中的最高活性设定为相对活性100%。
1.2.6 金属离子对共表达体系酶活性的影响测定将不同浓度的金属离子Co2+、Ba2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+分别加入到反应体系中，每种金属离子在不同反应系统中的终浓度分别为0.5、1.0、3.0、5.0 mmol/L。在最适条件下，将测得的活性进行比较，并将不添加金属离子的一组设定为相对活性100%。
1.2.7 以D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖的研究研究共表达大肠杆菌细胞以D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖，在上述测定的最佳条件下(pH 6.0，70 ℃)，50 g/L菌体细胞，1.0 mmol/L Co2+，以不同初始浓度100、300、500 g/L的D-葡萄糖作为底物，定时从反应体系中取样，使用HPLC检测D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的时间变化过程，直至反应达到平衡。
2 结果与讨论 2.1 带有pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI载体的大肠杆菌细胞共表达经过SDS-PAGE蛋白电泳检测(图 3)，得到两条明显较宽的蛋白条带，经测算在该处D-GIase和D-LIase的分子量大小分别约为42 kD和21 kD，与先前报道[21-22]基本一致，并且随着诱导时间的延长，该处的条带逐渐加宽，表明D-GIase和D-LIase成功表达，共表达效果较好。此外，液相结果表明D-GIase和D-LIase均在重组大肠杆菌细胞中共表达，并表现出适当的催化活性(图 4)。
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| 图 3 共表达D-GIase和D-LIase的SDS-PAGE电泳图 Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis of the co-expressing D-GIase and D-LIase 注：M：标准蛋白；1-4：加入IPTG诱导0、2、4、6 h的全细胞；5-6：纯化蛋白：D-LIase和D-GIase. Note: M: Protein Marker; 1-4: The cells after IPTG induction for 0, 2, 4, 6 h, respectively; 5-6: Purified protein: D-LIase and D-GIase. |
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| 图 4 共表达细胞催化活性液相检测情况 Figure 4 The HPLC results of catalytic activity of co-expressing cells 注：A：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖标准品水溶液液相图；B：未含D-GIase和D-LIase的大肠杆菌细胞转化D-葡萄糖液相图；C：含D-GIase和D-LIase的大肠杆菌细胞转化D-葡萄糖液相图. Note: A: The HPLC results of mixed standard sample of D-glucose, D-mannose and D-fructose dissolved in deionized water; B: Reaction with E. coli cells not harboring D-GIase and D-LIase; C: Reaction with E. coli cells harboring D-GIase and D-LIase. |
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温度在酶促反应中起着重要的作用，是影响催化效率和反应平衡的重要条件之一[24]。温度对共表达体系酶活性的影响如图 5A所示。共表达体系的最适温度为70 ℃，与P. bacterium D-LIase的最适温度[22]相同，但低于A. cellulolyticus D-GIase的最适温度(80 ℃)[21]。温度在60-75 ℃范围内，共表达体系酶的活性可保持最大活性的60%以上，在80 ℃时失活。
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| 图 5 温度对共表达体系酶活性的影响 Figure 5 Effect of temperatures on the activity of the co-expression enzymes 注：A：共表达体系酶的最适温度；B：共表达体系酶的温度稳定性. Note: A: The optimal temperature of the co-expression enzymes; B: The thermostability of the co-expression enzymes. |
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图 5B显示了共表达体系酶分别在50、55、60、65 ℃条件下孵育后的热稳定性情况。总体观察当温度小于60 ℃时，共表达体系酶表现出相对较好的热稳定性。将共表达体系酶在50、55、60 ℃下孵育2 h后，共表达体系酶的相对活性分别降低至最大活性的52%、37%和33%。在50、55、60、65 ℃下，D-GIase和D-LIase共表达系统的衰减常数(kd)为0.391 8、0.492 5、0.661 0、1.018 3 h-1，根据公式t1/2=ln2/kd计算出相应的半衰期分别为1.77、1.41、1.05、0.68 h。
