4-甲基苯酚(p-cresol)是一种可随水蒸气挥发，呈现窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、动物臭的苯酚类化合物^[1]。作为酪氨酸的降解产物^[2]，现已发现奶酪、葡萄酒、威士忌和白酒等发酵食品中均含有微量的4-甲基苯酚^[3-6]。4-甲基苯酚阈值低(46%酒精中的阈值为116.97 μg/L)^[7]，百万分之一的4-甲基苯酚即可对食品的风味造成不良影响。

根据生产工艺不同，白酒可细分为十二大香型，其中药香型、浓香型、酱香型、兼香型等基于泥窖或半泥窖发酵的白酒中均检测到了4-甲基苯酚^[8]，它的含量在1.8−3.6 mg/L之间^[9]，是产生窖泥臭的重要化合物^{[7, 10]}。目前对白酒中4-甲基苯酚的研究主要集中在含量检测与来源分析^{[8, 11]}，尚缺少对白酒酿造过程中4-甲基苯酚进行生物法消减的研究。

4-甲基苯酚的去除手段包括物理化学法和生物法。物理化学法如催化氧化、吸附剂吸附等，处理成本高和易产生毒性副产物限制了其应用范围^[12-13]。利用活性炭吸附虽然能较好地消除白酒中的4-甲基苯酚，但也会非特异性吸附其他风味物质，对白酒的品质会有较大影响^[8]。4-甲基苯酚微生物降解法在环境修复领域得到了广泛的研究，4-甲基苯酚降解菌可从富含高4-甲基苯酚的环境中进行筛选，目前发现的4-甲基苯酚降解菌包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、产碱杆菌(Advenella sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、黏鞭霉(Gliomastix indicus)等^[14-20]，这些微生物多生长于中性和弱碱性环境中，培养基中超过一定浓度的4-甲基苯酚会对其生长产生抑制作用。因白酒酿造体系为酸性环境，发酵过程中产生的乳酸、乙酸、丁酸和己酸等使酒醅的pH值低至3.5左右^[21-22]，现已发现的4-甲基苯酚降解菌难以在白酒酿造体系中生长。因此，如何在保证风味不丢失的情况下有效去除白酒酿造体系中的4-甲基苯酚仍需深入研究。

乳杆菌在白酒酿造过程中逐步占据主导地位，在发酵中后期成为白酒酿造体系中的优势微生物^[23]。乳杆菌中的大部分种被公认为安全级微生物，在食品、医药、饲料等相关领域被广泛应用。白酒酿造体系中的乳杆菌不具有降解4-甲基苯酚的途径，若将食品级菌株，如谷氨酸棒杆菌的4-甲基苯酚降解途径导入乳杆菌中，可使重组乳酸菌具有降解4-甲基苯酚的能力。谷氨酸棒杆菌的4-甲基苯酚降解的关键酶包括4-甲基苯基磷酸酯合成酶(CreIH)、磷酸基团识别体(CreJEF)、磷酸水解酶(CreD)、醇脱氢酶(CreC)、醛脱氢酶(CreG)^[24]。该降解途径是有别于其他4-甲基苯酚降解菌株的独特降解途径，其通过4-甲基苯基磷酸酯合成酶将4-甲基苯酚磷酸酯化成4-甲基苯基磷酸酯，减少4-甲基苯酚的同时，产生的4-甲基苯基磷酸酯更易被途径中其他酶识别，促进4-甲基苯酚的完全降解^{[22, 24]}。

白酒作为蒸馏酒，含有4-甲基苯酚主要是由于酒醅中产生的4-甲基苯酚易被蒸馏到原酒中，若将4-甲基苯酚转化成高沸点物质即可减少原酒中的4-甲基苯酚含量。本研究将来源于谷氨酸棒杆菌的4-甲基苯基磷酸酯合成酶编码基因(该酶的两个亚基由creI和creH共同编码^[24])导入来源于白酒酿造体系的高酸耐受性短乳杆菌中，使其具有4-甲基苯酚的消减能力，以期有效降低白酒酿造体系中4-甲基苯酚的含量，对解决4-甲基苯酚引起的异嗅味问题、提高白酒品质具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 菌株和质粒

