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文章信息
- 刘星丽, 徐怀英, 仉伟, 黄迪海, 秦春芝, 郭卉, 秦卓明
- LIU Xing-Li, XU Huai-Ying, ZHANG Wei, HUANG Di-Hai, QIN Chun-Zhi, GUO Hui, QIN Zhuo-Ming
- 一株源自孔雀的新型支原体的鉴定及其致病性和基因组分析
- Identification, pathogenicity and genome analysis of a new mycoplasma from peacock
- 微生物学通报, 2020, 47(6): 1828-1836
- Microbiology China, 2020, 47(6): 1828-1836
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190760
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文章历史
- 收稿日期: 2019-09-20
- 接受日期: 2019-12-09
- 网络首发日期: 2020-01-02
2. 山东省农业科学院家禽研究所 山东 济南 250100;
3. 济南动物园服务中心 山东 济南 250031;
4. 山东省健牧生物药业有限公司 山东 济南 250100
2. Institute of Poultry Science, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong 250100, China;
3. Jinan Zoo Service Center, Jinan, Shandong 250031, China;
4. Shandong Jianmu Biological Pharmaceutical Company Limited, Jinan, Shandong 250100, China
支原体病是禽类的重要疾病之一,主要由鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)、衣阿华支原体(Mycoplasma iowae,MI)等支原体引起,临床症状表现为呼吸困难、打喷嚏、生长迟缓及产蛋率下降等,可造成严重的经济损失[1-2]。我国大多数禽类均存在多种支原体的潜伏感染,但较少致病。支原体一旦发病,常常会导致长期、慢性感染,临床出现病程长、易反复和难治愈等特点。温度忽高忽低、温差大、氨气浓度高和通风不良等应激均可导致该病的发生,且易与大肠杆菌、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)和传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)等病原混合感染,进而加重病情[3-4]。
Mycoplasma gallinaceum (MGC)属于柔膜体纲支原体目支原体科支原体属,(G+C)mol%含量为28%,模式菌株为NCTC 10183株(GenBank登录号LR214950),基因组全长1 074 838 bp,代谢能力差,营寄生生活[5]。MGC较早分离于南非,通常可以从感染病鸡的上呼吸道或输卵管中获得,一般被认为是非致病性支原体[6]。Adeyemi等发现,MGC可增强IBV在感染鸡气管中复制的能力,加重了IBV对家禽机体的危害[7]。Beylefeld等证实,MGC分离株对金霉素、泰乐菌素和土霉素具有多重耐药性[8]。中国是一个禽类养殖大国,但对于禽源支原体的研究主要集中于MG和MS,而对于其他类型的支原体研究较少。
2018年10月,从久治不愈、呼吸困难的发病孔雀气管粘液中分离获得一株支原体,经分子测序证实为隶属于MGC种的一个新菌株,并对其病原学、致病性和药敏性以及基因组进行研究,以期为临床禽类支原体病的防控提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料来源2018年秋,山东省济南某动物园约40只孔雀出现呼吸困难、眼睛流泪、流鼻液等病症,注射庆大霉素、青霉素等多种药物效果不佳。治疗1周无果后送山东省农业科学院家禽研究所进行诊断。剖检可见,病孔雀喉头和气管上部出血,伴有粘液;肝脏、心脏等内脏器官外观正常,分别从气管、肺脏等组织或器官进行病原分离。
1.1.2 主要试剂和仪器胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker等,宝日医生物技术(北京)有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;细菌16S rRNA基因通用引物27F及1492R,武汉华大基因科技有限公司;水解乳蛋白和酵母浸出物,OXOID公司;猪血清、酚酞二磷酸五钠水合物、氯化三苯基四氮唑等,索莱宝科技有限公司;SPF鸡和SPF鸡胚,山东省农业科学院家禽研究所。生物安全柜,苏州安泰空气技术有限公司;PCR仪,Applied Biosystems公司。