2.3 pH对共表达体系酶活性的影响从图 6可知，共表达体系酶的最适pH为6.0 (磷酸盐缓冲体系)，低于游离A. cellulolyticus D-GIase (pH 6.5)[21]和游离P. bacterium D-LIase (pH 7.5)[22]，并且在pH值为6.5和7.0时可分别保持最大活性的90%和52%，但当pH值为5.5和7.5时，相对活性急剧降低，分别为21%和11%。上述结果表明共表达体系酶的活性容易受pH的影响，在弱酸环境(pH 6.0-6.5)条件下可以保持较大活性。该性质对于D-甘露糖的生产是有益的，因为略带酸性的环境可以有效抑制碳水化合物的美拉德(褐变)反应，防止产生非酶褐变和减少副产物的产生，从而证明了其在工业生产D-甘露糖中的潜在价值。
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| 图 6 pH对共表达体系酶活性的影响 Figure 6 Effect of pH on the activity of the co-expression enzymes |
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金属离子在催化过程中通常作为辅助因子或激活剂，在酶的催化反应中起着非常关键的作用。本文研究了不同二价金属离子对共表达体系酶催化活力的影响，以未添加金属离子的反应系统作为空白对照组，从表 1可以看出，金属离子对共表达体系酶的催化活力有比较大的影响。当Cu2+、Ca2+、Ba2+存在时，没有表现出对共表达体系酶活性的影响；当Co2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+这些金属离子存在时均不同程度地提高了共表达体系酶的活性，其中Co2+存在时共表达体系酶表现出最大活性，与先前报道[21-22]一致，而未添加金属离子的对照组，未表现出任何活性，从而表明了D-GIase和D-LIase是金属离子依赖性酶。另外，还可以看出Co2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+这些金属离子的添加量为1 mmol/L时最大程度地提高了共表达体系酶催化活性，为最适添加量。
| 金属离子 Metal ions |
浓度Concentration (mmol/L) | |||
| 0.5 | 1.0 | 3.0 | 5.0 | |
| Blank | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Co2+ | 85.5±2.32 | 100±0.31 | 103±1.22 | 104±2.08 |
| Mn2+ | 8.43±0.56 | 8.84±0.38 | 8.14±0.43 | 8.02±1.29 |
| Ni2+ | 19.88±2.16 | 21.77±1.17 | 18.0±1.53 | 16.72±3.21 |
| Fe2+ | 6.52±0.89 | 6.80±0.30 | 5.73±0.36 | 5.12±0.75 |
| Zn2+ | 1.06±0.72 | 2.72±0.52 | 1.51±0.95 | 0 |
| Mg2+ | 2.12 ± 0.38 | 4.08±0.61 | 20.0±1.23 | 0 |
| Ca2+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ba2+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cu2+ | 0 | 0 | 0 | 0 |
在最佳条件下(pH 6.0，70 ℃，1 mmol/L Co2+)，使用构建的带有pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI载体的重组大肠杆菌细胞，以初始浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。如图 7所示，在5、8、10 h后分别达到平衡状态。平衡后得到的D-果糖质量浓度分别为42.2、112.8、185.0 g/L，分别显示出42.2%、37.6%和37.0%的转化率；D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L，相应的转化率分别为13.8%、12.7%和12.5%。在达到反应平衡后，D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。目前，模拟移动床技术被广泛使用在制备和分离许多精细化学品和生化物质，特别是在手性分离过程中，包括蛋白质和糖[25]。这一技术同样适用于分离这3种单糖。郭翔海等发明了模拟移动床来分离D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖这3种混合物的方法[26]。
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| 图 7 共表达大肠杆菌细胞以D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖 Figure 7 The production of D-mannose from D-glucose substrate by co-expression E. coli cells 注：A：100 g/L D-葡萄糖；B：300 g/L D-葡萄糖；C：500 g/L D-葡萄糖. Note: A: 100 g/L of D-glucose; B: 300 g/L of D-glucose; C: 500 g/L of D-glucose. |
