2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 葸玉琴, 张明旭, 成宏斌, 孔维宝, 贾凌云
- XI Yu-Qin, ZHANG Ming-Xu, CHENG Hong-Bin, KONG Wei-Bao, JIA Ling-Yun
- 响应面法优化细菌EHB01对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的溶藻条件
- Optimization of alginolytic conditions of Microcystis aeruginosa by bacteria EHB01 using response surface methodology
- 微生物学通报, 2020, 47(3): 984-994
- Microbiology China, 2020, 47(3): 984-994
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190533
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文章历史
- 收稿日期: 2019-06-28
- 接受日期: 2019-09-10
- 网络首发日期: 2019-11-06
微藻生长受环境中多方面因素的影响，其中光照、温度、pH是藻类生长的重要影响因素[1]。氮、磷等营养元素大量进入自然水体中，会导致某些有害优势藻类等浮游生物的异常增殖，致使水体腥臭难闻、透明度下降、溶氧量降低及水生生物大量死亡的现象[2]。
据资料显示，全球约有75%以上的淡水湖泊均处于不同程度的富营养化状态，水体富营养化的主要特征是有害藻类水华的大规模暴发；自1960年起，随着水体富营养化的加重及全球气候的变化，全球范围内水生态系统藻类水华的暴发频率和影响程度逐年递增，尤其是有害蓝藻水华发生的范围最广，造成的危害最大[3]。目前已知引起有害蓝藻水华的优势藻种有固氮型藻种如鱼腥藻(Anabaena)、束丝藻(Aphanizomenon)、束毛藻(Trichodesmium)和颤藻(Oscillatoria)等，以及微囊藻(Microcystis)和浮丝藻(Planktothrix)等非固氮型藻种，其中微囊藻是淡水水体中最常出现的优势蓝藻种属之一[4-5]。
关于蓝藻水华的形成机理，学者普遍认为是外部的环境因子和蓝藻自身的特殊生理特点相结合而发生的生态学结果[6]。研究表明：导致蓝藻水华消失的主要原因是真菌寄生、溶藻细菌、浮游动物捕食和噬藻体等与物理-化学因素的结合[7]。Wu等[8]对24株芽孢杆菌(Bacillus spp.)的杀铜绿微囊藻活性进行测试，发现培养7 d后均对铜绿微囊藻表现出不同程度的溶藻活性。Luo等[9]从表层土壤中分离出117株放线菌，发现其中有6株菌对铜绿微囊藻表现出溶藻活性，尤其是链霉菌(Streptomyces sp. L74)的溶藻效率最高。溶藻菌在调节水环境中的微藻组成、藻种丰富度和生理过程中发挥重要作用。细菌在自然环境中具有高度的多样性，加上细菌自身功能丰富、便于培养等优点，因此探究溶藻菌发酵培养工艺，以期为溶藻菌工业化发酵生产提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 供试菌株和藻种实验所需的溶藻细菌EHB01从富营养化水体中通过分离鉴定所得，结合形态学、生理生化试验和16S rRNA基因序列鉴定其隶属于罗尔斯顿菌属(Ralstonia)[10]。铜绿微囊藻购自中科院水生生物研究所淡水藻种库(FACHB-8)。
1.2 主要试剂、仪器和培养基蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、蔗糖、醋酸钠、柠檬酸、硝酸钾和碳酸氢钠等，上海泰坦科技股份有限公司。光照生物培养箱，帕西瓦仪器公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外可见分光光度计，岛津公司。LB培养基(菌株培养)和BG11培养基(微藻培养)的配制参照文献[11]。
1.3 藻细胞叶绿素含量和溶藻率的测定采用热乙醇和超声波结合的方法[12]，每隔12 h取样测定叶绿素浓度。溶藻率[13]的计算公式为：Ae=(C0-Ct)/C0×100%，其中，Ae表示溶藻率，C0表示对照组叶绿素含量，Ct表示实验组叶绿素含量。
