微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (5): 1503−1514

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詹艺舒, 李婕, 褚秀丹, 蔡志英, 纪鹏伟, 陈炳智, 江玉姬
ZHAN Yi-Shu, LI Jie, CHU Xiu-Dan, CAI Zhi-Ying, JI Peng-Wei, CHEN Bing-Zhi, JIANG Yu-Ji
一株真菌拮抗细菌Z21的筛选与鉴定及其发酵条件优化
Screen, identification and fermentation optimization of an antifungal bacterium Z21
微生物学通报, 2020, 47(5): 1503-1514
Microbiology China, 2020, 47(5): 1503-1514
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190622

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收稿日期: 2019-07-29
接受日期: 2019-12-18
网络首发日期: 2020-01-06
一株真菌拮抗细菌Z21的筛选与鉴定及其发酵条件优化
詹艺舒1 , 李婕1 , 褚秀丹1 , 蔡志英2 , 纪鹏伟3 , 陈炳智1,4 , 江玉姬1,4     
1. 福建农林大学食品科学学院 福建 福州 350002;
2. 福建省龙海市农业局 福建 龙海 363101;
3. 漳州市新发生物科技有限公司 福建 漳州 363107;
4. 福建农林大学生命科学学院菌物研究中心 福建 福州 350002
摘要: 【背景】 芽孢杆菌属的许多细菌具有抗逆性强、安全等特点,一直以来都是开发新型活性物质的研究热点。【目的】 筛选对食品腐败真菌有抑制作用的细菌,将其开发为天然食品防腐剂。【方法】 采用平板分离法、平板对峙法、抑制菌丝生长速率法从空气、竹子内生细菌中筛选真菌拮抗菌,通过形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析等方法对其进行鉴定,利用正交试验确定其最优生长条件。【结果】 筛选到一株对6种常见霉菌均有较强抑制作用的细菌Z21。Z21与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus strain CBMB205T)的相似性最高,且形态特征和生理生化特征与CBMB205T菌株基本相符。Z21最佳发酵培养基配方和培养条件分别为:葡萄糖20.0 g/L、NaNO3 20.0 g/L、MgSO4 3.0 g/L,培养温度为32 ℃,培养时间为48 h。【结论】 Z21为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),对黑曲霉、康氏木霉、绿色木霉、少根根霉、易脆毛霉、赭绿青霉的生长具有较强的抑制作用且抑菌效果稳定,为广谱真菌拮抗菌。
关键词: 甲基营养型芽孢杆菌    真菌    拮抗细菌    鉴定    培养优化    
Screen, identification and fermentation optimization of an antifungal bacterium Z21
ZHAN Yi-Shu1 , LI Jie1 , CHU Xiu-Dan1 , CAI Zhi-Ying2 , JI Peng-Wei3 , CHEN Bing-Zhi1,4 , JIANG Yu-Ji1,4     
1. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. Longhai Agricultural Bureau of Fujian Province, Longhai, Fujian 363101, China;
3. Zhangzhou XinFa Biotechnology Company Limited, Zhangzhou, Fujian 363107, China;
4. Center for Fungi Research, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
Abstract: [Background] Many species of Bacillus with the merits of strong stress resistance and safety for human become a research hotspot in exploiting new active substances. [Objective] To isolate and screen antifungal bacteria and develop its active ingredients as a natural bio-antifungal agent of food. [Methods] These methods of plate culture, plate-confrontation and mycelia growth inhibition were used to isolate and screen antifungal bacteria from air and bamboo endophytic bacteria. Z21 was identified based on morphological, physiological, biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. The growth conditions of Z21 were through orthogonal experiment. [Results] Z21 showed strong antifungal activity to 6 kinds of fungi. The 16S rRNA gene sequence of Z21 was consistent with that of Bacillus methylotrophicus CBMB205T, and the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of Z21 were consistent with the CBMB205T strain. The optimum culture conditions for Z21 were 32 ℃ for 48 h with a medium of glucose 20.0 g/L, NaNO3 20.0 g/L and MgSO4 3.0 g/L. [Conclusion] The Z21 was identified as B. methylotrophicus, it showed strongly and stalely inhibitory activities against Aspergillus niger, Trichoderma koningii, Trichoderma viride, Rhizopus arrhizus, Mucor fragilis, and Penicillium ochrochloron. So it was an abroad-spectrum antifungal bacterium.
Keywords: Bacillus methylotrophic    Fungus    Antifungal bacterium    Identification    Fermentation optimization    

