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文章信息
- 曾晨爔, 林茂, 李忠琴, 马英, 王淑红
- ZENG Chen-Xi, LIN Mao, LI Zhong-Qin, MA Ying, WANG Shu-Hong
- 基于16S rRNA基因扩增子测序分析日本囊对虾肠道菌群结构与功能的特征
- The structural and functional characteristics of the gut microbiota of Marsupenaeus japonicus as revealed by 16S rRNA gene amplicon sequencing
- 微生物学通报, 2020, 47(6): 1857-1866
- Microbiology China, 2020, 47(6): 1857-1866
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190749
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文章历史
- 收稿日期: 2019-09-15
- 接受日期: 2019-11-22
- 网络首发日期: 2019-12-12
2. 农业农村部东海海水健康养殖重点实验室 福建 厦门 361021
2. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Xiamen, Fujian 361021, China
日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)又称日本对虾(Kuruma prawn),因其肉质鲜美且具有耐低温、耐干能力强、经济价值高等优点,从而受到消费者和养殖业者的青睐。作为我国海水养殖虾类中的主要品种之一,日本囊对虾在国内的南北方沿海地区均有多年的养殖历史并形成了较大的养殖规模[1-2]。据统计,2018年全国日本囊对虾的海水养殖产量为55 228 t (较2017年同期增长了5.26%),占海水养殖虾类总产量的3.92%[3]。
肠道是机体关键的消化吸收场所,其中定居着大量的微生物群落(如细菌、真菌、病毒等),正常情况下其在宿主体内相互依赖、相互制约并维持着内环境稳态。肠道菌群对宿主的生理活动有很大影响,其组成与遗传、营养和环境等多种因素有关,更被视为机体不可分割的“隐形器官”[4-6]。肠道细菌类群是该“隐形器官”中的重要部分,在虾类的生长发育、消化吸收以及免疫防病等方面发挥着举足轻重的作用[7]。
研究表明,外源微生物能够影响虾类肠道菌群的构成,因而探究二者结构间的相关性将为对虾的健康养殖提供新的思路[8-9]。目前,国内外有关虾类肠道菌群的研究主要集中在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[10-12],而对日本囊对虾肠道菌群的研究报道仍鲜见。本文旨在利用高通量测序技术,探讨日本囊对虾肠道细菌的群落结构与功能作用,分析虾体肠道与养殖水体、饲料中菌群结构间的关联,以期丰富和拓展日本囊对虾肠道微生物的基础研究,并为促进对虾养殖业的健康发展及虾类潜在益生菌的开发提供一定的科学依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器PowerFecalⓇ DNA提取试剂盒,QIAGEN公司;AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒,Axygen公司。多参数水质测定仪、PCR仪、凝胶成像系统,Thermo Fisher Scientific公司;电泳仪,上海天能科技有限公司;QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统,Promega公司;MiSeq测序仪,Illumina公司。
1.2 养殖实验及样品采集实验地点位于福建省漳州市漳浦县沙西镇对虾养殖基地。健康、规格整齐的日本囊对虾购自龙海市江腾水产发展有限公司,体长约2.1±0.4 cm,体重约1.9±0.4 g,暂养7 d后随机放入3个室内水泥池(每池面积为16 m2,配备有增氧、控温、铺沙、排污装置,水深1 m),养殖密度为300尾/m2。实验水源为海水,养殖期间连续充氧,每日换水量50%。本研究选用普通商品饲料,养殖过程中于每日6:00、11:00、16:00、21:00记录水质变化情况并饱食投喂对虾,投饵量以吃食情况适当调整。实验期间水体盐度稳定在2.3%左右、水温为25–27 ℃、pH值为8.3–8.6、溶解氧为5.7–7.9 mg/L、总氨氮 < 0.02 mg/L。