文中所用的菌株和质粒见表 1。

1.2 主要试剂和仪器及培养基

基因工程工具酶购自宝生物工程(大连)有限公司；4-甲基苯酚购自西格玛奥德里奇公司；其他试剂均为国产分析纯。

气相色谱质谱联用仪GC 6890N-MSD 5975购自Agilent公司；荧光定量PCR仪StepOnePlus Real-Time PCR System购自Thermo Fisher公司。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，9×10⁴ Pa灭菌30 min。GYP培养基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母提取物10.0，胰蛋白胨5.0，无水乙酸钠2.0，MgSO₄ 0.2，NaCl 0.1，FeSO₄·7H₂O 0.1，MnSO₄·H₂O 0.1，葡萄糖单独灭菌后加入，9×10⁴ Pa灭菌30 min。在液体培养基中加入2% (质量体积比)琼脂粉制成固体平板。4-甲基苯酚母液(18.33 mg/mL)用0.22 μm的无菌滤膜过滤除菌后，按需要加入培养基中。红霉素按需要加入，乳酸菌使用的终浓度为1−4 μg/mL，大肠杆菌使用终浓度为200 μg/mL。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸棒杆菌降解4-甲基苯酚能力测试

将平板上活化后的谷氨酸棒杆菌接种至5 mL LB培养基中，30 ℃静置培养24 h，再按10% (体积比)接种至5 mL LB培养基中，30 ℃静置培养12 h作为种子。种子按10% (体积比)接种至5 mL LB培养基中，再加入2 μL 4-甲基苯酚(终浓度约为7.3 mg/L)，37 ℃静置培养48 h。

1.3.2 短乳杆菌的耐酸性测定

将短乳杆菌D17的种子液按10% (体积比)接种量接种于含有10.0 g/L谷氨酸钠的GYP培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。4 ℃、6 000 r/min离心10 min收集细胞后，用pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗菌一次。用含有或不含10 mmol/L谷氨酸钠的pH 7.0磷酸钾缓冲液重悬菌体，使其OD₆₀₀为1.0。37 ℃静置分别培养0、1、2、2.5 h时，立即加入9倍体积含有或不含10 mmol/L谷氨酸钠的pH 2.5磷酸钾缓冲液于菌悬液中，继续静置培养3 h结束。取出样品立即用pH 7.4的PBS缓冲液按10⁻¹−10⁻⁵稀释，选择合适的梯度取100 μL稀释液涂于GYP平板上，37 ℃静置培养24 h后计算平板上菌落数。

1.3.3 短乳杆菌在浓香型白酒酿造体系中的生长

将短乳杆菌D17的种子液按10% (体积比)接种量接种于GYP培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。4 ℃、6 000 r/min离心10 min收集细胞后，D17湿菌体按0.2% (质量比)接种于某浓香型白酒的初始发酵酒醅中，室温下(20−30 ℃左右)密封发酵30 d，其中不添加D17的发酵作为对照。同时取相应的0 d酒醅样品冻存于−20 ℃，待发酵结束后同时分析。

取发酵结束后的样品，提取0 d及发酵30 d酒醅的混菌DNA。根据在白酒酿造体系中存在的乳杆菌与短乳杆菌的基因组差异，确定了短乳杆菌的氨基甲酰磷酸合成酶编码基因cps的部分片段是其特有的。以此特有基因片段设计仅短乳杆菌可扩增的特异性引物Fcps/Rcps (表 2)。以酒醅的全基因组DNA为模板，采用此特异性引物进行荧光定量PCR (qPCR)。PCR反应体系为10 μL，包括2.5 μL DNA模板(10 ng/μL)，引物各20 mmol/L，SYBR-Green-I 5 μL，超纯水1.5 μL。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线阶段：95 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，增加至95 ℃ 15 s，增加梯度为0.5 ℃。16S rRNA基因为参考，确定酒醅中短乳杆菌cps片段的相对丰度，以此表征短乳杆菌在白酒酿造体系中的生长情况。