大量使用的化学农药和抗生素给食品安全和环境保护带来了巨大的压力,开发新型肽类、脂肽类抗生素在农业生产以及食品防腐保鲜中的应用越来越重要[1]。1945年Johnson等[2]首次发现枯草芽孢杆菌代谢产物具有抗菌功能,之后陆续有专家学者从芽孢杆菌属的细菌中分离出抗菌蛋白、抗菌肽等代谢产物[3]。芽孢杆菌属(Bacillus)具有高效、广谱、安全等特性,是目前研究较为成熟且应用较为广泛的重要生防微生物[4],其中以枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)以及短小芽孢杆菌(B. pumilus)的研究和应用最多[5-6]

2010年,Madhaiyan等[7]首次从韩国传统种植的水稻根际土壤中分离得到一株新的芽孢杆菌,经过鉴定命名为甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)。在分类学上,甲基营养型芽孢杆菌属于厚壁菌门芽孢杆菌纲芽孢杆菌目芽孢杆菌科芽孢杆菌属,广泛分布于自然界中[8]。杨德昌等[9]从渤海海域海泥中分离到一株甲基营养型芽孢杆菌,证明其对于防治黄瓜、番茄、烟草的灰霉、苹果树腐烂病等多种真菌病害有很好的效果。魏新燕等[10]从沧州渤海海域分离得到一株甲基营养型芽孢杆菌BH21,研究表明该菌株的无菌发酵液对葡萄灰霉病菌有较强的抑制作用。吕倩等[11]从南海深海中分离得到一株具有较强抗真菌活性的细菌,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。尹向田等[12]在山东省葡萄研究院的实验室葡萄园根际土壤中分离得到一株菌,试验表明该菌株为甲基营养型芽孢杆菌。王松等[13]从浓香型白酒发酵糟培中分离到一株产细菌素的甲基营养型芽孢杆菌J2B-74,并对其产细菌素的发酵条件进行了优化。

本试验从空气中分离到一株对多种霉菌具有较强抑制作用的细菌Z21,通过16S rRNA基因序列分析、形态学特征、生理生化特征进行鉴定,确定其为甲基营养型芽孢杆菌;并对其抑菌效果进行探究,对其发酵条件进行了优化,为该菌株开发成天然的食品防腐剂提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌种

供试真菌为康氏木霉(Trichoderma koningii)、绿色木霉(Trichoderma atroviride) ATCC 30153、赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)、黑曲霉(Aspergillus niger)、易脆毛霉(Mucor fragilis) ATCC 3093、少根根霉(Rhizopus arrhizus),均为福建农林大学食品微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BPAD) (g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,琼脂15.0,pH 7.4−7.6;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) (g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,琼脂15.0,pH 7.2−7.4;马铃薯液体培养基(PDL):马铃薯200.0 g/L,pH 7.2−7.4;缓冲蛋白胨水:蛋白胨10.0 g/L,pH 7.2−7.4。所有培养基1×105 Pa灭菌30 min,备用。

1.1.3 主要试剂和仪器

可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖等分析纯试剂,国药化学试剂有限公司;PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR仪,Bio-Rad公司;恒温生化培养箱,上海一恒实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗细菌的初筛

