2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 谢凤行, 周可, 张峰峰, 赵琼, 孙海波, 王姝, 赵玉洁
- XIE Feng-Xing, ZHOU Ke, ZHANG Feng-Feng, ZHAO Qiong, SUN Hai-Bo, WANG Shu, ZHAO Yu-Jie
- 一株高蛋白含量小球藻TX的分离鉴定及其诱变育种
- Isolation, identification and mutation breeding of Chlorella sorokiniana TX with high protein content
- 微生物学通报, 2020, 47(3): 821-828
- Microbiology China, 2020, 47(3): 821-828
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190626
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文章历史
- 收稿日期: 2019-07-30
- 接受日期: 2019-11-20
- 网络首发日期: 2019-12-21
小球藻作为一种重要的微藻资源，广泛分布于湖泊、海洋等多种水体中。小球藻由于蛋白质含量高，含动物体所需的20种氨基酸[1]，另外还富含不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素等[2]，被广泛应用于保健食品[3]、天然色素[4]、水产养殖饵料[5]、饲料添加剂[6]等多个领域。在水产养殖上，可直接作为鱼、虾、贝类的优质饵料[7]，提高消化酶活性、促进养殖生物生长[8]，还能降解养殖水体中亚硝酸盐、氨氮、硝酸盐和磷酸盐的含量[9-11]，从而有效净化养殖水体。蛋白质是饵料中要考虑的首要营养元素，其特有的营养作用是其他营养素无法替代的[12]，因此作为天然饵料，小球藻蛋白质含量高低直接关系到饵料质量。
微生物育种有自然选育、诱变、细胞融合、基因工程等手段。诱变育种具有操作简单、成本低等优点，被广泛用于动植物和微生物育种，研究者也一直致力于通过诱变手段选育高产藻株方面的研究工作。研究表明，小球藻经紫外诱变后，突变株的生长速率较对照提高6.23%，蛋白含量提高了2.5%[13]；经等离子束、低能离子诱变藻细胞油脂含量得到提高[14-15]；通过甲基磺酸乙脂(ethyl methyl sulfonate，EMS)诱变，突变株的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)产量提高了8.97%[16]；60Coγ-射线辐照结合EMS诱变筛选到的高产多糖突变藻株，添加到南美白对虾日粮中，可显著提高对虾的免疫活性及相关的生化指标[17]。本研究首先对本室选育的具有高效脱氮能力且蛋白含量高达60.8%的小球藻TX进行分子鉴定，并采用紫外诱变、EMS诱变和复合诱变技术对该藻株进行了诱变处理，然后采用96孔板高通量筛选技术选育生长快、蛋白含量高的小球藻突变株，以期为水产养殖天然饵料的培养提供优良的藻种资源。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验用藻种所用的小球藻TX为本室从养殖池中分离保存，总蛋白含量为60.8%，生物量干重为0.57 g/L，前期试验证明该藻株能高效去除水体中氨氮和硝态氮[18]。
1.1.2 培养基小球藻富集及分离培养基BG11 (g/L)：NaNO3 1.5，CaCl2·2H2O 0.036，Na2CO3 0.02，MgSO4·7H2O 0.075，K2HPO4 0.030 5，K2HPO4·3H2O 0.004，柠檬酸0.006，柠檬酸铁氨0.006，EDTANa2 0.000 1，A5溶液1 mL，土壤浸提液40 mL，固体培养基每升加18 g琼脂粉。
突变株初筛培养基M1 (g/L)：(NH2)2CO 0.3，NH4Cl 0.3，NaHCO3 1.0，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.008，固体培养基每升加18 g琼脂粉。
突变株复筛培养基M2 (g/L)：(NH2)2CO 0.3，NH4Cl 0.3，NaHCO3 1.0，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.3，葡萄糖5.0，FeSO4·7H2O 0.008。
1.1.3 主要试剂和仪器Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；EMS为上海源叶生物科技有限公司生产的高纯，含量99%，其他化学试剂由国药集团生产的分析纯。智能光照培养箱，浙江托普仪器有限公司；酶标仪，BioTek公司；智能全自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；PCR仪，Applied Biosystems公司；光学显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司。
1.2 方法 1.2.1 小球藻的分离筛选分别取对虾精养池、鱼虾混养池、养鱼池的表层水500 mL，带回室内，取10 mL接种到100 mL灭菌的BG11液体培养基中，25 ℃光照培养箱中富集培养，光照强度为4 500−5 000 lx，1周后取富集液涂平板，从3种水体中分别挑选1株生长较好的藻株进行纯化。纯化4−5代后，接种到BG11液体培养基中静置培养，25 ℃光照培养1周后取样，测藻液OD600值，选取吸光度值高的用于后续试验。