1.2 病原分离和纯化利用无菌的棉拭子蘸取患病孔雀气管内粘液接种支原体改良Frey氏液体培养基[9],37 ℃培养1-3 d,当液体由红变黄时,立即接种改良Frey氏固体培养基[9]进行纯培养。若发现初次培养液体浑浊,经过0.45 μm滤膜过滤,再按照1:10的体积比接种液体培养基进行增殖。
将确定无污染的支原体液体再接种于固体培养基,置于含5% CO2的37 ℃恒温箱培养4-7 d,挑取固体培养基上支原体单菌落接种于液体培养基培养至颜色变黄,取菌液继续接种于固体培养基,如此重复3次,即可获得支原体的纯培养。将以上纯培养物添加终浓度为30%的甘油,-80 ℃冻存备用。
1.3 形态学观察 1.3.1 菌落形态学将纯化后的分离菌接种支原体固体培养基,置于含5% CO2的37 ℃恒温箱培养4-7 d,利用Dienes染色1 min,在低倍显微镜下观察菌落的形态。同时,设大肠杆菌为Dienes染色对照。
1.3.2 菌体吉姆萨(Giemsa)染色取固体培养基培养的菌落或者将支原体的液体培养液10 000 r/min离心10 min,取菌体沉淀,均匀涂布于载玻片,甲醇固定1 min,Giemsa染色1 h,在油镜下观察菌体形态。
1.4 细菌L型鉴别将纯化的菌液按1:10的体积比接种于不含青霉素和醋酸铊的改良Frey氏液体培养基,连传10代,将终产物接种支原体固体培养基,培养4-7 d,观察菌落的形态,进行Dienes染色。
1.5 生化实验和生物学特性按照文献[9]的方法对分离菌株和MG、MS等分别进行生理生化和红细胞吸附试验。
1.6 致病性研究 1.6.1 SPF鸡胚取15个6日龄SPF鸡胚,每胚卵黄囊途径接种200 μL新鲜菌液;另设5个SPF鸡胚接种无菌生理盐水作为对照,置37 ℃温箱培养,每日照蛋,10 d后观察鸡胚病变。
1.6.2 SPF鸡取10只4周龄SPF鸡按滴鼻和点眼途径接种500 μL新鲜菌液;另设5只SPF鸡隔离饲养,作为健康对照。在攻毒后2周内,每天观察每只鸡的临床症状,同时在攻毒后的48-120 h,采集攻毒鸡的咽喉棉拭子进行病原分离。实验结束后剖检所有的实验鸡。
1.7 最小抑菌浓度实验(MIC)按照文献[10]的方法对分离的菌株进行最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)测定。
1.8 分子生物学鉴定和基因组测序 1.8.1 细菌16S rRNA基因分子鉴定将新鲜菌液10 000 r/min离心10 min,弃上清,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,利用通用引物27F (5′-AGAGTTGATCMTGGCT CAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3′)对菌株进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系:10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 1 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA 5 μL,DEPC水补充总体积至25 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30个循环;72 ℃ 10 min。利用1.5%的琼脂糖对PCR产物进行凝胶电泳,选取目的条带进行DNA回收,连接pMD18-T载体,转化DH5α,接种LB固体培养基培养16 h,挑取菌落进行PCR鉴定。将阳性菌落接种LB液体培养基增菌,送华大基因进行测序。
1.8.2 16S rRNA基因系统发育树选择MG、MS和MGC等禽类支原体以及其他动物支原体的16S rRNA基因的核苷酸序列,利用Lasergene 7.1和MEGA 5软件,比较其核苷酸相似性,并采用邻接法(neighbor-joining)构建支原体的系统发育树,探讨不同菌株之间的系统演化关系[11]。
1.8.3 基因组序列及其相关分析按1.8.1法提取菌体DNA,构建Illumina HiSeq小片段文库及PacBio20kb文库,利用Illumina和PacBio平台测序,对测序产物进行Illumina和PacBio的联合组装,最终获得该分离株的全基因组序列,参照相关文献对基因组序列进行分析[12-14]。
