2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 温露文, 徐岩, 喻晓蔚
- WEN Lu-Wen, XU Yan, YU Xiao-Wei
- 理性设计提高酯合成催化反应脂肪酶的热稳定性
- Rational design to improve lipase thermostability for ester synthesis
- 微生物学通报, 2020, 47(7): 2106-2118
- Microbiology China, 2020, 47(7): 2106-2118
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190819
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文章历史
- 收稿日期: 2019-10-12
- 接受日期: 2020-02-13
- 网络首发日期: 2020-04-30
南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctica lipase B，CALB)是由317个氨基酸构成的球状蛋白，分子量为33.5 kD，是有机合成中最常用的脂肪酶之一。1994年，Uppenberg等[1]解析获得了CALB的氨基酸序列及晶体结构，CALB具有脂肪酶典型的催化三联体结构(Ser105-Asp187-His224)，由Thr40和Gln106形成氧负离子洞，同时具有一个特异性底物结合口袋。CALB作为一种重要的工业酶制剂，相比于其他脂肪酶，其在酯化、水解、转酯、手性化合物拆分、氨解等方面表现出更为出色的催化性能[2]。此外，CALB在区域选择性和对映选择性方面表现出非常高的底物选择性。因此，CALB在食品、化工、手性药物拆分、油脂加工、生物柴油[3-5]等行业具有广泛的应用，然而野生型CALB的热稳定性差，限制了其在工业中的应用[6-7]。
目前已有多种策略用于提高蛋白质的热稳定性，例如固定化[8]、介质工程[9]和蛋白质工程[10]。蛋白质工程是通过改造酶分子本身提高酶的热稳定性，蛋白质工程策略主要分为定向进化和理性设计，以及定向进化和理性设计相结合的半理性设计策略等[10-12]。Akbulut等[13]通过定向进化成功提高了短小芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性和活性，获得的嵌合突变体(L3-3)的比酶活分别比两个亲本酶高6.4倍和8.2倍，且该突变体在50 ℃下的半衰期增加了9倍。通过定向进化策略，Zhang等[14]筛选得到两株热稳定性有所提高的CALB突变体23G5和195F1。Wen等[15]通过B-factor迭代测试对解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2进行半理性设计改造，相比野生型，获得的突变体A103S和T117G显示出更高的热力学稳定性，50 ℃下半衰期分别提高了2.7倍和5.2倍。随着计算机运算能力的不断提升，以及酶分子的氨基酸序列、三级结构及催化机理等被逐渐挖掘和解析，蛋白质工程的理性设计策略越来越受到重视[16]。与非理性和半理性策略相比，理性设计可以提供更为准确的预测结果。共价键[17]或非共价相互作用的引入[18]、脯氨酸的增加或甘氨酸的减少[19]、氨基酸序列的截短[20]和环化[21]等策略已用于提高蛋白质的稳定性。Zhang等[22]通过分子动力学模拟和脯氨酸的引入，获得热稳定性提高的解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2突变体V213P，该突变体的最适温度提高了约5.0 ℃，且其催化活性与亲本相当。通过点突变和二硫键的引入，提高了米根霉脂肪酶的热稳定性，突变体V209L/D262G/E190C/E238C在55 ℃和65 ℃的半衰期分别是野生型的102.5倍和20倍[23]。Damnjanović等[24]通过删除D40 Loop区域提高了抗生链霉菌磷脂酶D的热稳定性，缺失Loop区的突变体Δ38-46 DYR在70 ℃的活性半衰期比DYR高11.7倍。为提高CALB热稳定性，Park等[25]采用分子动力学模拟和RosettaDesign算法选择CALB潜在的热稳定性突变位点，最终筛选得到热稳定性有所提高的突变体A251E，其在50 ℃的半衰期提高约2.5倍，但比酶活下降了一半。Kim等[26]结合B-factor值和RosettaDesign算法，最后获得Tm值增加了2.3 ℃的CALB突变体R249L。通过选取CALB活性部位附近高B-factor值的柔性位点进行突变，Xie等[27]得到Tm值增加了3.6 ℃的D223G/L278M的优势双突变体。