1.2.2 藻株TX形态观察及分子鉴定将纯化的藻株在BG11固体培养基上划线后光照培养，观察藻落形态，并制片在光学显微镜下观察细胞形态。
通过18S rRNA基因序列分析对TX进行分子鉴定。DNA提取采用Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒，引物为NS1 (5′-GTAGTCATGCTTCTCTC-3′)和NS6 (5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)。PCR反应体系(25 μL)：模板DNA (20−50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer (with Mg2+) 2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，双蒸水20.0 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物回收纯化采用纯化试剂盒，纯化产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.2.3 小球藻TX诱变育种紫外诱变的方法参考文献[13]略有改动：取对数生长期的小球藻4 mL，调整浓度为(1−4)×106 CFU/mL，用20 W紫外灯管，辐射距离10 cm，诱变1、2、3、5、10 min，遮光5 h。
EMS方法参考文献[16]略有改动：取对数生长期的藻液10 mL，6 000 r/min离心10 min，弃上清，用0.8%的EMS (用pH 7.0浓度为0.06 mol/L的磷酸缓冲液配置) 10 mL分别处理10、20、30、40、50、60 min，用1%的硫代硫酸钠终止反应，8 000 r/min离心10 min，用双蒸水冲洗2次，遮光12 h，静置3 d。
复合诱变：用0.4% EMS诱变处理40 min，终止反应，用双蒸水冲洗后，20 W紫外灯照射，距离10 cm，辐射1 min。
将未经诱变和诱变处理的藻液10倍比梯度稀释，取100 μL涂布于M1固体培养基上，置于光照培养箱中25 ℃正置培养，光照强度为4 500− 5 000 lx，光暗比12 h:12 h。培养10 d后，计平板上藻细胞数，计算致死率T：
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其中，未经诱变的为C1，诱变处理的为C2。挑选致死率T > 90%处理的突变株进行初步筛选。
初筛：将颜色较深的突变株用灭菌牙签挑接到96微孔板中，微孔板中装200 μL灭过菌的小球藻液体培养基M1，光照培养7 d，用酶标仪测590 nm处的吸光度值，以未诱变的为对照，对照藻株接6株，以吸光度值最高的作为对照。挑取吸光度值大于对照的藻株，转接到装有10 mL M1液体培养基的试管中，光照培养7 d，测吸光度值，选取吸光度值高的藻株转接到含50 mL M1培养基的100 mL三角瓶中，光照培养6 d后测藻液浓度和吸光度值，初筛生物量高的藻株，培养期间每天摇动瓶3次。
复筛：由初筛的突变株进行继代培养，继代10代后，接种到M2培养基中光照培养，培养条件同上，6 d后取样测OD600值、干重、可溶性蛋白含量和总蛋白含量，筛选生物量高、蛋白含量高的突变株。
1.2.4 测定方法小球藻干重测定：将50 mL离心管于105 ℃烘箱中烘干至恒重，干燥器中冷却后记重W1，分3次加入150 mL藻液进行离心(6 000 r/min，10 min)，去除上清液，用蒸馏水40 mL洗涤3次，离心后去除上清液，藻泥105 ℃烘干至恒重，称重记为W2，干重W (g/L)计算公式为：
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可溶性蛋白含量测定：取20 mL藻液6 000 r/min离心10 min，藻泥用去离子水洗涤2次后悬浮于20 mL 50 mmol/L pH 8.0的磷酸缓冲溶液中，用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎(250 W，20 min，超声5 s，间歇1 s)，细胞破碎液在50 ℃热水浴中提取1 h，提取液10 000 r/min离心20 min，取上清液10 μL，加入考马斯亮蓝G-250染色剂200 μL，利用96微孔板在黑暗条件下反应5 min，590 nm测定吸光度，换算可溶性蛋白浓度。
总蛋白质含量测定：藻细胞总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，将离心烘干后的藻粉称重(约0.1 g)，记录，放入消化管，加入催化片，加入10 mL浓硫酸，420 ℃消解1 h，晾至室温后，利用全自动凯氏定氮仪测定总蛋白质含量。
1.2.5 数据的处理与分析所有指标测定均进行3次重复实验，采用Origin 9.0软件进行数据统计分析和作图，显著性分析通过Duncan进行多重比较，系统发育树采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining法构建。
2 结果与分析 2.1 微藻藻株的分离与筛选从3个样品中共分离到60个分离株，经继代培养，从每个样品中挑选一个颜色较深、生长较快的藻株分别命名为NX、HX、TX。上述3株藻在液体培养基中培养1周后，OD600值分别为0.68、0.77、0.87 (图 1)，蛋白含量分别为56.3%、53.8%和60.8%，TX的吸光度值和蛋白含量相对较高，选择TX用于后续试验。