1.3.4 表达载体的构建及短乳杆菌的转化

根据谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 creI与creH的基因序列设计引物(表 2)。为了creI与creH在短乳杆菌宿主中能串联表达，在creI与creH之间加入适合短乳杆菌的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)。RBS通过RBS Calculator V 2.0在线设计，经计算分析筛选，采用RBS序列(5′-CAGCTTAACCGCAAAGTAGACAAATATAAAGGAGGTCCAAAT-3′)串联creI与creH。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，用引物对F-creI-SacI/R-creI-SmaI与F-SmaI-RBS-creH/R- Hind Ⅲ-creH分别扩增creI与creH。PCR反应体系(50 μL)：模板(100 ng/μL) 2 μL，引物各20 mmol/L，PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，超纯水21 μL。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。采用Omega胶回收试剂盒回收片段creI与creH。采用重叠PCR将RBS、creI与creH连接，取等摩尔creI、creH片段加水补足为5 μL，再加入5 μL PrimeSTAR Max DNA Polymerase，共10 μL体系。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，15个循环；72 ℃ 10 min。以得到的PCR产物为模板，PCR反应体系(50 μL)：模板(PCR产物) 2 μL，引物F-creI-SacI与R-Hind Ⅲ-creH各20 mmol/L，PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，超纯水21 μL。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，最终获得creI-RBS-creH。用限制性内切酶Sac I和Hind Ⅲ对creI-RBS-creH进行双酶切后连接至质粒pMG36e中，得到过表达载体pMG36e-creIH。将过表达载体pMG36e-creIH电转入短乳杆菌中，经含4 μg/L红霉素的GYP平板筛选，挑取单克隆，纯化后得到creIH过表达菌株，提取过表达菌株的全质粒进行PCR验证后，送PCR产物测序。测序正确的克隆即为creIH过表达短乳杆菌菌株。同时短乳杆菌中转入质粒pMG36e的为空白对照菌。

1.3.5 短乳杆菌质粒维持率测定

制备creIH过表达短乳杆菌种子液，按10% (体积比)接种量接种于无红霉素抗性的GYP液体培养基中，37 ℃静置培养，每24 h取样。菌悬液用生理盐水(0.9% NaCl)进行连续稀释后，分别取100 μL稀释液涂于无红霉素及含有终浓度为4 μg/mL红霉素的GYP平板上，37 ℃培养48 h后分别计菌落数。质粒维持率为抗性平板上的菌落数与无抗性平板菌落数的比值。

1.3.6 短乳杆菌creIH过表达菌株消减4-甲基苯酚的发酵实验

(1) 在液体培养基中降解4-甲基苯酚

筛选获得的creIH过表达短乳杆菌与空白对照菌，制成种子液后按10% (体积比)接种量接种于5 mL GYP发酵培养基中(含终浓度约为7.3 mg/L的4-甲基苯酚)，37 ℃静置培养48 h。

(2) 在白酒酿造体系中消减4-甲基苯酚

制备100 mL creIH过表达短乳杆菌的种子液，经4 ℃、6 000 r/min离心10 min收集细胞后，用10 mL无菌生理盐水重浮。取1 mL菌液接种至100 g的出池底层酒醅中，搅拌均匀，密封后37 ℃静置培养48 h。

1.3.7 4-甲基苯酚的SPME-GC-MS检测

取去除菌体的发酵上清1 mL，加入7 mL超纯水、3.0 g NaCl及10 μL 200 μg/L的3, 4-二甲基苯酚内标液后置于20 mL顶空瓶中，密封。对于酒醅样品的处理：称取5.0 g酒醅于50 mL离心管中，加入10%乙醇溶液5 mL，涡旋混匀并浸泡30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液8 mL置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL 3, 4-二甲基苯酚内标液。采用SPEM-GC-MS检测方法^[27]分析4-甲基苯酚的含量。SPEM萃取条件：DVB/CAR/PBDS萃取头萃取45 min，萃取温度为45 ℃。GC条件：进样口温度250 ℃，载气He，流速2 mL/min，不分流进样，色谱柱为CP-Wax (60 m×0.25 m×0.25 μm)。检测时的升温程序为：50 ℃恒温2 min，以6 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持15 min。MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35.00−350 aMU。质谱分析用数据库来源于NIST05a.L (Agilent)。