1.4 溶藻条件优化 1.4.1 溶藻细菌EHB01发酵液的制备通过预试验判断该菌株溶藻方式为间接作用，即溶藻活性物质主要在其代谢产物中。后期将溶藻细菌EHB01在LB液体培养基中28 ℃、180 r/min振荡培养24 h，获得处于对数期(OD600=0.546±0.002)的细菌发酵产物，10 000 r/min离心10 min，将上清液用0.22 µm的无菌纤维素酯微孔滤膜过滤，收集上清液待用。发酵培养基优化过程中按要求确定培养基各组分浓度。
1.4.2 发酵液浓度对溶藻率的影响将溶藻菌无菌滤液以0%、1%、3%、5%、10%的体积比加到对数生长期(OD685=0.629±0.002)藻液中，28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，以等量的BG11培养基为对照组，通过测定溶藻率的变化来确定溶藻菌的作用效果。
1.4.3 最佳溶藻温度的筛选将溶藻细菌发酵液在10 000 r/min离心10 min后所得的上清液，以5%的接种量分别加入到100 mL处于对数生长期的藻液中。采样主要集中在5-10月份，实际水面温度在20-35 ℃之间，所以设置光照培养箱温度分别为19、22、25、28、31、34 ℃[14]，每个处理3个重复，测定溶藻率。
1.4.4 最佳溶藻光照的筛选将溶藻细菌发酵液在10 000 r/min离心10 min，离心后所得的上清液以5%的量分别加入到100 mL处于对数生长期的藻液中，考虑到实际水环境5-10月份光照范围为18-63 µmol/(m2·s)[15]，培养箱光照分别设置为20、30、40、50、60 µmol/(m2·s)，每个处理3个重复，测定溶藻率。
1.4.5 不同碳氮比对溶藻率的影响参考BG11培养基[11]将碳源(NaHCO3)固定为2 mg/L，按照碳氮比例为CK、5:1、10:1、15:1、30:1、60:1分别添加不同浓度NaNO3为氮源，将溶藻细菌发酵液在10 000 r/min离心10 min，离心后所得上清液以5%的量分别加入到100 mL处于对数生长期的藻液中，测定不同碳氮比对溶藻菌EHB01溶藻效果的影响；固定氮源(NaNO3)为150 mg/L，按照氮碳比例CK、5:1、10:1、15:1、30:1、60:1分别添加不同浓度NaHCO3，测定相应的溶藻率。以不加碳和氮作为对照，每个条件设置3个平行。
1.4.6 不同氮磷比对溶藻率的影响参照1.4.5的方法将氮源(NaNO3)固定为150 mg/L，磷源(KH2PO4)固定为4 mg/L，分别测定氮磷比例为CK、5:1、10:1、15:1、30:1、60:1下的溶藻率。
1.5 溶藻菌培养基优化 1.5.1 最佳溶藻初始pH的筛选使溶藻细菌EHB01其他培养条件不变，只改变细菌LB培养基的pH值，将已经制备好的发酵液按5%的量分别接入pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的LB培养基中，于28℃、160 r/min振荡培养48 h，每个处理3个重复，研究发酵液的溶藻活性。
1.5.2 最佳溶藻碳源和氮源的筛选分别选择胰蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖和甘油为碳源；以酵母提取物、尿素、硫酸铵、硝酸钾和牛肉膏为氮源；以5%的接种量加入发酵液，于28 ℃、180 r/min振荡培养48 h，每个处理3个重复，研究发酵液溶藻活性。
1.5.3 响应面法优化溶藻条件根据单因素试验结果，选取pH、蔗糖、硝酸钾的用量3个因素作为响应变量，利用Design- Expert 8.0.5软件进行3因素3水平的中心组试验(Box-Benhnken)设计，以溶藻率为响应值(表 1)。通过响应面曲面分析进行溶藻细菌EHB01发酵产抑藻活性物质的最佳培养条件，为溶藻微生物菌剂的规模化发酵培养提供理论依据。
| 因素 Factors |
代码 Code |
编码水平 Coding level |
||
| -1 | 0 | 1 | ||
| pH | A | 7.0 | 7.5 | 8.0 |
| 蔗糖 Sucrose (mg/L) |
B | 0.5 | 1.0 | 1.5 |
| 硝酸钾 Potassium nitrate (mg/L) |
C | 10.0 | 15.0 | 20.0 |
采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，用Origin 7.5软件绘图，利用Design-Expert 8.0.5软件进行中心组试验。