为期60 d的养殖实验结束后,共采集3组(每组3个)样品,分别为虾肠组(JG)、水体组(JW)、饲料组(JD)。虾肠组(JG):将日本囊对虾停食24 h后,在3个养殖池中随机取大小长度相近的健康对虾,于无菌环境下剖取肠道,把同个养殖池中5尾对虾(四角和中间位置各取1尾)的肠道混合作为1个样品,每池收集1个肠道样品。3个肠道样品分别置于不同的无菌离心管中,-80 ℃保存。水体组(JW):利用有机玻璃采水器在3个养殖池中取水体样品,每池采集1个水样(包含上、中、下三层水体共500 mL)。3个水样分别通过5 μm孔径的混合纤维膜去除杂质后,再经0.2 μm无菌聚醚砜膜过滤并收集滤膜于不同的无菌离心管中备用。饲料组(JD):采集3份对虾饲料样品。
1.3 样品基因组DNA的提取、PCR扩增与高通量测序采用PowerFecalⓇ DNA提取试剂盒分别抽提日本囊对虾肠道、养殖水体和饲料样品总DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量后,以通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增各样品总DNA上16S rRNA基因的V3–V4区序列。PCR反应的体系及条件参照文献[13]。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒将目标片段切胶回收。利用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统对PCR产物进行检测定量,并根据结果将各样品等量混合,而后构建MiSeq文库进行高通量测序。
1.4 测序数据分析基于MiSeq PE300平台测序,利用USEARCH软件[14]对原始数据进行质控,按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(optional taxonomic unit,OTU)聚类,选取每个OTU中相对丰度最高的序列为代表序列。采用RDP classifier[15]贝叶斯算法对获得的OTU代表序列作分类学分析(置信度阈值为0.8),并选用SILVA数据库进行物种比对注释。为消除因测序深度不同所引起样本间的多样性评估偏差,将各样品测得的有效数据抽平(data rarefying)处理后再进行后续分析。基于OTU数据计算各样品中菌群的α多样性指数与相对丰度,并采用加权(weighted) UniFrac距离算法结合主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)与层级聚类分析比较各样品中菌群结构的差异。根据测序结果,利用PICRUSt软件[16]预测日本囊对虾肠道菌群功能。
2 结果与分析 2.1 测序数据统计与分析3组(9个)样品测序共获得822 713条有效序列,组间平均测序覆盖率为99.56%-99.77%,这表明本次实验所测得的数据能够真实反映样品中绝大多数细菌类群的组成情况(表 1)。将各样品测得的有效序列按最小样品序列数进行抽平处理后,可聚类为3 416个OTU。
Group | Valid reads | OTUs | Chao1 index | ACE index | Shannon index | Simpson index | Coverage (%) |
JG | 115 892±14 739 | 601±414 | 809.91±493.99 | 855.21±501.98 | 3.31±0.36 | 0.08±0.02 | 99.56±0.29 |
JW | 70 191±22 277 | 468±64 | 568.45±81.82 | 563.99±89.09 | 3.81±0.35 | 0.05±0.02 | 99.77±0.04 |
JD | 62 403±26 833 | 1 273±443 | 1 339.55±452.77 | 1 314.04±438.42 | 4.51±1.31 | 0.03±0.02 | 99.77±0.02 |
注:表中数据为平均值±标准差;JG:虾肠组;JW:水体组;JD:饲料组. Note: Data in the table are the X±SD; JG: Prawn gut group; JW: Water group; JD: Diet group. |
JG组、JW组、JD组样品中检出的OTU数依次为1 253、726、2 593个,JG组与JW组共有的OTU数为357个,JG组与JD组共有的OTU数为743个,3组共有的OTU数为135个(图 1)。上述结果表明,各组样品所检测到的细菌类群在OTU水平上存在一定关联。此外,α多样性分析结果显示,JD组样品中菌群的丰富度(以Chao1指数和ACE指数来衡量)总体上依次高于JG组和JW组样品,而JD组样品中菌群的多样性(以Shannon指数与Simpson指数来衡量)总体上依次高于JW组和JG组样品(表 1)。
2.2 β多样性分析在OTU水平上,基于加权UniFrac距离对所有样品进行三维主坐标分析后发现,JG组、JW组与JD组样品中菌群结构的组间差异明显(不同组样品在其投影平面上的间距较远,大都分散于不同象限),而组内差异较小(同组样品在其投影平面上的间距较近,大都聚集在一起) (图 2)。