拮抗菌的分离:将凝固好的BPDA培养基分别放置在室内和室外空气中暴露30 min,盖上盖子,28 ℃培养24 h。挑取不同菌落形态的细菌用平板划线法进行分离纯化,并保存于牛肉膏蛋白胨试管斜面供筛选。竹子内生菌由福建农林大学生命科学学院微生物实验室提供。

拮抗菌的初筛:采用平板对峙法,取一环细菌,在距离平板中央圆心左右各3 cm处分别划线接种细菌,28 ℃培养72 h,让细菌产生代谢产物并扩散,用无菌打孔器(直径8 mm)在已活化好的康氏木霉平板上打孔,菌块接入含有细菌的PDA平板中央点,28 ℃培养4 d后用游标卡尺分别测量细菌对康氏木霉的抑菌带宽度,筛选拮抗效果强的细菌,每个处理重复3皿。抑菌带宽度为霉菌菌落边缘到细菌菌苔边缘之间的距离(mm)。

1.2.2 拮抗细菌的复筛

从初筛结果中选取一株抑制效果最好的细菌进行复筛,接种一环该细菌于PDL培养基中,28 ℃、130 r/min培养72 h后,4 500 r/min离心20 min,上清液过无菌滤膜(孔径0.22 μm),取其中0.2 mL滤液均匀涂布于PDA平板培养基,以等体积无菌水作为对照,在平板中央分别接入8 mm康氏木霉菌块,28 ℃培养4 d后测定菌丝的生长直径,每个处理重复3皿。霉菌菌落直径采用十字交叉法进行测量,并计算菌丝生长抑制率,其中抑制率(%)=[(对照霉菌菌落直径−处理霉菌菌落直径)/(对照霉菌菌落直径−菌块直径)]×100。

1.2.3 拮抗菌Z21的抑菌谱测定

抑菌实验参照1.2.1步骤中方法,每种指示霉菌重复3皿,确定Z21的抑菌谱。

1.2.4 Z21的鉴定

16S rRNA基因序列分析:利用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492F (5′-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(30 μL):DNA模板1 μL,10×Buffer 3 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2 μL,27F和1492R (10 μmol/L)各1 μL,rTaq酶(5 U/μL) 0.3 μL,ddH2O补足至30 μL。PCR反应条件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序后的拼接结果在NCBI上进行BLAST相似序列检索比对,采用Clustal软件和MEGA软件进行多序列同源性分析,并构建系统进化树。

形态学和生理生化实验:取0.1 mL菌液用100 mL无菌水稀释后涂布于BPDA培养基,37 ℃培养18 h,观察菌落形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度等,并进行革兰氏染色、简单染色和芽孢染色,具体方法参考《常见细菌鉴定手册》[14]。生理生化实验步骤参照参考文献[14-15]。部分理化指标委托中国工业菌种保藏中心测定(Vitek上机测定)。

透射电镜观察:收集在BPDA培养基中培养18 h的拮抗菌进行固定、脱水,后用1%磷钨酸负染1 min前处理后上镜进行观察。

1.2.5 发酵条件优化

(1) 种子液制备:挑取一环Z21接种于装有100 mL PDL培养基的三角瓶中,28 ℃、130 r/min培养18 h。

(2) 不同碳、氮源、金属离子对Z21发酵液抑菌活性的影响:以PDL培养基为对照,采用单因素试验法分别研究添加量为2% (质量体积比)的不同碳源(蔗糖,葡萄糖,可溶性淀粉,甘露醇,乳糖,果糖)、添加量为2% (质量体积比)的不同氮源(大豆蛋白胨,牛肉膏,酵母膏,硫酸铵,柠檬酸铵,NaNO3)、添加量为0.2% (质量体积比)的不同无机盐(NaCl,CaCl,FeSO4,MgSO4,K2HPO4,ZnSO4),以3%接种量接入各培养基,28 ℃、130 r/min培养72 h,按照1.2.2复筛中的方法计算菌丝生长抑制率。采用缓冲蛋白胨水将发酵液进行10倍系列稀释法计算细菌数,确定最佳碳、氮源和无机盐。