2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 2.1.1 不同发酵液浓度对抑藻效果的影响通过比较不同投加比的发酵液对溶藻率的变化，图 1结果表明，随着发酵液浓度的不断增高，溶藻率也逐渐上升。浓度为3%的处理组溶藻率与对照组相比提高了28.24%，处理组5%和10%抑制效果最明显，高达71.59%和84.05%。考虑到溶藻效果和应用可行性，选择5%的投加量开展后期研究。
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| 图 1 发酵液浓度对溶藻率的影响 Figure 1 Effects of fermentation concentration on the algicidal ratio |
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将溶藻细菌发酵液离心后加入到等量的藻液中培养，测定在不同培养温度下细菌溶藻率的变化。如图 2所示，溶藻率在温度为19-28 ℃范围内上升了33.61%，说明随着温度的不断上升，溶藻菌活性物质逐渐达到最优条件，所以溶藻率增高[16]。由于铜绿微囊藻是喜温生物，其最适温度为30-35 ℃[15]，所以温度大于31-34 ℃时藻细胞繁殖快，生物量急剧增多，溶藻率有所降低。
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| 图 2 不同培养温度对溶藻率的影响 Figure 2 Effects of different temperature on the algicidal ratio |
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如图 3所示，当光照在20-40 µmol/(m2·s)时，铜绿微囊藻的光合作用逐渐增强，藻细胞生物量逐渐增多，溶藻率下降，且在光照为40 µmol/(m2·s)时溶藻率达到最低(45.26%)；光照在50-60 µmol/(m2·s)时，部分藻细胞由于光照过强，导致藻细胞新陈代谢受阻，生物量急剧下降且发生部分藻细胞黄化死亡，另一部分则是由于溶藻菌产生抑藻作用而死亡，因而溶藻率上升显著[15]。
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| 图 3 不同光照对溶藻率的影响 Figure 3 Effects of different light on the algicidal ratio |
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从图 4可知，以2 mg/L的NaHCO3为固定碳源、C:N为5:1-15:1时铜绿微囊藻生长均较好, C:N为15:1时铜绿微囊藻获得最大生长密度，其所对应的溶藻率达到最低(37.23%)。而C:N在10时铜绿微囊藻生物量最大，相应的溶藻率为53.61%，说明藻细胞对氮源的吸收要大于碳源[17]。当N:C和C:N分别在15:1-60:1和30:1–60:1时藻细胞生长缓慢，且部分藻细胞由于氮源浓度过高而发生黄化死亡，所以溶藻率均逐渐上升。因此，铜绿微囊藻生长最适的N:C为10:1，所对应的NaNO3浓度为1 500 mg/L，而C:N则为15:1，所对应的NaHCO3为30 mg/L。
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| 图 4 不同碳氮比对溶藻率的影响 Figure 4 Effects of different carbon and nitrogen ratios on algicidal ratio |
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不同比例氮磷浓度对溶藻率的影响如图 5所示，随着N:P和P:N比值的不断增大，铜绿微囊藻的生物量均表现为先上升后下降的趋势，且P:N的生物量变化要明显于N:P，所对应的溶藻率则先降低后上升。其中，磷源(KH2PO4)固定在4 mg/L时，N:P在15:1时溶藻率达到最低(31.05%)，此时的藻细胞生物量最多。而将氮源(NaNO3)固定为150 mg/L时，P:N在15:1时溶藻率也有最小值。当N:P和P:N在30:1-60:1时，部分铵盐和磷酸盐会对藻细胞产生一定的毒害作用，导致藻类死亡[18]。Redfield定律认为，藻细胞组成的N:P原子比为16:1，如果氮磷比超过16:1，磷被认为是限制性因素，反之氮通常被考虑为限制性因素[19]。
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| 图 5 不同氮磷比对溶藻率的影响 Figure 5 Effects of different nitrogen and phosphorus ratios on algicidal ratio |
