微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (6): 1787−1794

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罗曼, 万婧倞, 黄仕新, 唐旭, 徐长安
LUO Man, WAN Jing-Liang, HUANG Shi-Xin, TANG Xu, XU Chang-An
南极沉积物来源抗菌细菌的筛选及抑菌物质的鉴定
Screening of antimicrobial bacteria from Antarctic sediments and identification of antagonistic substance
微生物学通报, 2020, 47(6): 1787-1794
Microbiology China, 2020, 47(6): 1787-1794
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190807

文章历史

收稿日期: 2019-10-09
接受日期: 2019-12-30
网络首发日期: 2020-01-06
南极沉积物来源抗菌细菌的筛选及抑菌物质的鉴定
罗曼 , 万婧倞 , 黄仕新 , 唐旭 , 徐长安     
自然资源部第三海洋研究所    福建  厦门    361005
摘要: 【背景】 科学研究表明,由于南极环境条件特殊,微生物资源丰富,有望筛选出功效显著的抗菌微生物。【目的】 以黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)为指示菌,从南极沉积物中分离筛选具有拮抗作用的细菌菌株并对其抑菌物质进行初步鉴定。【方法】 应用平板对峙法和琼脂扩散法分别对样品和发酵液进行初筛和复筛,筛选出对F. equiseti抑菌效果最强的菌株,基于形态学、生理生化、分子生物学分析,对该菌株进行鉴定。之后,对目标菌株发酵上清中的抑菌物质进行抑菌谱研究,并对其抑菌成分进行温度和pH的稳定性检测,通过硫酸铵沉淀的方法初步鉴定发酵液中的抑菌物质。【结果】 从南极沉积物样品中共分离纯化出62株细菌,有5株具有较好的抑菌效果,其中抑菌效果最强的菌株鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii),命名为JYM35。抑菌谱检测结果显示,菌株JYM35对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)和辣椒枯萎病致病菌F. equiseti具有较强的抑菌效果,对长豆褐腐病致病菌笄霉属(Choanephora)有较明显的拮抗作用,对水产致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V. alginolyticus)也有一定的拮抗作用。菌株JYM35发酵上清中所含的抑菌物质热稳定性强且耐碱不耐酸,硫酸铵沉淀后可初步确定其抑菌物质隶属蛋白类。【结论】 菌株JYM35是一株产蛋白类活性物质的广谱型抑菌菌株,对枯萎病致病菌的拮抗作用最强。因此具有较好的开发利用价值。
关键词: 南极沉积物    木贼镰刀菌    筛选    抑菌谱    抑菌物质    
Screening of antimicrobial bacteria from Antarctic sediments and identification of antagonistic substance
LUO Man , WAN Jing-Liang , HUANG Shi-Xin , TANG Xu , XU Chang-An     
Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Xiamen, Fujian 361005, China
Abstract: [Background] Scientific research shows that due to the special environmental conditions in Antarctica and the abundance of microbial resources, it is expected to screen out highly effective antimicrobial microorganisms. [Objective] To isolate and screen out antimicrobial strain from Antarctic sediments and to make preliminary identification of antibacterial substance, by using the pathogen of cucumber fusarium wilt named F. equiseti as indicator fungus. [Methods] The plate-based confrontation method was used to screen the strain from sediment samples and fermentation broth, with the strongest antimicrobial effect on Fusarium equiseti. Based on morphological, physiological, biochemical, molecular biology analysis, the strain was identified. Then the antimicrobial spectrum of antimicrobial substance in the fermentation broth was studied, and the stability of the antimicrobial component was detected under different temperatures and pH conditions, and the antimicrobial substance in fermentation broth was identified by the method of ammonium sulfate precipitation. [Results] A total of 62 bacteria were isolated from the Antarctic sediment samples, and 5 were with better antiseptic effects, of which the most effective strain was identified as Bacillus subspedestion (Bacillus subtilis subsp. spizizenii) and named JYM35. The result of antimicrobial spectrum showed that JYM35 is of strong antagonistic effect on the pathogen of towel gourd fusarium wilt named F. proliferatum and pathogen of pepper fusarium wilt named Fusarium equiseti, and has antagonistic effect on brown rot of long-bean named Choanephora, and also has certain antimicrobial effect on aquatic pathogen named Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus as well. The antagonistic substance contained in the fermentation broth of JYM35 has the characteristic of high thermal stability, and it is resistant to alkali but not to acid. Through ammonium sulfate precipitation, it can be preliminarily determined that the antagonistic substance belongs to proteins. [Conclusion] Strain JYM35 is a broad-spectrum antimicrobial strain that produces protein-like active substance and has the strongest antagonistic effect against fusarium wilt.
Keywords: Antarctic sediment    Fusarium equiseti    Screening    Antibacterial spectrum    Antagonistic substance    