蛋白质解折叠自由能(ΔG)是蛋白质热动力学参数中最重要的参数，软件PoPMuSiC[28]和FoldX[29]是利用生物信息学的方法来模拟突变对蛋白质解折叠自由能(ΔG)的影响。若突变后的ΔG(mutant)小于野生型ΔG(wild)，表明该突变对蛋白质的热稳定性有正效应。若突变后ΔG增加，则说明该突变不利于蛋白质的稳定。Kumar等[30]在针对Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)稳定性的研究中，比较了8种计算蛋白质稳定性的工具，结果表明PoPMuSiC和FoldX是最佳的计算方法。本研究采用PoPMuSiC和FoldX计算CALB潜在的热稳定性位点，在保留CALB优良催化性能的基础上提高其热稳定性，同时尝试筛选获得催化活力提高的突变体，并采用分子动力学模拟进一步分析了CALB突变前后热稳定性变化的机制。本研究为拓宽CALB的工业应用提供了一定的技术支撑，同时为解析CALB的热稳定性机制及进一步改造提供了理论依据。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒大肠杆菌JM109、毕赤酵母GS115及质粒pPICZαA均由本实验室保藏。
1.2 主要试剂经密码子优化的calb基因、引物，Genewiz公司，表 1列出了本研究所用的引物；PCR产物纯化试剂盒，Omega公司；博莱霉素(zeocin)，Invitrogen公司；DNA Marker、蛋白Marker、限制性内切酶NotⅠ、EcoRⅠ、PrimeSTAR，TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶PmeⅠ，New England Biolabs公司。
| 引物 Primer |
序列 Sequence (5′→3′) |
| calb-F | AATTGAATTCTTGCCATCTGGTTCTGATCCTG |
| calb-R | AATTGCGGCCGCTTAAGGAGTAACA |
| S50R | ATCTTTTGATAGAAACTGGATTCCATTGT |
| S56M | GATTCCATTGATGACTCAATTGGGTTAC |
| Q112L | GTTTGGTTGCTTTGTGGGGTTTG |
| A130C | ATAGATTGATGTGTTTTGCTCCTG |
| A146G | TGGTCCATTGGATGGTTTGGCTGTTT |
| A151P | GGCTGTTTCTCCACCTTCTGTT |
| N181V | GTTCCAACTACTGTTTTGTACTCTGCT |
| G226R | TTGATCATGCTAGATCTTTGACT |
| N264P | CTTTGCCAGCTCCAGATTTGACTCC |
| L278M | TGCTGCTTTGATGGCTCCAG |
| 注：标注下划线的碱基为突变位点，用于定点突变的引物的正反向完全互补. Note: The underlined base is a mutation site, and the primers used for site directed mutagenesis are fully complementary in the forward and reverse. |
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培养基低盐LB (+zeocin)、YPD (+zeocin)、BMGY、BMMY，均根据Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册配制。
1.4 主要仪器ÄKTA蛋白纯化仪，GE公司；配备氢火焰离子化检测器的气相色谱仪，Agilent公司；差示扫描量热仪，Waters公司；PCR仪，Eppendorf公司；酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司。
1.5 CALB潜在热稳定性位点的预测将已解析的CALB晶体结构(PDB ID：1TCA)提交至软件PoPMuSiC和FoldX进行计算。根据软件计算的ΔΔG结果进行排序，选择突变后ΔG下降幅度大的位点。此外，采用PyMOL观察相应氨基酸残基在蛋白结构中的空间位置，以防止选择的位点突变对CALB的酶活造成不利的影响，以此排除一些不合理的突变位点。
1.6 定点突变及重组菌株的构建通过酶切位点NotⅠ、EcoRⅠ酶切calb基因，连接表达载体pPICZαA，构建重组质粒pPICZαA-calb。以重组质粒pPICZαA-calb为模板，根据表 1合成相应的引物，采用重叠延伸PCR技术构建各个点突变质粒。采用限制性内切酶PmeⅠ酶切线性化重组质粒，随后电转至毕赤酵母感受态细胞，涂布至YPD (+zeocin)平板，挑取阳性单克隆，PCR验证，获得重组菌株GS115/pPICZαA-calb以及相应突变菌株。
1.7 重组菌株的发酵及CALB的表达将野生型(wild-type，WT)及突变重组菌株于平板YPD (+zeocin)划线培养2−3 d，挑取单克隆接种BMGY培养基，30 ℃、200 r/min培养至OD600为2.0−6.0。8 000 r/min离心5 min后弃去上清，将全部菌体转移至BMMY。将BMMY置于28 ℃、200 r/min培养，每隔24 h添加1%的甲醇诱导，并取样测定样品的OD600、蛋白浓度及酶活，通过SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。