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pH是影响溶藻率的重要因素，通常pH的变化会影响细胞膜电荷和营养物质与代谢产物的解离，进而影响溶藻菌发酵液对铜绿微囊藻的溶藻效果[20]。对培养基初始pH从5.5-8.0进行优化，由图 6可知，当培养基的初始pH从5.5增加到8.0时，溶藻细菌EHB01发酵液对铜绿微囊藻的抑制作用先上升后下降，溶藻率也先上升后下降；当培养基pH为7.5时，EHB01发酵液溶藻效果最明显，溶藻率高达68.75%，说明溶藻菌EHB01发酵液溶藻最适pH为7.5。
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| 图 6 不同初始pH对溶藻菌发酵液溶藻率的影响 Figure 6 Effect of different pH on the algicidal ratio in algae-lysing bacteria |
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溶藻菌EHB01在不同的碳源培养下，其发酵液的溶藻作用发生明显的差异性，从图 7可知，细菌发酵液对铜绿微囊藻叶绿素含量影响大小依次为：葡萄糖 > 蔗糖 > 甘油 > 胰蛋白胨 > 可溶性淀粉。当溶藻菌EHB01选用葡萄糖为碳源时，溶藻率高达71.62%，比选用蔗糖为碳源的培养基溶藻率高4.74%，考虑到蔗糖的经济性，最终确定蔗糖为最佳碳源。
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| 图 7 不同碳源对溶藻菌发酵液溶藻率的影响 Figure 7 Effect of different carbon sources on the algicidal ratio in algae-lysing bacteria |
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如图 8所示，不同氮源培养基对溶藻菌EHB01溶藻率有一定的影响，在供试的5种氮源中，EHB01对铜绿微囊藻叶绿素含量抑制大小依次为：硝酸钾 > 尿素 > 硫酸铵 > 牛肉膏 > 酵母提取物；以硝酸钾为氮源时，细菌发酵液对铜绿微囊藻抑制最明显，溶藻率高达71.30%，因此选择硝酸钾作为EHB01发酵液最佳的氮源培养基。
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| 图 8 不同氮源对溶藻菌发酵液溶藻率的影响 Figure 8 Effect of different nitrogen sources on the algicidal ratio in algae-lysing bacteria |
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通过CCD设计的pH (5.5-8.0)、蔗糖(10-20 mg/L)和硝酸钾(0.5-1.5 mg/L)的3因素3水平试验，得到17组试验结果，其中溶藻率最大值为86.97%，最小值为39.56% (表 2)。
| 序号 No. |
A：pH | B：蔗糖 Sucrose (mg/L) |
C：硝酸钾 Potassium nitrate (mg/L) |
溶藻率 Algicidal ratio (%) |
| 1 | 7.5 | 20 | 0.5 | 48.09 |
| 2 | 7.0 | 15 | 1.5 | 46.36 |
| 3 | 8.0 | 10 | 1.0 | 41.36 |
| 4 | 7.5 | 10 | 1.5 | 57.41 |
| 5 | 8.0 | 15 | 0.5 | 47.59 |
| 6 | 7.0 | 20 | 1.0 | 39.56 |
| 7 | 7.5 | 15 | 1.0 | 86.33 |
| 8 | 7.5 | 20 | 1.5 | 40.23 |
| 9 | 7.5 | 15 | 1.0 | 86.97 |
| 10 | 8.0 | 15 | 1.5 | 51.22 |
| 11 | 7.5 | 15 | 1.0 | 85.91 |
| 12 | 7.5 | 15 | 1.0 | 86.00 |
| 13 | 7.5 | 10 | 0.5 | 46.35 |
| 14 | 7.5 | 15 | 1.0 | 85.85 |