植物病害是影响我国农业发展的一大重要因素,农作物因各种病害原因减产给我国的经济造成了重大损失[1]。导致植物病害的原因有很多,目前可大致分为两大类:非侵染性因素和侵染性因素,侵染性因素是造成植物病害的主要方面,包括细菌、真菌、病毒、线虫、寄生性植物及其他病原物在内的病源都属于侵染性因素[2]。其中,由镰刀菌引起的枯萎病是瓜果蔬菜的常见病害[3]。染病植株若不及时防治,病害则将会迅速蔓延,造成植物的枯萎死亡,从而影响品质和产量。目前,化学防治在枯萎病治理中占主导地位,但由于化学农药的长期使用,不仅使很多病害植株产生了抗药性,还让化学农药通过食物链进入了人体,危害人体健康[4]。因此,开发利用绿色有机的病害防治方法成为了一个崭新的目标,在这一契机下,生物防治手段成功登上了研究舞台。其中微生物防治手段在生物防治中脱颖而出,其使用安全,不产生抗药性。在我国,利用微生物防治病害已取得很好的成果[5]

由于极地环境独特的地理和气候等条件,使得极地微生物的代谢调控机制及生理生化特征也具有一定的独特性[6-8]。因此南北极区域被认为是新型生物活性物质和先导化合物菌株的种源地,是有重要意义的潜在微生物资源库[9-12]。董宁[13]对南极格罗夫山地区的微生物进行研究,分离获得了具有产胞外酶活性的抗菌菌株。贺瑞含等[14]从北极土壤中分离得到了金黄色葡萄球菌和鲍氏不动杆菌的拮抗细菌。近年来的研究结果均表明,从极地微生物中可分离到具有良好生物活性的菌株,显示了极地微生物资源巨大的开发应用潜力。其中在细菌的抗菌效果研究中,枯草芽孢杆菌显示出其独特的优势,它分布广,抗菌性能好,为后续的实际应用奠定了较好的理论研究基础,已有大量文献报道过枯草芽孢杆菌的抗真菌性能,于杰等[15]从香蕉根部土壤分离出了一株对香蕉枯萎病具有抑制作用的枯草芽孢杆菌。牛焕杰等[16]从枯草芽孢杆菌中分离的抗菌蛋白对苹果树腐烂病菌丝有较好的抑制作用。本实验以南极沉积物为研究对象,筛选出了一株对黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌有拮抗作用的细菌并鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种,其抑菌谱的研究结果显示目标菌株对枯萎病具有较好的抑制作用,对目标菌株的抑菌物质进行了理化性质的研究并初步鉴定其抗菌物质隶属蛋白类,为后续的分离纯化奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品

筛选目标菌株的样品取自南极,无菌条件下送回本实验室4 ℃保存。

1.1.2 指示菌

木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、笄霉属(Choanephora)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和沙门氏菌(Salmonella)由本实验室保藏。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V. alginolyticus)由厦门大学生物实验室提供。

1.1.3 培养基

2216E培养基(g/L):蛋白胨5.0,酵母膏1.0,磷酸高铁0.1,过滤陈海水1.0,固体培养基另加琼脂18.0,pH 7.6;

PDA培养基(g/L):BD Difco品牌,pH 7.2;

PDB培养基(g/L):BD Difco品牌,pH 7.2;

LB培养基(g/L):固体培养基中加入琼脂粉18.0,pH 7.0。

以上培养基1×105 Pa灭菌30 min备用。

1.1.4 主要试剂和仪器

DNA Marker,北京宝日医生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,上海赛百盛基因技术有限公司。生化培养箱,宁波莱福科技有限公司;全温大容量振荡器,太仓实验设备厂;Veriti 96 Thermal cycler PCR仪,应用生物系统公司;徕卡显微镜DM750,徕卡仪器有限公司;抑菌圈测量仪,杭州迅数科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

在无菌条件下,将适量样品放入装有50 mL无菌过滤海水的锥形瓶中,20 ℃、180 r/min振荡培养30 min。将样品进行梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4,各取50 µL均匀涂布于2216E固体培养基上,20 ℃培养箱倒置培养3 d。挑取形态不同的菌落在2216E固体培养基上划线分离纯化3次,纯化后的菌株保藏于磁珠管。