1.8 CALB的纯化发酵结束后，于4 ℃、8 000 r/min离心5 min收集发酵液，测定发酵液的比酶活及总蛋白含量。随后将发酵液置于20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中透析，约透析15 h，并时常更换缓冲液，直至透析液颜色由较深的黄色转变为浅淡黄色。透析结束后，先用截留分子量为10 kD的超滤管浓缩透析液，随后再用QFF阴离子交换柱进行纯化。由于CALB具有pH 4.0−8.0的广泛的等电区域[31]，因此在pH 8.0条件下，CALB的净电荷几乎为零，因此CALB主要集中在穿透峰流出。收集穿透峰，浓缩后测定纯酶比酶活及总蛋白含量，计算回收率及纯化倍数。
1.9 CALB酯合成酶活力测定方法各吸取200 μL己酸/庚烷(1.2 mol/L)和乙醇/庚烷(1.2 mol/L)底物溶液，随后加入10 μL的酶液，于45 ℃、200 r/min振荡反应60 min。反应结束后，12 000 r/min离心2 min，吸取上清液进行气相色谱(GC)分析，检测产物己酸乙酯的含量。
气相色谱检测条件：以异戊醇为内标，色谱柱为Econo Cap-Wax (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，初始温度90 ℃，保持1 min，10 ℃升温至200 ℃，保持5 min，检测器温度225 ℃，进样器温度225 ℃。
酶活力单位U的定义：在酶促反应条件下，1 min内生成1 μmol己酸乙酯所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。根据产物与内标峰面积之比计算产物的含量。酶活计算公式如下：
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式中，A样：待测样品产物与内标峰面积之比；A标：标品与内标峰面积之比；S标样：标品浓度(g/L)；V：反应液体积(L)；144.2：己酸乙酯的摩尔质量(g/mol)；t：反应时间(min)；v：加入的酶液体积(mL)。
1.10 Tm值的测定将纯化得到的CALB置于20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中透析过夜直到平衡。取约1 mL的透析液作为空白对照，采用差示扫描量热仪测定样品的Tm值。
1.11 最适温度及温度稳定性的测定将纯酶加入酶促反应体系中，并将其置于35、40、45、50、55、60 ℃下反应60 min后测定残余酶活，确定CALB的最适反应温度，以最高酶活为100%。
将等量的纯酶液分别置于45、50、55、60、65 ℃下孵育60 min，然后于45 ℃下测定残余酶活，以未进行孵育的酶液酶活为100%，测定CALB在不同温度下的热稳定性。
1.12 半衰期t1/2的测定将等量的纯酶液置于50 ℃中，分别孵育90、180、270、360、450、540、630 min，随后测定残余酶活，以未孵育的酶液酶活为100%。以ln(残余酶活)对孵育时间作图，进行线性拟合，所得斜率即为CALB在该温度下的失活常数kd。CALB在50 ℃下的半衰期(t1/2)可由以下公式求得：t1/2=ln2/kd。
1.13 pH稳定性的测定配制不同pH的缓冲液：20 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0−6.0)，20 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0−8.0)，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0−9.0)以及20 mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0−11.0)。将纯酶分别置于上述不同pH的缓冲液中处理约17 h，随后测定残余酶活，以最高酶活为100%，测定CALB在不同pH下的稳定性。
1.14 酶促反应动力学分析分别配制不同浓度的己酸/庚烷(0−7 mol/L)和乙醇/庚烷(0−2.4 mol/L)底物溶液。根据1.9的酶活测定方法，固定其中一个底物浓度(1.2 mol/L)，改变另一个底物浓度，测定CALB在不同底物浓度下的初始反应速率。采用软件GraphPad Prism 8对实验结果进行非线性拟合，计算CALB对乙醇和己酸的Km、Ki和kcat值[32]。
1.15 分子动力学模拟分析采用软件Gromacs进行分子动力学模拟分析。蛋白的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)和轨迹中原子位置的均方根涨落(root mean square fluctuation，RMSF)分别采用gmx rms、gmx rmsf程序计算，分子的回旋半径(radius of gyration，Rg)则通过gmx gyrate程序计算。
2 结果与分析 2.1 CALB潜在热稳定性位点的预测综合PoPMuSiC和FoldX的计算结果，以及氨基酸残基在蛋白结构中的空间位置，最终选取了10个位点进行突变，具体突变位点见表 2。
| 工具 Tool |
位点 Position |
野生型氨基酸 Wild-type AA |
突变氨基酸 Mutation AA |
命名 Name |
| PoPMuSiC | 130 | Ala | Cys | A130C |
| 146 | Ala | Gly | A146G | |
| 181 | Asn | Val | N181V | |