2.3 细菌群落的组成与结构在门水平上:JG组中的优势菌门(平均相对丰度 > 1%)是变形菌门(Proteobacteria,78.69%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,11.30%)、厚壁菌门(Firmi- cutes,4.88%)与梭杆菌门(Fusobacteria,2.37%);JW组中的优势菌门为蓝细菌门(Cyanobacteria,33.87%)、变形菌门(29.74%)、放线菌门(Actino- bacteria,19.01%)、拟杆菌门(13.49%)和疣微菌门(Verrucomicrobia,2.24%);JD组中的优势菌门为变形菌门(45.14%)、蓝细菌门(19.13%)、厚壁菌门(10.09%)、绿湾菌门(Chloroflexi,5.99%)、拟杆菌门(5.63%)、酸杆菌门(Acidobacteria,4.72%)、放线菌门(3.16%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes,1.61%)及浮霉菌门(Planctomycetes,1.46%) (图 3)。
在属水平上,各组样品中检测到优势菌属(平均相对丰度 > 1%)的结构间具有明显差异:JG组中以弧菌属(Vibrio,29.84%)、另类弧菌属(Aliivibrio,23.69%)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas,8.99%)、假黄棕杆菌属(Pseudofulvibacter,7.03%)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia,5.42%)、小纺锤状菌属(Fusibacter,4.08%)、发光杆菌属(Photobacterium,2.07%)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio,1.73%)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter,1.59%)和弓形杆菌属(Arcobacter,1.22%)为优势菌属;JW组中以海命菌属(Marivita,17.25%)占据首要优势地位,其次是聚球藻属(Synechococcus,14.55%)、黄杆菌属(Flavobacterium,2.85%)、Pontimonas (2.26%)、嗜冷杆菌属(1.98%)和红菌属(Rhodobium,1.53%);JD组中检测出的优势菌属主要为假单胞菌属(Pseudomonas,8.55%)、固氮弧菌属(Azoarcus,5.50%)、陶厄氏菌属(Thauera,4.63%)、嗜盐单胞菌属(Halomonas,3.77%)、雷尔氏菌属(Ralstonia,3.60%)、埃希氏菌属(Escherichia,2.86%)以及芽孢杆菌属(Bacillus,1.63%) (图 4)。层级聚类(基于加权UniFrac距离)热图分析结果显示,三组样品被分为两大类,其中JG组独为一类,JW组和JD组聚为一类,这说明与JG组样品相比,JW组与JD组样品中菌群结构的相似度更为接近(图 5)。
2.4 细菌群落功能预测
PICRUSt分析表明,日本囊对虾肠道菌群所预测到的功能基因可注释到KEGG数据库中4条一级通路以及17条二级通路(平均相对丰度 > 1%),其中包括:新陈代谢(metabolism,54.74%)类通路中的氨基酸代谢(amino acid metabolism,12.54%)、碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism,10.91%)、能量代谢(energy metabolism,6.63%)、辅助因子和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins,5.35%)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism,4.25%)、脂质代谢(lipid metabolism,3.98%)、外源生物降解和代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism,3.13%)、多聚糖的生物合成和代谢(glycan biosynthesis and metabolism,2.66%)、其他氨基酸代谢(metabolism of other amino acids,2.13%);遗传信息处理(genetic information processing,20.61%)类通路中的复制与修复(replication and repair,8.81%)、翻译(translation,5.59%)、折叠分选与降解(folding,sorting and degradation,3.13%)、转录(transcription,3.08%);环境信息处理(environmental information processing,16.24%)类通路中的膜转运(membrane transport,12.86%)、信号转导(signal transduction,2.6%);细胞进程(cellular processes,5.75%)类通路中的细胞运动(cell motility,4.80%) (图 6)。