1.2.2 筛选

(1) 拮抗菌株的初筛

将黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌接于PDB培养基中,于28 ℃、180 r/min摇床培养3 d,取50 µL均匀涂布于PDA培养基,28 ℃培养箱中培养4 d,得指示菌平板。将从1.2.1中分离纯化得到的细菌菌株接种于2216E液体培养基,20 ℃、180 r/min摇床培养24 h,获得细菌培养液。取出上述指示菌平板用Φ6 mm的打孔器打孔得指示菌菌饼,将菌饼放于PDA平板中央,菌饼周围用打孔器打孔,孔中加入50 µL待测细菌培养液,28 ℃培养3-4 d,观察是否有抑菌效果。

(2) 拮抗菌株的复筛

利用琼脂扩散法[17]进行抑菌效果复筛。将初筛得到的具有抑菌效果的细菌接入50 mL 2216E液体培养基中发酵培养3 d,菌株发酵液于12 000 r/min离心10 min后取上清过0.22 µm无菌滤膜备用。将指示菌培养液按0.1%的比例接入冷却至50 ℃左右的PDA培养基中,倒平板。待平板凝固后用Φ6 mm的打孔器打孔,孔中加入上述待测菌株发酵液样品,以加入无菌培养基的孔作为空白对照,平板置于28 ℃恒温箱中培养3-5 d,观察抑菌效果。每组实验3次重复。

1.2.3 菌株的鉴定

(1) 形态学与生理生化鉴定

目标菌株在2216E固体培养基上20 ℃培养48 h后,观察菌落形态。根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》[18]和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定[19]

(2) 16S rRNA基因的分子生物学鉴定

目标菌株基因DNA利用细菌基因组DNA试剂盒提取。以16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,引物为27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3′)。PCR反应体系(50 µL):2×Taq PCR Mater Mix 25 µL,27F (10 µmol/L) 2 µL,1492R (10 µmol/L) 2 µL,Template DNA 2 µL,ddH2O 19 µL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,测序结果在NCBI上通过BLAST进行序列同源性比对,确定目标菌株的分类地位。利用MEGA 7软件制作菌株系统发育树。

1.2.4 抑菌谱的测定

按照1.2.2中的琼脂扩散方法测定目标菌株对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌、辣椒枯萎病致病菌木贼镰刀菌、长豆褐腐病致病菌笄霉属和灰霉病致病菌灰葡萄孢菌4株病原真菌的抑菌效果。将苏云金芽孢杆菌、沙门氏菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌5株细菌指示菌培养液按0.1%的比例接入冷却至50 ℃左右的LB培养基中,倒平板。待平板凝固后用Φ6 mm的打孔器打孔,孔中加入按1.2.2中复筛的方法处理过的目标菌株发酵液样品,以加入无菌培养基的孔作为空白对照,平板置于37 ℃恒温箱中培养24 h,观察抑菌效果。每组实验3次重复。

1.2.5 抑菌物质的稳定性分析

将菌株JYM35接种于LB培养基中37 ℃、180 r/min发酵培养3 d,发酵液4 ℃、8 000 r/min离心10 min,得菌株发酵上清液。

(1) 温度对抑菌物质活性的影响

取发酵上清液3份,分别置于60、80、100 ℃处理1 h,按照1.2.2中的琼脂扩散法测定各处理发酵液的抑菌活性,以原发酵液作为对照。

(2) pH值对抑菌物质活性的影响

取发酵上清液7份,调节pH为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0,按照1.2.2中的琼脂扩散法测定处理发酵液的抑菌活性,以原发酵液作为对照。

1.2.6 抑菌物质的初步鉴定

1.2.5中得到的发酵上清液于冰上边搅拌边加入硫酸铵固体,使饱和度达到60%,4 ℃静置过夜。上述液体4 ℃、10 000 r/min离心10 min,分别收集离心液和沉淀,沉淀用纯水复溶后加入到处理好的3 000 Da的透析袋中,于4 ℃冰箱中进行透析除盐,透析时间为24 h,每2-4 h换液一次。所得透析液与离心液、发酵上清液一同按照1.2.2中的琼脂扩散法测定抑菌活性。