(3) 正交试验:根据上述结果,设计3因素4水平的正交试验(表 1)。

表 1 正交试验的因素及水平设计 Table 1 The factors and levels of orthogonal test
水平
Levels
因素Factors
A Glucose (%) B NaNO3 (%) C MgSO4 (%)
1 1 2 0.20
2 2 3 0.30
3 3 4 0.40

(4) 发酵条件优化:采用最佳培养基,测定不同发酵条件对Z21生长以及发酵滤液对康氏木霉菌丝生长的抑菌效果。培养温度分别设计为20、28、32、40 ℃;培养时间分别为24、36、48、60、72、84、96 h,以确定最佳培养温度和时间。

2 结果与分析 2.1 拮抗菌的初筛结果

空气中分离的细菌和竹子内生菌一共38株细菌经过多次的分离纯化后编号为Z1–Z38。其中有9株细菌对康氏木霉有很强的抑制作用,这些细菌对康氏木霉的拮抗实验结果见表 2。其中菌株Z21具有很强的抑制康氏木霉菌丝生长的作用,抑菌带宽度达到25.82±0.66 mm,比另外8株细菌的抑制效果强,差异显著,并且经过连续多次传代后抑菌效果依然稳定,所以对菌株Z21进行进一步的研究。

表 2 9株细菌对康氏木霉的抑制效果(抑菌带宽度,mm) Table 2 The inhibitory effect of 9 strains bacteria on T. koningii (inhibition zone width, mm)
供试菌株
Test strains
重复1
Repeat 1
重复2
Repeat 2
重复3
Repeat 3
平均值
Average value
CK 0 0 0 0.00±0.00
Z21 25.05 25.55 26.85 25.82±0.66a
Z20 21.25 22.45 23.89 22.53±0.93b
Z34 20.34 22.44 22.38 21.72±0.85c
Z32 17.55 18.31 17.88 17.91±0.27d
Z13 17.76 15.00 15.95 16.24±0.99de
Z15 14.55 15.95 16.35 15.62±0.67e
Z3 6.05 7.09 7.99 7.04±0.69f
Z4 6.78 8.05 7.56 7.46±0.45f
Z8 5.55 6.75 6.88 6.39±0.52f
注:数据后不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著.
Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters following the figures.
2.2 拮抗菌的复筛

表 3图 1可以看出,Z21的发酵滤液对康氏木霉具有很强的抑制作用,菌丝生长抑制率达到42.83%。说明Z21在发酵过程中产生具有抑菌效果的活性物质,并分泌至发酵液中,而且抑菌效果稳定。

表 3 Z21发酵滤液对康氏木霉的抑菌效果(菌丝生长直径,mm) Table 3 The inhibition effect of sterile fermented filtrates of Z21 on T. koningii (mycelial growth diameter, mm)
试验号Test No. CK Z21
1 76.96 48.43
2 78.07 47.23
3 80.28 49.16
平均值Average value (mm) 78.44±1.69 48.27±0.98
抑制率Inhibition rate (%) 42.83
注:−:没有抑制.
Note: −: No inhibition.

图 1 Z21发酵滤液对康氏木霉的抑菌效果 Figure 1 Inhibition effect of Z21 fermentation fitrate on T. koningii 注:A:对照组;B:处理组. Note: A: Control group; B: Treatment group.
2.3 Z21的抑菌谱