| 264 | Asn | Pro | N264P | |
| 278 | Leu | Met | L278M | |
| FoldX | 50 | Ser | Arg | S50R |
| 56 | Ser | Met | S56M | |
| 112 | Gln | Leu | Q112L | |
| 151 | Ala | Pro | A151P | |
| 226 | Gly | Arg | G226R |
根据方法1.7进行重组菌株GS115/pPICZαA-calb的摇瓶发酵，结果如图 1所示。随着发酵时间的增加，酶活、蛋白浓度和OD600逐渐增加。发酵144 h时，蛋白浓度达到约0.25 mg/mL，酶活达到22 U/mL，OD600达到22.0。但在发酵后期，酶活的增长有所减慢，可能是目的蛋白在发酵后期容易降解。
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| 图 1 GS115/pPICZαA-calb的摇瓶发酵曲线 Figure 1 Fermentation curves of GS115/pPICZαA-calb in shake flask |
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CALB纯化前后的SDS-PAGE分析如图 2所示。相较于发酵液，纯化后的CALB条带单一，纯度达到电泳纯，说明QFF阴离子层析能有效地从酵母发酵液中纯化得到CALB。经计算，使用QFF阴离子层析纯化CALB的回收率为32.7%，纯化倍数为1.54 (表 3)。
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| 图 2 CALB纯化前后的SDS-PAGE图 Figure 2 SDS-PAGE of CALB |
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| 纯化步骤 Purification step |
回收率 Activity yield (%) |
纯化倍数 Purification |
| 发酵液 Culture supernatant | 100 | 1.0 |
| 纯酶 Purified enzyme | 32.7 | 1.5 |
对构建的10株突变菌株进行发酵并与野生型菌株进行对比。各个突变体发酵液的SDS-PAGE图如图 3所示，菌株GS115/pPICZαA-calb-S50R和S56M几乎不表达目的蛋白，经测定其蛋白浓度仅为0.05 mg/mL，因此舍弃该突变。其余突变菌株的胞外蛋白分泌量都与野生型相当，能达到0.2 mg/mL的表达水平。
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| 图 3 各个突变体发酵液的SDS-PAGE图 Figure 3 SDS-PAGE of each mutant supernatant |
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为简化筛选步骤，首先通过测定发酵液的热稳定性初步筛选有益的突变位点。将发酵液置于50 ℃下孵育180 min后测定残余酶活，以未孵育的发酵液酶活为100%，同时测定点突变对酶活的影响，结果如图 4所示。在50 ℃下孵育180 min，突变体A146G、A151P和L278M的热稳定性均有所提高，残余酶活分别是野生型的2.0、1.5和2.8倍，酶活分别为野生型的0.77、1.2、0.97倍。
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| 图 4 未纯化突变体及野生型的热稳定性及发酵酶活 Figure 4 Thermostability and activity of the mutants and the wild-type in the supernatant |
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将有效的单点突变A146G、A151P和L278M进行组合，构建得到双组合突变体A146G-A151P、A146G-L278M、A151P-L278M及三组合突变体A146G-L278M-A151P。经发酵液热稳定性和酶活的初步测定，突变体A146G-A151P的热稳定性和酶活均低于单点突变，因此淘汰突变体A146G-A151P，其余组合突变体的热稳定性在单点突变的基础上均得到进一步的提高。
纯化野生型和突变体A146G-L278M、A151P-L278M、A146G-L278M-A151P发酵液得到相应的纯酶。测定野生型和各个突变体纯酶在50 ℃孵育180 min后的残余酶活，以未孵育的酶液酶活为100%，同时测定发酵液的酶活力，结果如图 5所示。突变体A146G-L278M、A151P-L278M、A146G-L278M-A151P在50 ℃孵育180 min后的残余酶活分别是野生型的1.7、2.1、1.8倍。突变后，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的发酵活力与野生型相当，但突变体A151P-L278M的酯合成酶活性有所下降。因此，下一步主要针对突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P进行研究。