2 结果与讨论 2.1 菌株分离、纯化及筛选结果

以南极沙土沉积物为样品,分离纯化出62株细菌,通过初筛和复筛,确定有5株细菌的胞外产物具有较好的抑菌效果,抑菌效果见表 1表 1中结果显示,菌株JYM35对黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌的抑菌效果明显强于其余4株细菌的抑菌效果,其抑菌效果如图 1所示。因此,选取JYM35作为后续实验的菌株。

表 1 菌株发酵液对指示菌的抑菌效果 Table 1 Bacteriostatic effect of fermentation broth on indicator bacteria
菌株编号
StrainNo.
抑菌效果
Antibacterialeffect
JYM30 ++
JYM31 ++
JYM35 +++
JYM48 ++
JYM50 ++
注:打孔器直径为6 mm,抑菌圈>6 mm认为有抑菌活性. +:有抗菌效果,抑菌圈在6-10 mm之间;++:抑菌圈在10-15 mm之间;+++:抑菌圈在15 mm以上.
Note: The diameter of the perforator is 6 mm, and the bacteriostatic zone>6 mm is considered to have bacteriostatic activity. +: Antibacterial effect, and the inhibition zone is between 6-10 mm. ++: The inhibition zone is between 10-15 mm. +++: The inhibition zone is above 15 mm.

图 1 菌株JYM35的抑菌效果图 Figure 1 Antibacterial effect of strain JYM35
2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态与生理生化鉴定结果

菌株JYM35在2216E平板上20 ℃培养48 h后呈乳白色、圆形、湿润且微隆起的菌落。目标菌株革兰氏染色结果为阳性。菌株JYM35的生理生化鉴定结果如表 2所示。

表 2 菌株JYM35的生理生化鉴定结果 Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain JYM35
项目
Items
结果
Result
革兰氏染色Gram staining +
接触酶实验Catalase test +
淀粉水解实验Starch hydrolysis test +
V-P实验V-P test -
甲基红实验Methyl red test -
柠檬酸盐利用实验Citrate utilization test -
硝酸盐还原实验Nitrate reduction test -
吲哚实验Indole test -
注:+:阳性;-:阴性.
Note: +: Positive; -: Negative.

2.2.2 16S rRNA基因的分子生物学鉴定结果

通过在NCBI上对菌株JYM35测序结果的同源性比对及构建的系统发育树分析,菌株JYM35被鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii),菌株的GenBank登录号为MN511799。系统发育树如图 2所示。

图 2 菌株JYM35的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of strain JYM35 注:括号中序号代表菌株序列号;分支点上的数字代表可信度,数值越大,可信度越强;标尺代表遗传距离,标尺越短代表亲缘关系越近. Note: The serial number in brackets represents the serial number of the strain; The number on the branch point represents the credibility, the larger is more credible; The ruler represents genetic distance, and the shorter shows the more closely related.
2.3 抑菌谱测定结果

抑菌谱测定结果如表 3所示。菌株JYM35对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌和辣椒枯萎病致病菌木贼镰刀菌抑菌效果明显,对长豆褐腐病致病菌笄霉属抑菌效果较为明显,对水产致病菌副溶血弧菌和溶藻弧菌有抑菌活性。说明菌株JYM35是一株广谱型抑菌菌株,并对枯萎病致病菌有较强的抑制作用。到目前为止,研究者[20-22]对极地微生物抗菌功能的研究均以病原细菌作为指示菌,针对植物病原真菌抗菌功能筛选的研究较少,因此本实验的菌株JYM35具有一定的研究价值。

表 3 菌株JYM35的抑菌谱检测结果 Table 3 Bacteriostatic spectrum assay results of strain JYM35
指示菌菌种
Indicatorstrain
抑菌效果
Antibacterialeffect
笄霉属Choanephora ++
木贼镰刀菌Fusarium equiseti +++
层生镰刀菌Fusarium proliferatum +++
灰葡萄孢菌Botrytis cinerea -
迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda -
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis -
副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus +
溶藻弧菌Vibrio alginolyticus +
沙门氏菌Salmonella -
注:打孔器直径为6 mm,抑菌圈>6 mm认为有抑菌活性. +:有抗菌效果,抑菌圈在6-10 mm之间;++:抑菌圈在10-15 mm之间;+++:抑菌圈在15 mm以上.
Note: The diameter of the punch is 6 mm, and the bacteriostatic zone>6 mm is considered to have bacteriostatic activity, +: Antibacterial effect, and the inhibition zone is between 6-10 mm. ++: The inhibition zone is between 10-15 mm. +++: The inhibition zone is above 15 mm.
2.4 抑菌物质的稳定性检测结果