2 结果与分析 2.1 病原鉴定 2.1.1 支原体的分离、纯化和形态学及其染色从发病孔雀肺脏、肝脏和脾脏等未分到细菌,但从其气管黏膜分离到一株疑似支原体菌株。初次分离支原体的液体培养基在30 h后颜色由红色开始变橘黄或黄色,且呈现极轻微浑浊,检测未发现细菌污染。为确保其纯粹,将上述培养液经细菌滤膜过滤,再次接种到液体培养基增殖。取菌液接种于固体培养基,置于含5% CO2的温箱37 ℃培养4-7 d,肉眼可见细小、光滑、圆形、透明的菌落。在低倍显微镜下(放大40倍)观察到了中间突起的支原体典型“煎蛋样”菌落,直径为0.2-0.4 mm (图 1A)。菌液经吉姆萨染色,在油镜下可观察到较小的淡紫色圆形菌体,直径为0.1-0.3 μm (图 1B)。挑取单菌落进行纯化培养,最终获得了一株纯化的支原体菌株,命名为Peacock20181011。利用Dienes染色鉴定显示,该菌菌落呈蓝色,不易褪色(图 1C),而对照的大肠杆菌菌落则不易染色,尖端由蓝色褪变为白色(图 1D)。由此证明,Peacock20181011为支原体。
2.1.2 生化试验和生物学特性对Peacock20181011菌株进行生化特性和红细胞吸附试验,具体结果见表 1。该菌生长需要胆固醇,能够发酵葡萄糖、乳糖,不水解精氨酸和尿素,不形成膜斑,无磷酸脂酶活性,不还原四氮唑,无吸附红细胞特性。该结果显示,分离菌与MGC的主要特征完全相似,而与MG、MS等差别较大,因此,推测该菌属于MGC。
菌种Strains | A | B | C | D | E | F | G | H | I | J |
Peacock20181011 M. gallinaceum |
+ | + | - | - | - | + | - | - | - | - |
NCTC10183 M. gallinaceum |
+ | NA | - | NA | - | + | - | - | - | - |
鸡支原体 M. gallinarum |
- | NA | - | - | + | + | - | + | + | - |
鸡毒支原体 M. gallisepticum |
+ | - | - | - | - | + | - | + | + | + |
火鸡支原体 M. meleagridis |
- | - | + | - | - | + | + | - | + | d |
衣阿华支原体 M. iowae |
+ | NA | + | - | - | + | - | + | + | + |
滑液囊支原体 M.synoviae |
+ | - | - | - | + | + | – | - | w | + |
注:A:发酵葡萄糖;B:发酵乳糖;C:水解精氨酸;D:水解尿素;E:膜斑形成;F:胆固醇需要;G:磷酸酯酶活性;H:需氧四氮唑还原;I:厌氧四氮唑还原;J:红细胞吸附;d:不定;NA:未知;+:阳性;-:阴性;w:弱反应. Note: A: Fermented glucose; B: Fermented lactose; C: Hydrolyzed arginine; D: Hydrolyzed urea; E: Plaque formation; F: Sterol required; G: Phosphatase activity; H: Oxytetrazole reduction; I: Anaerobic tetrazole reduction; J: Erythrocyte adsorption; d: Indefinite; NA: No data available; +: Positive; -: Negative; w: Weak reaction. |
Peacock20181011菌株在无抗生素的培养基中连传10代,在固体培养基上仍可保持原来形态,在低倍镜下呈“煎蛋样”菌落,且能通过0.45 μm滤膜,Dienes染色呈蓝色,表明该菌不是细菌L型。
2.2 致病性试验 2.2.1 SPF鸡胚将菌株卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚培养10 d,鸡胚未见死亡,但存在发育迟缓、生长不良和爪部蜷缩等病变(图 2),平均体重仅14.38 g,而对照组为18.70 g。利用SPSS软件进行统计学分析,接菌组与对照组鸡胚的体重差异显著(0.01 < P=0.04 < 0.05)。
2.2.2 对SPF鸡的致病性在攻毒后的2周内,鸡群每天的精神、食欲等基本正常,仅在接种后的前2天有轻微的呼吸道症状。2周后,剖检攻毒鸡,其气管、气囊、肺和肝脏等均未见肉眼可见的病变。但对攻毒后48-120 h的鸡群进行病原分离,结果均分离到支原体。对攻毒鸡的咽喉棉拭子进行支原体16S rRNA基因的核酸检测,PCR结果均呈现阳性,而对照鸡均为阴性。120 h以后,病原分离率和核酸阳性率明显降低,这表明支原体在攻毒鸡群中发生了复制和感染。
2.3 最小抑菌浓度测定新分离菌株对常见的8种抗生素的最小抑制浓度测定(MIC)结果见表 2,显示出该菌对药物硫酸新霉素、酒石酸泰乐菌素、乳酸环丙沙星、单硫酸卡那霉素、氟苯尼考和盐酸多西环素敏感,而对阿莫西林和氨苄西林钠不敏感。