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| 图 5 突变体及野生型的热稳定性及发酵活力比较 Figure 5 Thermal stability and enzyme activity comparison of the mutants and the wild-type |
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Tm值的测定结果如图 6所示。野生型的Tm值为56.2 ℃，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的Tm值分别为59.5 ℃和60.4 ℃，分别比野生型提高了3.3 ℃和4.2 ℃。通过选取活性部位附近高B-factor值的柔性位点进行突变，Xie等[27]将CALB的Tm值提高了3.6 ℃，二硫键的引入也将CALB的Tm值提高了1.1 ℃[6]。此外，Kim等[26]结合B-factor值和RosettaDesign算法获得了Tm值增加了2.3 ℃的CALB突变体。
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| 图 6 突变体及野生型的差示扫描量热分析结果 Figure 6 Differential scanning calorimetric analysis of the mutants and the wild-type |
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最适温度和温度稳定性的测定结果分别如图 7和图 8所示。由图 7可以看出，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的最适反应温度为50 ℃，比野生型的最适温度提高了5 ℃；当温度继续升高时，野生型和突变体的酶活均显著下降，但两个突变体在高温下的酶活高于野生型。由图 8可以看出，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P在不同温度下孵育60 min后，热稳定性高于野生型；在50 ℃孵育60 min后，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的残余酶活分别是野生型的1.36倍和1.49倍。
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| 图 7 突变体和野生型的最适反应温度 Figure 7 Effects of temperature on the activity of the mutants and the wild-type |
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| 图 8 突变体和野生型的温度稳定性 Figure 8 Effects of temperature on the stability of the mutants and the wild-type |
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将样品置于50 ℃下孵育不同时间测定残余酶活，以ln(残余酶活)对时间作图，结果如图 9所示。根据方法1.12中的公式，计算得知野生型的半衰期t1/2为279 min，突变体A146G-L278M的半衰期t1/2为377 min，A146G-L278M-A151P的半衰期t1/2为418 min，分别是野生型的1.35倍和1.5倍。Park等[25]通过点突变成功提高了CALB的半衰期，突变酶A251E在50 ℃下的半衰期(251 min)是野生型(100 min)的2.5倍，但其比酶活下降了一半。引入二硫键的CALB突变体A162C-K308C在50 ℃的半衰期(220 min)比野生型(49 min)提高了约4.5倍，其Vmax/Km略微有所下降[6]。双突变体D223G/L278M在48 ℃下的半衰期为49 min，是野生型(3.8 min)的13倍，催化效率kcat/Km与野生型相当[27]。
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| 图 9 突变体和野生型在50 ℃下的热稳定性 Figure 9 Thermalstability of the mutants and the wild-type at 50 ℃ |
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pH稳定性测定结果如图 10所示，野生型和突变体的pH稳定性相似，在pH 5.0−11.0的范围内均有良好的稳定性；在pH 3.0的偏酸性环境中，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的残余酶活分别是野生型的1.6倍和2.0倍，说明比起野生型，两株突变体对偏酸性环境具有更好的耐受性。