图 2可以看出,Z21除了对康氏木霉具有很强的抑制效果外,对食品中常见的黑曲霉、少根根霉、赭绿青霉、易脆毛霉、绿色木霉均具有一定的抑制效果。与对照组相比,康氏木霉在含有Z21的平板上其菌丝生长明显受到抑制,在Z21和康氏木霉之间有一条明显的透明带,即抑菌带。从表 4可以看出,Z21的抑菌谱较广、抑菌能力较强,对食品中常见的少根根霉、赭绿青霉、易脆毛霉、绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉都具有很好的菌抑制效果。其中,对康氏木霉和黑曲霉抑制效果最好,抑菌带宽度分别达到了24.13±1.06 mm和18.80±0.23 mm,对绿色木霉和易脆毛霉的抑制效果次之,抑菌带宽度为16.39±0.55 mm和14.39±0.69 mm,对少根根霉、赭绿青霉也有一定的抑制效果。从图 2表 4可知:Z21对许多真菌生长具有较强的抑制作用,可开发成食品天然防腐剂,具有潜在的应用价值。

图 2 Z21的抑菌谱 Figure 2 Antibacterial spectrum of Z21 注:A–F:赭绿青霉、易脆毛霉、康氏木霉、少根根霉、绿色木霉、黑曲霉. Note: A–F: Penicillium versicolor, Mucor fragile, Trichoderma koningii, Rhizopus fuligrum, Trichoderma viride, Aspergillus niger.

表 4 Z21抑菌谱(抑菌带宽度,mm) Table 4 Inhibition spectrum of Z21 (inhibition zone width, mm)
指示霉菌
Indicating mold
重复1
Repeat 1
重复2
Repeat 2
重复3
Repeat 3
平均值
Average value
Trichoderma koningii 24.67 22.91 24.82 24.13±1.06a
Aspergillus niger 18.58 18.79 19.04 18.80±0.23b
Penicillium ochrochloron 6.33 6.35 6.05 6.24±0.17e
Trichoderma atroviride 16.49 16.88 15.80 16.39±0.55c
Mucor fragilis 13.59 14.80 14.78 14.39±0.69d
Rhizopus arrhizus 2.02 2.21 2.02 2.08±0.11f
注:数据后不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著.
Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters following the figures.
2.4 Z21的16S rRNA基因序列分析

16S rRNA基因PCR产物电泳结果(图 3)显示,PCR产物约为1.8 kb,符合常规的16S rRNA基因序列长度。

图 3 Z21 16S rRNA基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 Figure 3 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR product of Z21 Note: M: DL2000 DNA Marker: 1, 2: Z21.

测序所得16S rRNA基因碱基序列已提交GenBank (登录号:MN 240443),并在NCBI数据库上进行BLAST比对,发现Z21与Bacillus methylotrophicus strain CBMB205T (NR16240.1)相似性最高,为99.69%。分析显示Z21与B. methylotrophicus strain CBMB205T (NR16240.1)聚在同一系统分支上(图 4)。因此,初步鉴定Z21为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。

图 4 基于16S rRNA基因序列构建的Z21及相关菌株系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree of Z21 and other related strains based on 16S rRNA gene sequence 注:Bootstrap次数设置为1 000,邻接法构建系统发育树;括号内代表序列GenBank登录号;分支处的数字表示Bootstrap支持率;标尺表示0.5%的序列进化差异. Note: The number at branch nodes are the percentage bootstrap support based on neighbor-joining analysis of 1 000 resample data sets. Numbers in parentheses are GenBank accession number. The numbers in each branch point denote the percentages supported by bootstrap. The scale presents 0.5% sequence variance.
2.5 Z21的形态学特性

图 5可以看出,Z21在PDBA培养基上于37 ℃培养18 h后,菌落直径约3.1−3.9 mm,呈淡黄色,圆形,微微隆起,不透明,边缘整齐,质地粘稠,3 d后菌落表面会出现皱褶。Z21革兰氏染色阳性,有荚膜和芽孢,芽孢圆形。透射电镜观察显示Z21体呈杆状(图 5),两端钝圆,大小为(0.8−1.0)×(1.8−2.4) μm,周生鞭毛。

图 5 Z21的菌落(A)及扫描电镜形态(B) Figure 5 Colony (A) and scanning electron morphology (B) of Z21
2.6 Z21的生理生化特征