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大多数的文献报道[14-18, 27]是以D-果糖或D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖，如表 2所示，D-LIase和D-MIase可以将D-果糖直接转化为D-甘露糖。例如，来源于Thermosediminibacter oceani的重组D-LIase，在pH 6.5和65 ℃以及1 mmol/L Mn2+存在下，以400 g/L D-果糖为底物反应9 h后得到质量浓度为101.6 g/L的D-甘露糖，转化率为25.4%[14]；固定化来自Agrobacterium radiobacter的D-MIase反应含200 g/L D-果糖底物溶液，在pH 6.5和55 ℃条件下反应14 d，可以从180 mL的流出液中得到9 g的D-甘露糖[27]。尽管以D-果糖为底物生产D-甘露糖有相对较高的转化率，但底物D-果糖价格略高于D-葡萄糖，无形中增加了企业的生产成本。另外，还有文献报道来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的CEase可将D-葡萄糖直接转化为D-甘露糖，以500 g/L D-葡萄糖为底物，在pH 7.5和75 ℃条件下，发酵3 h产生75 g/L的D-甘露糖和47.5 g/L的D-果糖，D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为75.5:9.5:15，生成D-甘露糖的转化率约为15%[17]。
| 底物 Substrate |
酶 Enzyme |
催化剂 Catalyst |
条件 Condition |
表达菌株 Expressed strain |
底物浓度 Substrate concentration (g/L) |
转化率 Conversion rate (%) |
文献 References |
| D-果糖 D-fructose |
D-MIase | Free enzymes | pH 7.0, 45 ℃ | B. subtilis | 600 | 25.0 | [15] |
| D-MIase | Immobilized cells |
pH 7.5, 55 ℃ | Agrobacterium radiobacter |
200 | 25.0 | [27] | |
| D-LIase | Free enzymes | pH 6.5, 65 ℃ | E. coli | 400 | 25.4 | [14] | |
| D-葡萄糖 D-glucose |
D-MEase | Free enzymes | pH 8.0, 50 ℃ | E. coli | 500 | 24.4 | [18] |
| CEase | Free enzymes | pH 7.5, 75 ℃ | E. coli | 500 | 15.0 | [17] | |
| D-GIase, D-MIase | Free enzymes | pH 7.0, 50 ℃ | Streptomyces sp. Pseudomonas sp. |
300 | 12.0 | [16] | |
| D-GIase, D-LIase | Free cells | pH 6.0, 70 ℃ | E. coli | 100 | 13.8 | 本文 This work |
另外，有研究者运用双酶系统从D-葡萄糖直接生产D-甘露糖。例如，将来源Pseudomonas sp.的D-MIase和来源Streptomyces sp.的D-GIase加入到300 g/L D-葡萄糖的反应体系中，D-GIase可以将D-葡萄糖转化为D-果糖，D-MIase进一步将生成的D-果糖催化生成D-甘露糖，反应40 h后，得到114 g/L的D-果糖和36 g/L的D-甘露糖，D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:38:12，生成D-甘露糖的转化率约为12%[16]。
相较而言，本研究是在同一细胞中共表达D-GIase和D-LIase，以D-葡萄糖为底物一锅法生产D-甘露糖，不但简化了酶的纯化过程、节省了制备酶的时间和成本，同时，一锅法生产减少了分批发酵的过程，提高了效率。为了提高共表达体系酶的催化效率，合适的pH、温度和反应系统中金属离子的存在起到了至关重要的作用。另外，尽管D-LIase可以将D-果糖转化为D-甘露糖，但是其最适底物是D-来苏糖。因此，将来的研究可使用通过定点突变、随机突变和基于晶体结构的定向进化等方法对D-LIase进行底物特异性的分子修饰，得到更能满足工业需要的D-LIase。
3 结论本文将来自A. cellulolyticus的D-GIase和来自P. bacterium 1109的D-LIase，在E. coli BL21(DE3)细胞中共表达，通过一锅法利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。带有pCDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒的大肠杆菌细胞共表达体系最适温度为70 ℃，在磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 6.0)中添加1 mmol/L Co2+时显示出最大活性。在最佳条件下，该反应系统可转化100 g/L的D-葡萄糖产生13.8 g/L的D-甘露糖。在达到反应平衡后，D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。总而言之，本文鉴定的一锅法利用D-葡萄糖生产D-甘露糖，在工业生产D-甘露糖中有很大的应用前景。
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