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| 图 10 突变体和野生型的pH稳定性 Figure 10 Effects of pH on the stability of the mutants and the wild-type |
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采用软件GraphPad Prism 8对不同底物浓度下CALB的初始反应速率进行非线性拟合，结果如图 11和图 12所示。
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| 图 11 己酸浓度对初始反应速率的影响 Figure 11 Effect of the hexanoic acid concentration on initial reaction rate |
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| 图 12 乙醇浓度对初始反应速率的影响 Figure 12 Effect of the ethanol concentration on initial reaction rate |
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由图 12可见，当固定己酸浓度1.2 mol/L时，随着乙醇浓度的增加，酶促初始反应速率呈先上升后下降的趋势，说明乙醇对CALB存在竞争性抑制作用。多项研究报道了醇对脂肪酶存在竞争性抑制作用[33-34]。采用软件GraphPad Prism 8进行非线性拟合得到CALB对己酸和乙醇的酶促反应动力学参数如表 4所示。
| Parameters | WT | A146G-L278M | A146G-L278M-A151P |
| KmA(mol/L) | 1.118 | 0.233 | 0.204 |
| VmaxA(μmol/(min·mg)) | 162.6 | 139.3 | 122.4 |
| kcatA(s-1) | 90.78 | 77.78 | 68.34 |
| kcatA/KmA(L/(mol·s)) | 81.20 | 333.80 | 335.00 |
| KmB(mol/L) | 2.273 | 1.189 | 1.302 |
| VmaxB(μmol/(min·mg)) | 1 218.0 | 638.9 | 499.4 |
| kcatB(s-1) | 680.05 | 356.72 | 278.83 |
| kcatB/KmB(L/(mol·s)) | 299.19 | 300.02 | 214.16 |
| KiB(mol/L) | 0.132 | 0.432 | 0.520 |
| 注：KmA和KmB分别表示CALB对底物己酸和乙醇的米氏常数，VmaxA和VmaxB分别表示CALB对底物己酸和乙醇的最大反应速率，kcatA和kcatB分别表示CALB对底物己酸和乙醇的转化数，KiB为CALB对乙醇的竞争性抑制常数. Note: KmAand KmBare the Michaelis constants of hexanoic acid and ethanol, respectively, VmaxA and VmaxBare the maximum reaction rates of CALB with hexanoic acid and ethanol, respectively, and kcatA and kcatB are the turnover number of hexanoic acid and ethanol, respectively, KiB is a competitive inhibition constant for CALB by ethanol. |
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由表 4可以看出，野生型对己酸的米氏常数KmA是上述突变酶的5倍左右，表明突变酶对己酸具有更高的亲和力，且突变酶对己酸的催化效率kcatA/KmA约是野生型的4倍。突变酶对乙醇的米氏常数KmB比野生型更低，表明相比于野生型，CALB突变后对乙醇具有更好的亲和力。突变体A146G-L278M-A151P对乙醇的催化效率kcatB/KmB略低于野生型，但突变体A146G-L278M对乙醇的催化效率kcatB/KmB与野生型相当。由于乙醇是CALB己酸乙酯合成反应中的竞争性抑制剂，所以乙醇的抑制常数KiB反映了乙醇对酯合成反应的抑制强度，抑制常数越小说明抑制能力越强。突变酶的乙醇抑制常数KiB是野生型的3−4倍左右，说明对于突变酶而言，乙醇对酯合成反应的抑制要小于野生型。目前提高CALB热稳定性的文献报道均是以CALB的水解酶活为依据[25-26]，而本文是首次以酯合成酶活作为评价指标，在不影响酯合成催化效率的前提下，成功提高了CALB的热稳定性。
2.10 分子动力学模拟分析采用分子动力学模拟计算，可以获得目标蛋白在100 ns时间内的运动轨迹和结构变化情况，结果如图 13所示。如图 13A所示，两个突变体的RMSD变化幅度低于野生型，表明CALB氨基酸残基的突变，降低了蛋白分子整体构像Cα的偏移幅度，说明该突变有利于CALB热稳定性的提高。RMSF是指每个氨基酸残基在整个分子动力学模拟过程中的偏振，残基的位置偏移越大，说明该区域的构象越不稳定。如图 13B所示，两个突变体和野生型的RMSF整体相差不大，说明位点的突变对CALB的关键区域结构并没有造成太大的影响。图 13C显示了回旋半径(Rg)的变化情况，突变体与野生型的回转半径相差最大不到0.5 Å，表明CALB整体结构的密实度在突变前后变化不大，突变并未对CALB的结构造成太大的影响。