抗生素 Antibiotic |
含量 Content |
最小抑菌浓度 MIC (μg/mL) |
生产厂家 Manufacturer |
硫酸新霉素 Neomycin sulfate (NEO) |
655 U/mg | 12.5 | 宜昌三峡制药有限公司 Yichang Sanxia Pharmaceutical Company Limited |
氨苄西林钠 Ampicillin sodium (AMP) |
88.7% | > 5 000 | 齐鲁天和惠世制药有限公司 Qilu Tianhe Pharmaceutical Company Limited |
酒石酸泰乐菌素 Tylosin tartrate (TYL) |
800 U/mg | 39 | 浙江普洛康裕生物制药有限公司 Zhejiang Plo Kangyu Biopharmaceutical Company Limited |
乳酸环丙沙星 Ciprofloxacin lactate (CIP) |
98.7% | 12.5 | 上海京新药业有限公司 Shanghai Jingxin Pharmaceutical Company Limited |
单硫酸卡那霉素 Kanamycin sulfate (KAN) |
799 U/mg | 7.812 5 | 山东齐发药业有限公司 Shandong Qifa Pharmaceutical Company Limited |
氟苯尼考 Florfenicol (FFC) |
98.9% | 6.25 | 浙江康牧药业有限公司 Zhejiang Kangmu Pharmaceutical Company Limited |
阿莫西林钠 Amoxicillin (AMX) |
70% | 1 250 | 湖北鑫润德化工有限公司 Hubei Xinrunde Pharmaceutical Company Limited |
盐酸多西环素 Doxycycline Hydrochloride (DO) |
91.6% | 9.766 | 扬州联博药业有限公司 Yangzhou Lianbo Pharmaceutical Company Limited |
该分离菌株的16S rRNA基因PCR产物长度约1 400 bp,电泳结果见图 3,与测序结果(1 386 bp,GenBank登录号MN420815)相符。
2.4.2 菌株16S rRNA基因序列分析利用Lasergene 7.1进行16S rRNA基因的核苷酸序列同源性比较,Peacock20181011与MGC模式菌株NCTC10183、B2096.8B、B3381-15-2和B2888-13-1A等高度同源,其相似性均在98.4%以上,而与MG、MS的相似性分别为73.2%-75.4%、88.0%-91.2%,差异明显较大,与猪鼻支原体(M. hyorhinis)、牛支原体(M.bovis)和山羊支原体(M. capricolum)的相似性分别为85.3%、89.0%和77.6%,结果见表 3。
菌株 Strains |
登录号 Accession No. |
种 Species |
宿主 Host |
相似性 Identity (%) |
分离国家 Country of origin |
16S rRNA基因长度 Length of 16S rRNA gene (bp) |
分离时间 Year of isolation |
NCTC10183T | LR214950 | M. gallinaceum | Chicken | 99.8 | UK | 1 498 | 1982 |
B20968B | CP011021 | M. gallinaceum | Chicken | 98.4 | South Africa | 1 534 | 2014 |
WVU1853T | CP011096 | M. synoviae | Gallus | 88.0 | USA | 1 508 | 1964 |
PG16T | NR044638 | M. gallInarum | Chicken | 88.3 | USA | 1 435 | 1955 |
17529T | NR025914 | M. metlagridis | Turkey | 89.0 | USA | 1 437 | 1965 |
PG30T | NR025064 | M. iners | Chicken | 89.1 | USA | 1 467 | 1960 |
ATCC VR-2580 | AF121890 | M. hyorhinis | Swine | 85.3 | USA | 1 473 | 1999 |
M1601 | HM155915 | M. capricolum | Goat | 77.6 | China | 1 432 | 2010 |