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| 图 1 分离筛选株的生长和蛋白含量 Figure 1 Growth and protein content of isolated and screened strain of Chlorella sp. |
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TX在BG11固体培养基上培养10 d后，可观察到直径为3−5 mm深绿色藻落，表面光滑，中间凸起。在光学显微镜下观察，细胞呈圆形，绿色，细胞直径4−8 μm。对TX的PCR产物进行测序，核酸序列长度为1 311 bp。序列提交至GenBank中获得登录号为MN249533，与数据库中已收录小球藻的18S rRNA基因进行BLAST分析，NCBI数据库BLAST搜索结果表明，TX与Chlorella sorokiniana的相似性为99%。将得到的序列采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining法建立系统发育树，从图 2可知，TX与藻株MF101221.1 (GenBank登录号NON001)和KY921856.1 (GenBank登录号CMBB151)同处一个分支中，说明TX为Chlorella sorokiniana，与BLAST数据结果一致。
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| 图 2 TX藻株基于18S rRNA基因序列构建的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree based on 18S rRNA gene sequence of TX |
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10 d后统计致死率，发现诱变1、2 min致死率分别为74.9%、98.9%，处理3、5、10 min的致死率均为100%，因此确定最佳的诱变剂量为20 W，距离10 cm，诱变处理2 min。从180个可能突变株中挑选21个OD600值高于对照且颜色较深的藻株，分别命名为Z1−Z21。在三角瓶中继代培养，发现21株中有3株基本不长，其中Z3、Z5、Z11、Z13、Z18、Z21的藻细胞浓度大于1.27×107 CFU/mL，其藻液的吸光度值也相对较高，均大于0.69 (表 1)。6株藻继代培养过程中，Z3和Z18发生回复突变，藻细胞生长较缓，颜色变浅，而Z5、Z11、Z13、Z21比较稳定，继代培养的颜色一直较深，选择此4个突变株用于后续生物量和蛋白含量筛选试验。
| Strains | Cell concentration (×107 CFU/mL) | OD600 |
| TX | 0.92±009 | 0.83±0.07 |
| Z3 | 2.97±0.12 | 1.20±0.11 |
| Z5 | 1.72±0.11 | 0.84±0.05 |
| Z11 | 1.27±0.11 | 0.69±0.02 |
| Z13 | 1.77±0.13 | 0.85±0.04 |
| Z18 | 1.52±0.15 | 0.90±0.03 |
| Z21 | 1.57±0.12 | 0.81±0.06 |
化学诱变10、20、30、40、50、60 min后的致死率分别为11.7%、33.6%、69.6%、91.3%、100%和100%。因此，化学诱变的最佳诱变剂量为0.8%的EMS诱变处理40 min。从180个可能突变株中挑选77个颜色较深且OD600值高于对照的突变株，分别命名为H1−H77，此77个突变株接种到试管中培养后筛选到16个突变株生长较好，将此16个突变株接种到三角瓶中筛选到6个生长较好的突变株(表 2)。6个突变株的细胞浓度均高于对照，OD值在0.79−0.98之间。6个突变株在继代培养中，H31发生了回复突变，H4、H10、H24、H27、H28比较稳定，用于后续蛋白含量筛选试验。
| Strains | Cell concentration (×107 CFU/mL) | OD600 |
| TX | 0.81±0.07 | 0.87±0.03 |
| H4 | 0.89±0.12 | 0.94±0.01 |
| H10 | 1.05±0.13 | 0.88±0.08 |
| H24 | 1.04±0.12 | 0.95±0.04 |
| H27 | 0.94±0.11 | 0.79±0.06 |
| H28 | 1.19±0.09 | 0.98±0.03 |
| H31 | 0.84±0.10 | 0.86±0.06 |
复合诱变从180个可能突变株中挑选到21株生长较好的藻株，经过两次继代培养筛选到8株较好的藻株编号为F1−F8。从表 3可知，F1、F2、F4、F5、F7的OD600值达到1.02以上，细胞浓度达到1.07×107 CUF/mL以上，高于其他突变株，此5个突变株的藻细胞浓度也相对较高。5个突变株在继代培养中，F7出现回复突变，F1、F2、F4、F5比较稳定，用于后续蛋白含量筛选试验。
| Strains | Cell concentration (×107 CFU/mL) | OD600 |
| TX | 0.87±0.07 | 0.81±0.03 |
| F1 | 1.45±0.11 | 1.16±0.03 |