| 15 | 7.0 | 15 | 0.5 | 48.26 |
| 16 | 7.0 | 10 | 1.0 | 51.23 |
| 17 | 8.0 | 20 | 1.0 | 41.22 |
以溶藻率(algicidal ratio)为响应值，利用Design-Expert 8.0.5对表 2数据进行回归分析，得到二次回归模型方程为：Algicidal ratio (%)=86.21- 3.41A+0.62B-0.5C-4.73AB+2.88AC+1.38BC-21.6A2-16.59B2-21.27C2。
通过回归模型分析响应面的参数，由表 3可知，模型极显著(P < 0.000 1)，失拟项的P=0.002 8，说明失拟不显著(P > 0.05，下同)；其中A2、B2、C2对溶藻率影响较大，达到了极显著(P < 0.000 1)。表 4中R2=0.996 2，说明此模型能解释99.62%响应值变化，校正系数为0.991 4，预测系数为0.942 0，预测值与校正值很接近，说明该模型拟合度很好，可以用来分析和预测溶藻细菌EHB01最佳的溶藻条件。
| 方差来源 Source |
平方和 Sum of squares |
自由度 df |
均方和 Mean square |
F值 F value |
P值 P value |
| Model | 5 836.60 | 9 | 648.51 | 206.41 | < 0.0001 Significant |
| A | 92.82 | 1 | 92.82 | 29.54 | 0.001 0 |
| B | 3.04 | 1 | 3.04 | 0.97 | 0.358 2 |
| C | 2.02 | 1 | 2.02 | 0.64 | 0.449 0 |
| AB | 89.49 | 1 | 89.49 | 28.48 | 0.001 1 |
| AC | 33.24 | 1 | 33.24 | 10.58 | 0.014 0 |
| BC | 7.65 | 1 | 7.65 | 2.43 | 0.162 7 |
| A2 | 1 965.10 | 1 | 1 965.10 | 625.46 | < 0.000 1 |
| B2 | 1 158.65 | 1 | 1 158.65 | 368.78 | < 0.000 1 |
| C2 | 1 904.18 | 1 | 1 904.18 | 606.07 | < 0.000 1 |
| 残差Residual | 21.99 | 7 | 3.14 | ||
| 失拟值Lack of fit | 21.14 | 3 | 7.05 | 32.94 | 0.002 8 Significant |
| 纯误差Pure error | 0.86 | 4 | 0.21 | ||
| 总离差Cor total | 5 858.60 | 16 |
| 项目Item | 数值Value |
| 标准差Std. Dev | 1.77 |
| 平均值Mean | 132.07 |
| 变异系数C.V.% | 3.04 |
| 预测平方和PRESS | 339.53 |
| 系数R2 | 0.996 2 |
| 校正R2 Adj R2 | 0.991 4 |
| 预测R2 Pred R2 | 0.942 0 |
| 信噪比Adeq precisic | 35.790 |
由图 9可知，不同的响应面和等高线图表示不同的两个因素间的相互作用，响应曲面开口向下表示响应值存在稳定的极大值；等高线呈椭圆形则表明因素之间交互作用对响应值影响显著[21]。图 9A、B反映了pH和硝酸钾对EHB01溶藻率的影响，其响应曲面图曲线较陡，等高线呈椭圆形，即pH和硝酸钾对溶藻率的交互效应显著。图 9C、D反映了硝酸钾和蔗糖对EHB01溶藻率的影响，其响应曲面图曲线较陡，等高线呈椭圆形，即硝酸钾和蔗糖对溶藻率的交互效应显著。图 9E、F反映了pH和蔗糖对EHB01溶藻率的影响，其响应曲面图曲线较陡，等高线呈椭圆形，即pH和蔗糖对溶藻率的交互效应显著。