Z21的主要生理生化特征见表 5。由表 5可知,Z21好氧,接触酶、明胶水解、脲酶、吲哚产生、淀粉水解、硝酸盐还原、β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、丙酮酸盐、L-吡咯烷酮芳胺酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酶、竹桃霉素耐药、七叶苷水解、多粘菌素B耐药、α-半乳糖苷酶、丙氨酸芳胺酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷酸化和甘氨酸芳胺酶均为阳性,能利用较多种糖类进行发酵。从表 5中可以看出,当pH低于3.0时Z21不生长,生长的pH范围为5.0−9.0;当温度低于4 ℃和高于55 ℃时,Z21不生长,生长温度范围为20−45 ℃;盐耐受范围小于7% (质量体积比)。与参考文献[4, 7, 11]对比,Z21的这些生理生化特征与甲基营养型芽孢杆菌的生理生化特征和生物学特性相符。综合形态特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析,基本确定Z21属于甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)。

表 5 Z21的生理生化特征 Table 5 Physiological and biochemical characteristics of Z21
项目
Items
结果
Results
Oxygen +
Glucose +
Lactose +
Methyl red
Voges-Proskauer test
Nitrate utilization +
Indole production
H2S
Gelatin +
Citrate utilization
Oxidase +
Catalase +
Urease +
Starch +
β-xylosidase +
L-lysine arylamine enzyme
L-aspartate arylamine enzyme
Leucine arylaminese
Phenylalanine arylaminese +
L-proline arylamine enzyme
α-galactosidase +
Alanine arylaminese +
Tyrosine arylase
β-N-acetylglucosidase
Alanine-phenylalanine-proline arylamine enzyme +
Cyclodextrin
D-galactose
Glycogen +
Inositol +
Methyl-α-D-glucopyranylation +
Ellman
Methyl-D-xylosin
α-mannosidase
Maltotriose +
Glycine arylaminese +
D-mannitol +
D-mannose +
D-melose
N-acetyl-D-glucosamine
Ancient sugar +
β-mannosidase
L-pyrrolidone arylamine enzyme +
Phosphorylcholine
Pyruvate +
α-glucosidase +
D-tagatose
Inulin
D-ribose
Putrescine assimilation
L-rhamnose
β-glucosidase +
D-trehalose +
Ambomycin resistance +
Aescin hydrolysis +
Red tetrazolium +
Polymyxin B resistance +
Kanamycin resistance
Temperature (℃) 20−45
pH 5.0−9.0
NaCl concentration < 7%
注:+:阳性;−:阴性.
Note: +: Positive; −: Negative.
2.7 Z21培养条件的优化

2.7.1 不同碳源、氮源和无机盐对Z21生长及发酵液抑菌活性的影响

Z21利用6种不同碳源发酵获得的发酵液(无菌)对康氏木霉有一定的抑制作用(图 6),其中葡萄糖作为碳源的发酵液抑菌率最高为58.56%,显著高于其他碳源。乳糖、蔗糖稍差,果糖、甘露醇、可溶性淀粉和对照组无显著性差异,抑菌效果不理想。葡萄糖作为碳源时Z21数量为8.35 lgCFU/mL,高于其他碳源。从图 6中可以看出,添加不同碳源对细菌生长的数量影响较小,只有乳糖为碳源时,Z21的生长数量明显较少。但碳源对抑菌率的影响较大,可能是抑菌物质的合成与碳源物质有关系,因此葡萄糖是液体发酵培养基的最佳碳源。

图 6 不同碳源对Z21的生长和发酵液抑菌活性的影响 Figure 6 Effects of different carbon sources on the growth and inhibition activity of submerged cultured of Z21 注:不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著. Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase.