2.4.1 温度对抑菌物质活性的影响

菌株JYM35发酵上清液于60、80、100 ℃处理1 h后,指示菌平板每孔加样50 µL,各处理样品的抑菌活性结果如图 3所示,由图 3可知菌株JYM35的抑菌物质在100 ℃条件下处理1 h后基本失去活性,在60 ℃和80 ℃条件下处理1 h后与原发酵液对比活性基本未受影响,说明此抑菌物质的热稳定性较好。

图 3 温度对抑菌物质活性的影响 Figure 3 Effect of temperature on the activity of antagonistic substance 注:Normal:未处理的发酵液的抑菌效果;60、80、100 ℃分别代表发酵液在60、80、100 ℃下处理1 h的抑菌效果. Note: Normal: The antibacterial effect of the untreated fermentation broth. 60, 80, and 100 ℃ represent the antibacterial effect of the fermentation broth treated at 60, 80, and 100 ℃ for 1 h.

2.4.2 pH值对抑菌物质活性的影响

菌株JYM35发酵上清液pH值为8.28,将发酵上清pH值调为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0后进行抑菌活性检测,指示菌平板每孔加样50 µL,各梯度处理发酵液的抑菌活性结果如图 4所示,由图 4可知,在pH≤7.0时,随着pH值的降低,菌株JYM35的抑菌物质活性逐渐下降,pH值为1.0时抑菌物质失去活性;在pH>7.0时,其活性基本未受影响,因此可初步判断此抑菌物质耐碱不耐酸。

图 4 pH值对抑菌物质活性的影响 Figure 4 Effect of pH on the activity of antagonistic substance 注:A:pH≤7.0;B:pH>7.0. Normal:未处理的发酵液抑菌效果;pH 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0分别代表发酵液在不同pH值下处理后的抑菌效果. Note: A: pH≤7.0; B: pH > 7.0. Normal: The antibacterial effect of the untreated fermentation broth. pH1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 9.0, 11.0, and 13.0 respectively represent the antibacterial effect of the fermentation broth after treatment at different pH values.
2.5 抑菌物质的初步鉴定结果

菌株JYM35的发酵液经离心、盐析和透析后分别得到发酵上清液、盐析离心液和透析液,3种溶液的pH值分别为8.28、7.89和6.33,以木贼镰刀菌为指示菌进行抑菌活性测定,平板加样顺序由左上角开始顺时针为发酵上清液、盐析离心液和透析液,每孔加样20 µL,抑菌效果如图 5所示,由图 5可知透析液存在明显的抑菌效果,因此可以初步判断菌株JYM35的抑菌物质隶属蛋白类。其中盐析离心液也呈现出一定的抑菌效果,因为硫酸铵饱和度为60%时无法沉淀发酵液中的所有蛋白,因此残留蛋白仍具有一定的抑菌活性。

图 5 JYM35发酵上清液、盐析上清液、盐析沉淀透析液的抑菌活性 Figure 5 The inhibitory activity of JYM35 fermentation supernatant, salting out supernatant and salting out precipitated dialysate 注:Normal:JYM35发酵上清液的抑菌效果;Treatment 1:盐析后离心上清液的抑菌效果;Treatment 2:盐析后沉淀透析液的抑菌效果. Note: Normal: The antibacterial effect of JYM35 fermentation supernatant; Treatment 1: The antibacterial effect of centrifugal supernatant after salting out; Treatment 2: The antibacterial effect of precipitated dialysate after salting out.
3 结论

本实验以黄瓜枯萎病致病菌木贼镰刀菌为指示菌,从南极沉积物样品中进行拮抗细菌的筛选,共分离出62株细菌,其中有5株细菌的胞外产物显示出了较好的抑菌活性,抑菌效果最好的菌株JYM35经形态学、生理生化和系统发育树分析鉴定为枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)。对菌株JYM35进行了抑菌谱的检测,结果显示其对丝瓜枯萎病致病菌层生镰刀菌和辣椒枯萎病致病菌木贼镰刀菌具有明显拮抗作用,对长豆褐腐病致病菌笄霉属有一定的拮抗作用,对水产致病菌副溶血弧菌和溶藻弧菌也有抑菌效果。菌株JYM35的发酵上清中所含抑菌物质热稳定性强且耐碱不耐酸,硫酸铵沉淀透析后可初步确定其抑菌物质为蛋白类。因此菌株JYM35是一株特异性拮抗枯萎病且产活性蛋白的广谱型抑菌菌株,具有一定的研究价值。

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