3 讨论与结论肠道是对虾体内不可或缺的消化吸收器官,其中寄居着结构复杂且数量庞大的菌群,其与宿主的健康生长息息相关[7, 17]。早期有关虾类肠道菌群的研究主要依赖于纯培养法、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术和变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)技术等传统分子生态学研究手段[18-20]。有学者曾利用纯培养法和核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)法探究了日本囊对虾肠道细菌的群落结构,但这两种分析方法均存在各自的局限性,不能全面了解对虾肠道细菌类群的组成结构[21-22]。随着分子生物学技术的不断发展,高通量测序技术逐步替代了传统的分子生物学分析方法,且已广泛应用于虾类肠道菌群的研究中[9, 12, 17]。然而,至今有关日本囊对虾肠道菌群的研究仍少见报道。基于此,本文采用16S rRNA基因扩增子测序法分析了日本囊对虾肠道菌群的组成结构与功能作用,并探究了虾体肠道菌群与外源菌群结构间的相关性。
前人研究发现,变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是健康虾类所共有的肠道优势菌群,这与本研究结果相一致[23-26]。本实验中,变形菌门在日本囊对虾肠道内占据首要优势地位(占比超过75%),其中包含γ-变形菌纲的弧菌属、另类弧菌属、假交替单胞菌属、科尔韦尔氏菌属、发光杆菌属和嗜冷杆菌属,δ-变形菌纲的脱硫弧菌属以及ε-变形菌纲的弓形杆菌属等。此外,拟杆菌门中的假黄棕杆菌属和厚壁菌门中的小纺锤状菌属是在日本囊对虾肠道中占据次要优势地位的细菌类群。上述菌属除科尔韦尔氏菌属外(常见于鱼类肠道内)[27],均常见于虾类肠道环境中,如弧菌属、假交替单胞菌属与发光杆菌属被报道为墨吉对虾(P. merguiensis)和凡纳滨对虾共有的肠道优势菌群[18, 28],另类弧菌属、嗜冷杆菌属与弓形杆菌属被发现可存在于中国明对虾(Fenneropeneaus chinensis)的肠道环境中[22],而脱硫弧菌属、假黄棕杆菌属和小纺锤状菌属则可分别在3种对虾的肠道环境内检测到[22, 29-30]。以上结果表明,不同种类对虾的肠道菌群结构间存在一定的共性。
有报道指出,水环境、饵料中的微生物群落对水生动物肠道菌群结构的形成有密切影响[31-32]。对于虾类而言,养殖水体中存在的细菌类群被证实能够干预长毛对虾(P. penicillatus)和凡纳滨对虾肠道菌群的结构组成,但影响程度有限[26, 33]。在本研究中,水体样品与饲料样品中分别有49.17%及28.65%的OTU可以在日本囊对虾肠道样品中检测到。通过对OTU序列进行物种注释后发现,尽管在日本囊对虾肠道、养殖水体、饲料样品中检出了许多共有的OTU,但它们之间绝大多数都为稀有(在各组内所占平均相对丰度均 < 1%)的细菌类群,而在三组样品中检测到的优势菌属结构间则有着明显差异。由此推测,本实验中日本囊对虾肠道菌群与外源菌群的结构间既存在一定关联,同时又具有相对的独立性。
肠道菌群在虾类的生理活动中起至关重要的作用,具体表现在促消化、营养吸收和免疫抗病等方面[7]。本研究中PICRUSt预测结果显示,日本囊对虾肠道菌群的基因功能主要与新陈代谢类功能有关,包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢等,这也暗示肠道菌群积极参与了日本囊对虾日常的代谢过程。此外有报道指出,由凡纳滨对虾肠道内检出的弧菌属和假交替单胞菌属可产生多种细胞外酶(如淀粉酶、脂肪酶、几丁质酶等),对饵料具有潜在的消化能力[23, 28]。这提示本研究中于日本囊对虾肠道内检测到的高丰度弧菌属(最优势菌属)与假交替单胞菌属(第三优势菌属)可能在虾体摄入营养物质的消化代谢过程中发挥了关键作用,但是否能够作为对虾潜在的益生菌应用于水产养殖中,还有待更为深入的研究。
综上所述,可以得出以下结论:(1)日本囊对虾与其他种类对虾的肠道菌群结构间存在共性。(2)养殖水环境和饵料中的菌群在一定程度上干预了日本囊对虾肠道菌群结构的形成。(3)肠道菌群在日本囊对虾的日常代谢活动中发挥了一定的作用。
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