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| 图 13 CALB在100 ns内的运动轨迹和结构变化 Figure 13 Change of CALB motion trajectory and structure within 100 ns 注：A：均方根偏差(RMSD)；B：均方根涨落(RMSF)；C：回转半径(Rg). Note: A: Root mean square deviation (RMSD); B: Root mean square fluctuation (RMSF); C: Radius of gyration (Rg). |
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通过分子动力学模拟分析，表明CALB突变后蛋白骨架中Cα的偏移幅度有所下降，但整体结构在突变前后变化不大，这可能是突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P热稳定性提高的原因。
3 讨论与结论热稳定性是衡量酶在工业应用中可行性的重要参数[35]。热稳定性高的酶具有良好的动力学稳定性，可以在严苛的条件下使用[36]。较高的工作温度有利于加快反应速度，提高底物溶解度，并降低微生物污染的风险。此外，在蛋白质工程中，具有较高稳定性的酶也具有更大的进化潜力，因为它们可以接受更广泛的有益突变[37]。CALB作为最重要的工业酶制剂之一，在精细化工、手性药物拆分等方面具有很大的应用潜力，然而野生型CALB较弱的热稳定性使其在实际的生产应用中受到一定限制。研究表明，CALB在50 ℃下的半衰期为49 min，其Tm值为54 ℃[6]；其次，CALB在60 ℃下孵育20 min后，酶活仅剩15%[7]。为了拓宽CALB的工业应用，有许多关于提高CALB热稳定性的研究，主要分为化学材料固定化和蛋白质工程两大类。目前以固定化手段提高CALB热稳定性的研究较多[38-42]，市售的商品固定化酶CALB具有较高的耐热性，但价格也相对昂贵。采用蛋白质工程改造CALB以提高其热稳定性的报道较少[6, 14, 25-27, 43-44]。
本研究根据CALB已有的晶体结构(PDB ID：1TCA)，采用软件PoPMuSiC和FoldX计算CALB潜在的热稳定性突变位点，最终获得两个热稳定性有所提高的突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P。相比于野生型，突变体A146G-L278M和A146G-L278M-A151P的Tm值分别提高了3.3 ℃和4.2 ℃，最适反应温度提高了5 ℃；pH稳定性研究表明，两个突变体在pH 5.0−11.0的环境中具有良好的稳定性，相比于野生型，其对偏酸性环境具有更好的耐受性；此外，酶促反应动力学分析表明，两个突变体对己酸和乙醇均表现出更高的亲和力，在己酸乙酯合成反应中对己酸的催化效率kcatA/KmA是野生型的4.1倍。
根据蛋白质三级结构中包含的能量和势能等信息可以预测突变对蛋白质稳定性的影响。据此，研究人员开发了多种预测蛋白质热稳定性的算法，例如PoPMuSiC[45]、I-Mutant[46]、FoldX[47]和Rosetta[48]等。但是，想要实现准确的预测仍是一个很大的挑战，结合多个预测工具进行计算有利于提高预测的可靠性和准确性[16]。Le等[6]采用计算机工具MODIP和DbD V1.20预测CALB潜在的二硫键形成位点，最终成功获得热稳定性提高的突变体A162C-K308C，相比于野生型，突变体酶A162C-K308C的Tm值增加了1.1 ℃，且在50 ℃的半衰期增加了约4.5倍。Li等[49]采用多种计算设计方法对米黑根毛霉脂肪酶进行工程设计，最终获得了最稳定的突变体T18K/T22I/E230I/S56C-N63C/V189C-D238C，在70 ℃下的半衰期提高了12.5倍，且
已有报道利用定向进化来提高CALB的热稳定性。Zhang等[14]经两轮易错PCR分别得到两株热稳定性提高的突变体23G5和195F，比起野生型，突变体23G5和195F1在70 ℃的半衰期增加了约20倍，而且其水解催化效率也有所提高。CALB在毕赤酵母中表达会进行糖基化修饰[51]，N-糖基化修饰对酶的活性、热稳定性和分泌都起到重要作用，消除天然糖基化位点可能会导致蛋白质不稳定[52]。虽然在定向进化过程中，采用真核来源宿主能够对异源蛋白进行翻译后修饰，但与原核宿主相比，真核宿主培养时间长、操作繁琐，大规模筛选耗时耗力。因此本文采用了理性设计的方法，根据计算机辅助预测极小自由能的突变位点，避免了大量的筛选工作。
针对本研究获得的热稳定性提高的突变体，后续的研究可以结合不同的计算软件和理性设计策略，进一步对其进行分子改造，如引入二硫键、柔软区域片段的截短等，以期进一步提高CALB的热稳定性，继而拓宽CALB的工业应用。
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