| F2 | 1.22±0.10 | 1.03±0.07 |
| F3 | 0.98±0.12 | 0.85±0.04 |
| F4 | 1.07±0.09 | 1.03±0.04 |
| F5 | 1.22±0.11 | 1.07±0.05 |
| F6 | 1.00±0.13 | 0.96±0.08 |
| F7 | 1.12±0.10 | 1.02±0.05 |
| F8 | 0.93±0.09 | 0.94±0.06 |
从图 3可知，所选的13个突变株中OD600值大于3.1的突变株有8株，其中Z13、H10、H24、H27、H28、F4这6个突变株的OD600值显著高于对照TX。大部分突变株的OD600值达到3.0以上，显著高于诱变初筛时的OD600值1.0左右，主要原因是初筛和复筛用的培养基不同，复筛用的培养基M2中含葡萄糖，是一种混养培养基，这说明部分诱变的突变株能进行混养生长，且混养生长显著优于自养生长。
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| 图 3 突变株的OD600值(A)和干重(B) Figure 3 The OD600 value (A) and dry weight (B) of mutants Note: The different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05). |
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从干重结果分析，Z13、H10、H27、H28的干重显著高于对照，分别达到0.79、0.72、0.68、0.73 g/L，较对照的0.57 g/L提高了38.7%、26.2%、20.3%和27.7%，其中Z13干重最高，达0.79 g/L。整体而言，OD600值高的藻株其干重相对也比较高。在培养条件、接种量和培养时间也一致的情况下，生物量高说明其生长相对较快，依此推断Z13、H10、H27、H28生长相对较快。
2.4.2 蛋白含量分析除反刍动物外，食物蛋白质几乎是唯一可用于动物蛋白质合成的氮来源，在动物的生命活动中具有重要的营养作用[12]，因此饲料蛋白含量直接关系到饲料质量。从图 4可知，选育的小球藻可溶性蛋白含量在0.29−0.44 g/L之间，Z13、H10、H27和F10的可溶性蛋白高于对照，其中H10的可溶性蛋白含量较对照提高了15.8%，显著高于其他藻株。自然选育的藻株TX本身的总蛋白含量高达到60.8%，高于饲料常用的酵母蛋白含量，说明该藻株本身是一株优质的高蛋白饵料藻种资源。TX诱变的突变株H10、H24、H27、F4和F5的总蛋白含量高达64.2%、61.8%、63.3%、61.7%、61.5%，其中H10的总蛋白含量较原始藻株TX提高了3.4%。
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| 图 4 突变株的可溶性蛋白(A)和总蛋白含量(B) Figure 4 The soluble protein (A) and total protein (B) content of mutants Note: The different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05) |
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H10的生物量干重、可溶性蛋白含量、总蛋白含量分别较对照提高26.2%、15.8%和3.4%，综合生长指标和蛋白指标，H10为较优异的突变株，且经过了10代继代培养，说明其优良性状得到了稳定遗传，该突变株可用于天然饵料生产。
3 讨论与结论诱变育种是微生物育种中常用和有效的方法之一，但诱变育种的后期筛选工作量大，因此选择高效的筛选方法至关重要[19]。96孔微孔板透光性高、加样量少(只需200 μL)、通量大(一个板可接96个藻株)。本研究采用96孔板对突变株进行高通量筛选，大大节省了工作量、节约了资源。小球藻自养生长需要光照，在相同培养条件下生物量、吸光度值和生长速率成正比，生长快，其生物量高，吸光度值也就高。因此本研究在初筛时选择96孔板测定590 nm处的吸光度值筛选生长快的藻株，方法科学可行。
小球藻在自养条件下的蛋白含量一般在50%左右，而异养培养的蛋白含量一般只有30%左右[20]。研究表明小球藻混养培养的蛋白产率可达500 g/kg干重，含量达到50%[21]。本研究自然选育的小球藻TX在混养条件下的蛋白含量高达60.8%，高于张学成等[13]报道的突变株Q7蛋白含量的58.73%，且在混养条件下生物量显著高于自养生长。
本研究540个可能突变株中筛选到4个突变株干重显著高于对照，5个突变株的总蛋白含量高于对照，其中H10的生物量干重达0.72 g/L，可溶性蛋白含量达0.44 g/L，总蛋白含量达64.2%，分别较出发藻株提高了26.2%、15.8%和3.4%，且能稳定遗传，说明该突变株可用于天然饵料生产。
本研究中虽然藻细胞浓度比较高，OD600值达到3.1以上，但生物量总体较低，可能是选育的藻株细胞比较小，也有可能取样点为培养的第6天，藻生长还未到达稳定期，生物量未达到最高。在后期的试验中可以做一个突变株H10的生长曲线，以确定最佳的收获时期。另外，可以将蛋白含量高的H10和生长快的Z13的原生质体进行融合，选育生长快且蛋白含量高的融合子。
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