6种氮源发酵液均对木霉菌丝生长有一定的抑制作用(图 7),其中抑菌效果较好的是无机氮源NaNO3,抑菌率为69.31%,显著高于其他氮源。在NaNO3中Z21数量不是最高,比不添加氮源组低,为7.77 lgCFU/mL,添加牛肉膏和大豆蛋白胨对Z21的生长有一定的抑制,说明Z21生长不必外加氮源。从图 7可知,不同的氮源对抑菌效果有明显的影响,说明添加不同氮源对抑菌物质的产生会有较大影响。

图 7 不同氮源对Z21的生长和发酵液抑菌活性的影响 Figure 7 Effects of different nitrogen sources on the growth and inhibition activity of submerged cultured of Z21 注:不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著. Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters.

6种不同无机盐发酵液对康氏木霉的抑制作用差异较大(图 8),其中添加了MgSO4的发酵液抑菌率最高,为62.12%,显著高于其他无机盐。拮抗菌Z21在几种无机盐的培养基中生长有显著差异,在FeSO4和ZnSO4的发酵培养基上Z21无法生长,并且对康氏木霉完全没有抑制作用。NaCl、CaCl、MgSO4、K2HPO4对细菌的生长没有很大的影响,但是对康氏木霉的抑制效果有很明显的差异,这可能与抑菌物质的结构或代谢途径有关,有待进一步深入研究。

图 8 不同无机盐对Z21的生长和发酵液抑菌活性的影响 Figure 8 Effects of different inorganic salt on the growth and inhibition activity of submerged cultured of Z21 注:不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著. Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters.

2.7.2 培养基配方的正交试验

根据碳源、氮源以及无机盐的单因素试验结果,选择葡萄糖(A)、NaNO3 (B)、MgSO4 (C) 3个因素进行3因素4水平正交试验(表 6)。因为之前的实验结果显示,在添加不同碳源、氮源和无机盐的培养基中Z21生长无显著性差异,因此正交试验只以抑菌活性为指标,确定最优发酵培养基的配方。正交试验结果表明,3个因素对康氏木霉抑制率的影响顺序为B > C > A,最佳水平组合为A2B1C2,方差分析表明B因素对康氏木霉抑制率的影响显著高于其他几个因素,验证实验证明此组合的抑菌率高于其他组,达到74.06%。综合结果,最佳组合为A2B1C2,即1 L发酵培养基中含葡萄糖20.0 g、NaNO3 20.0 g、MgSO4 3.0 g。

表 6 Z21发酵培养基配方正交试验结果 Table 6 Orthogonal test results of fermentation medium formula of Z21
试验号 Glucose NaNO3 MgSO4 Empty 抑菌率
Test No. (A) (B) (C) column Inhibition
(D) rate (%)
1 1 1 1 1 62.40
2 1 2 2 2 67.91
3 1 3 3 3 56.83
4 2 1 2 3 74.06
5 2 2 3 1 66.44
6 2 3 1 2 58.56
7 3 1 3 2 68.15
8 3 2 1 3 65.11
9 3 3 2 1 61.34
K1j 187.14 204.6 186.06 190.17
K2j 199.05 199.47 203.31 194.61
K3j 194.61 176.73 191.43 195.99
K1J 62.38 68.2 62.02 63.39
K2J 66.35 66.49 67.77 64.87
K3J 64.87 58.91 63.81 65.33
Rj 3.97 9.29 5.75 1.94
最优方案
Optimum parameters
A2B1C2