695T | NR044669 | M. iowae | Turkey | 73.8 | USA | 1 461 | 1982 |
PG31T | JN935840 | M. gallisepticum | Chicken | 73.9 | USA | 1 437 | 1960 |
MYC83 | KX462435 | M. bovis | Cattle | 89.0 | Hungary | 1 520 | 2015 |
注:T:标准模式菌株. Note: T: Type strain. |
由图 4所示,分离菌与MGC的标准模式菌株NCTC10183及B3381-15-2、B2096.8B等位于一个分支,遗传演化关系相对较近;与鸭支原体(M. anatis)、MS、牛支原体(M. bovis)及鸡支原体(M. gallinarum)等则处于不同的分支;而与MG、MI和山羊支原体(M. capricolum)则处于遗传演化关系较远的分支,呈现出较远的遗传距离。
2.4.4 基因组测序测序结果显示,该菌株基因组全长为1 183 913 bp;预测有898个CDS基因;含有3个拷贝5S rRNA,4个拷贝16S rRNA,4个拷贝23S rRNA;(G+C)mol%含量为28.7%。串联重复序列(tandem repeat,TR) 125个,总长为15 308 bp;非编码RNA为46个。
Cluster of orthologous groups of proteins (COG)数据库蛋白功能注释比对结果表明,392个基因完成了蛋白注释,占全部基因的30.06%。在所有注释蛋白中,功能基因较多,有131个,主要参与翻译、核糖体结构和生物合成等;其次是参与碳水化合物的运输和代谢的基因,有51个;参与复制重组和修复的基因有37个。上述各功能注释基因占COG的百分比依次是32.8%、12.8%和9.27%[15]。
细菌致病菌毒力因子(virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)数据库比对结果显示,含有20个毒力因子基因。耐药基因(antibiotic resistance genes database,ARDB)比对显示,含有2个四环素耐药基因。
3 讨论与结论本实验从患呼吸道病的孔雀气管粘液中分离到一株疑似支原体的病原,经对病原体的分离和纯化、形态学观察、Dienes染色及生化试验等证实为支原体。与常见的MG和MS不同,Peacock20181011菌株生长速度较快,经过2-3次纯培养后,液体培养12-20 h即可观察到培养基颜色的变化,而MG和MS等其他支原体一般在1-3 d才发生颜色的改变。致病性研究显示,该菌株不会引起SPF鸡病变,不会致死鸡胚,但可引起鸡胚发育迟缓以及爪部蜷缩等病变,具有一定的鸡胚致病性。结合16S rRNA基因测序,该菌与MGC经典模式菌株NCTC10183 (LR214950)的相似性为99.86%,而与家禽经典菌株MG、MS的相似性仅为73.2%-75.4%和90.7%-93.2%;与猪肺炎支原体、牛支原体和羊支原体的相似性约为84.0%、88.5%和77.6%。上述结果证实,该分离株为支原体属的MGC新菌株。
在这次病原分离、鉴定过程中,在发病孔雀体内同时分离到了传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV),证实了此次孔雀发生的呼吸道疾病是由MGC和ILTV共同引起的,是一种混合感染。Beylefeld等对2003-2015年间从南非家禽粪便中分离出的178株支原体菌株进行了分离鉴定,结果发现MGC在家禽粪便中分离率高达23%,仅次于具有致病性的MG (25%)[8]。中国是一个养殖大国,但对于MGC在中国养禽业流行的现状尚缺乏相关的调查,值得进一步的研究。
支原体无细胞壁,对大多数β-内酰胺类抗生素不敏感。本实验研究了MGC对8种常见抗生素的药敏特性,证实分离株对AMP和AMX不敏感,对NEO、TYL、CIP、KAN、FF、DO敏感[16],并指导应用于临床,取得了较好的防治效果。
支原体是目前发现的能独立生存的最小微生物,其基因组被视为生物生存所必需的最低标准,因此,对其基因组的研究有助于阐明作为一个能够自我复制的极小单位的基本功能。全基因组测序表明,新分离菌株的基因组全长为1 183 913 bp,(G+C)mol%含量为28.7%,与英国支原体模式菌株NCTC10183高度像似(基因组长度为1 074 838 bp,(G+C)mol%含量为28%),而与2015年Abolnik等分离的南非MGC毒株B2096.8B (CP011021)有明显差异,后者的基因组全长仅为845 307 bp[17]。很显然,中国菌株的基因组比国外同种的菌相对较长,具有显著的中国特色。
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