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| 图 9 因素交互作用对溶藻率影响的响应曲线和等高线图 Figure 9 Response surface plot and contour plot showing effects of algicidal ratio 注：pH和硝酸钾对溶藻率交互影响的响应曲面图(A)与等高线图(B)；硝酸钾和蔗糖对溶藻率交互影响的响应曲面图(C)与等高线图(D)；pH和蔗糖对溶藻率交互影响的响应曲面图(E)与等高线图(F). Note: The response surface plot (A) and contour plot (B) of the interaction between pH and potassium nitrate on the algicidal ratio. The response surface plot (C) and contour plot (D) of the interaction between potassium nitrate and sucrose on the algicidal ratio. The surface plot (E) and contour plot (F) of the interaction of pH and sucrose on the algicidal ratio. |
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在该CCD软件的预测结果下，所得理论最佳发酵条件为：pH 7.5，蔗糖15 mg/L，硝酸钾1.0 mg/L，此模型预测的最大溶藻率为86.97%。为了检验模型预测的准确性，综合考虑溶藻菌作为有效的工业菌剂治理水体富营养化的可行性和经济性，确定最佳的模型为：pH 7.5、蔗糖15 mg/L、硝酸钾1.0 mg/L，在最佳的培养条件下溶藻菌EHB01实际溶藻率为85.33%，与预测值误差为±1.64%，无显著性差异，可见该模型较好地预测了实验结果。
3 讨论与结论应用微生物学方法获得高效溶藻菌去除蓝藻水华是一种环境友好型的生物方法。目前研究报道的溶藻菌种类主要有细菌和放线菌类，其溶藻效果也有一定的差异性。张晖等[22]从巢湖中分离得到一株高效的溶藻菌株C1138，隶属于溶杆菌属(Lysobacter)，共培养7-10 d时，溶藻率高达50%以上。Xuan等[23]分离得到一株隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)的溶藻菌AF-1，其对铜绿微囊藻有强烈的杀灭作用，5 d的溶藻效率为93%。
本研究从富营养化水体中获得一株高效的溶藻菌EHB01，72 h的溶藻率可达62.25%，其溶藻作用方式为间接溶藻。王琪等[24]筛选了与有害藻华形成有关的多种杀藻细菌，通过进一步实验判断其为间接溶藻作用方式，本研究中溶藻菌EHB01也属于间接溶藻。
通过添加不同浓度的发酵液可知，浓度是影响溶藻效果的关键因素，其浓度越高，溶藻率越高，这与Yang等[25]探究杀藻细菌群落级生理研究结果相一致。Yu等[26]研究了一种抗微囊藻的杀藻链霉菌，随着添加量的不同，其杀藻具有明显的差异性。铜绿微囊藻的生长与环境因子密不可分，当温度达到铜绿微囊藻繁殖的最适温度时藻细胞生物量急剧增多，溶藻菌EHB01的溶藻效果明显降低；随着光合作用的逐渐增强，藻细胞繁殖加快，生物量增多；当光照过强时，藻细胞代谢途径受到抑制，导致部分细胞黄化死亡，所以溶藻率会有所降低。微藻类的经验分子式说明藻类健康生长及维持生理平衡所需的碳、氮、磷原子比为106:16:1，但不同种类藻细胞的元素组成存在着差异，对各类营养物质的需求也不尽相同[27]。当增加碳氮和氮磷比例时，铜绿微囊藻数量先上升后下降，因而溶藻菌对其溶藻效果也表现为先下降后上升的趋势。本研究考虑到铜绿微囊藻在实际水环境中生长受各种因素影响是不可控的，而溶藻菌的浓度又是决定溶藻率的关键因素，因此对溶藻菌EHB01发酵液进行了条件优化，通过发酵培养工艺得到高浓度、高品质的菌剂产品[28]。发酵培养基中的碳源和氮源既能给EHB01提供生长所需的能量，又能为其合成蛋白质、核酸等化合物提供原材料，因此EHB01对不同的碳氮源吸收具有一定的选择性[29]。
本研究通过单因素试验选择蔗糖为最佳碳源；由于硝酸盐有利于铜绿微囊藻生长并最终导致水体富营养化，考虑到氨氮和硝酸盐为水体中的主要氮源，且环境中氨氧化细菌可将氨态氮转化为硝酸盐，所以选择硝酸钾为最佳的氮源[30]。pH也是影响EHB01生长的重要因素，其变化不但影响细胞膜电荷，而且影响细菌代谢产物的生成和溶藻率[31]。因此选择碳源、氮源和pH作为溶藻菌EHB01发酵培养的关键因素，采用3因素3水平的参数值进行了响应面的分析，最终确定发酵液的最佳培养条件：pH 7.5、蔗糖(15 mg/L)、硝酸钾(1.0 mg/L)。在最优培养下，EHB01的溶藻率为86.97%，无显著性差异，说明该模型较好地预测了溶藻率结果，可用于后期指导溶藻菌菌剂的工业化生产，治理蓝藻水华所带来的水环境污染。
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