2.7.3 不同培养温度和时间对Z21生长及发酵液抑菌活性的影响

采用上述最佳发酵培养基配方,对发酵条件进行优化。从图 9可以看出温度对抑菌效果的影响很大,随着温度升高,抑菌率先增大后减小,其中32 ℃的发酵液抑菌率最高,达到78.13%;当温度为20 ℃时抑菌效果最差,可能是因为此时细菌生长缓慢,代谢产物生产少;28 ℃时,虽然细菌数量较多,但产生的代谢物较少;36 ℃时,细菌生长受到影响,抑菌活性也较弱,说明温度对抑菌物质的产生有较大的影响。在最佳发酵温度的基础上对发酵时间进行研究,从图 10可以看出,抑菌率随培养时间的延长先增大后减小,发酵48 h时达到最高,为86.21%,随后抑菌率开始下降。从细菌数量分析,24 h时细菌数最高但抑菌率最低,可能是因为此时抑菌物质产生较少,随后细菌的数量呈现稳定,但抑菌率明显下降了,可能后期培养液环境会影响细菌抑菌物质的活性,或抑菌物质在后期被分解。以Z21抑菌率为指标,参考Z21的生长速度,确定最优的发酵条件为培养温度为32 ℃、培养时间为48 h,此条件下抑菌活性最高,比优化前抑菌率提高了43.38%。

图 9 不同温度对Z21的生长和发酵液抑菌活性的影响 Figure 9 Effect of different temperature on growth and inhibition activity of submerged cultured of Z21 注:不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著. Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters.

图 10 不同时间对Z21的生长和发酵液抑菌活性的影响 Figure 10 Effect of different time on growth and inhibition activity of submerged cultured of Z21 注:不同小写字母表示在P < 0.05水平差异显著. Note: Significant difference at P < 0.05 level was reflected in different lowercase letters.
3 讨论与结论

甲基营养型芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种,对人、畜及环境安全,因此,其作为芽孢杆菌属的“后起之秀”,被应用于环境保护、植保、园艺、食品防腐等各行业中[16]。本试验综合了细菌的16S rRNA基因序列、生理生化特征和形态学特征,确定Z21为甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus)。随后对培养基和发酵条件进行优化,经过优化的无菌发酵液其抑菌率比未优化前提高了43.38%,对康氏木霉生长的抑菌率达到了86.21%,优化效果非常明显,对甲基营养型芽孢杆菌在抑菌条件优化方面提供了一定的借鉴。

木霉、黑曲霉、青霉、根霉以及毛霉是粮食贮藏中主要的风险因素,产生发热霉变,加快粮食有机物的消耗,造成粮食腐败发霉。吴红萍等[17]和李新社等[18]针对海南和湖南等地的粮库调查发现根霉、青霉、木霉、毛霉和曲霉等真菌为优势菌。本实验筛选得到的甲基营养型芽孢杆菌Z21具有广谱的抑菌效果,尤其对木霉、黑曲霉和毛霉的抑菌效果非常好,抑菌带清晰,最大宽度达到24.13±1.06 mm (细菌与真菌接种位置距离为30 mm)。同时,甲基营养型芽孢杆菌在抑制植物病原菌方面的研究比较多[4, 10]且已经应用于生产[9],广泛用于田间治理黄瓜灰霉病等植物病害,是安全的菌种,但是该菌应用在粮食储藏方面的研究比较少[19]。王燕等[20]筛选得到一株具有降解黄曲霉毒素AFB1的甲基芽孢杆菌WZ-4,有望开发成新的微生物新型饲料和食品添加剂。本文研究结果为甲基营养型芽孢杆菌开发成食品防腐剂等方面利用提供一定的参考。

芽孢杆菌属细菌的抑菌机理主要是通过分泌一些次生代谢产物来抑制病原菌的生长[21]。Babad等首次从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗真菌肽[22]。吴燕燕等[23]研究发现,使用甲基营养型芽孢杆菌中抗菌肽对罗非鱼片进行保鲜,结果表明抗菌肽具有很好的保鲜防腐效果,明显延长了罗非鱼片的保鲜时间。Sharma等[24]从孟加拉拉杰沙希大学土壤中分离得到一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus-SCS2012),并发现其粗提物对痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、无乳链球菌等食品中常见的细菌具有很好的抑制效果。因此,甲基营养型芽孢杆菌不仅具有广谱的杀菌抑菌效果,而且对人、环境较安全,是开发新活性物质的一类有益菌[4]。本文的研究结果为Z21活性物质的分离鉴定以及开发为天然品防腐剂应用提供了参考。

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