1.3.8 白酒酿造体系中乳酸与乙醇的检测

称取2.0 g酒醅，加入6.0 g超纯水，漩涡振荡5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清700 μL，加入700 μL 10%三氯乙酸，常温下沉淀30 min，过0.22 μm有机滤膜后，用HPLC检测乙醇及乳酸含量^[28]。HPLC条件为：BioRad Aminex-HPX-87H色谱柱，5 mmol/L硫酸为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温60 ℃，示差检测器检测，分析时间为30 min，进样量为10 μL。

2 结果与分析 2.1 谷氨酸棒杆菌降解4-甲基苯酚能力测试

谷氨酸棒杆菌能以芳香化合物为唯一碳源生长，包括4-甲基苯酚，但谷氨酸棒杆菌降解低浓度4-甲基苯酚的能力尚不清楚。基于白酒酿造体系中4-甲基苯酚含量低的特点，首先探究谷氨酸棒杆菌ATCC 13032对低浓度4-甲基苯酚的降解能力。在不添加谷氨酸棒杆菌的对照组中，4-甲基苯酚的含量为初始添加值，4-甲基苯酚未发生降解；而加入谷氨酸棒杆菌的实验组中几乎无4-甲基苯酚残留(图 1)，说明谷氨酸棒杆菌对于低浓度的4-甲基苯酚有较好的降解作用。但谷氨酸棒杆菌无法在酸性厌氧发酵环境中生存，不适用于在白酒酿造体系中降解4-甲基苯酚。因此，为了获得具有降解4-甲基苯酚的菌株，需要选择合适的宿主。

2.2 4-甲基苯酚消减宿主菌株的选择

2.2.1 短乳杆菌D17菌株的耐酸能力

研究表明，在白酒酿造过程中，乳酸菌逐渐占据主导地位，说明乳酸菌可较好地存活于酸性的白酒酿造体系中。前期实验室筛选获得一株来自酿造体系的短乳杆菌D17，其具有谷氨酸脱羧酶系统^[26]，该系统是乳酸菌有效的耐受系统之一。为了确定来自酿造体系的短乳杆菌D17是否能重新定殖于酿造体系中，首先对其耐酸能力进行了测定。如图 2所示，通过添加10 mmol/L的谷氨酸钠，在pH 2.5的缓冲刺激下，菌株的耐酸性显著高于不存在谷氨酸钠时，说明菌株只要在谷氨酸钠存在时即具有良好的耐酸性。考虑到白酒酿造体系中富含谷氨酸(500−2 500 mg/kg)^[29-30]，因此推测短乳杆菌D17可通过谷氨酸脱羧系统的抗酸能力重新在酸性基质的白酒酿造体系中存活。

2.2.2 短乳杆菌D17菌株在模拟白酒酿造体系中的生长情况

如图 3A所示，与对照组相比，添加短乳杆菌D17的实验组发酵30 d后酒精含量稍有降低，但与对照组差异不显著，酒精浓度均达到80.0 g/L左右，说明在密封罐中模拟白酒酿造是正常的。同时，如图 3B所示，相比对照组，添加短乳杆菌D17的乳酸含量较高，说明短乳杆菌D17可在白酒酿造体系中正常生长并代谢产生乳酸。通过荧光定量PCR分析，以短乳杆菌的特异性基因氨基甲酰磷酸合成酶编码基因cps片段的相对丰度表征短乳杆菌的生长情况。如图 3C所示，在对照组中，初始0 d及发酵30 d的酒醅中，短乳杆菌特有的cps片段丰度均较低，说明对照组中短乳杆菌的含量较低。与对照组0 d相比，添加短乳杆菌D17后，实验组中0 d即有一定含量的cps片段，说明用cps片段的丰度表征酿造体系中短乳杆菌的生长是可行的。添加短乳杆菌D17发酵30 d后，cps片段的丰度显著增加，说明来自白酒酿造体系的短乳杆菌D17可重新在白酒酿造体系中生长。因此，用短乳杆菌D17作为出发菌株构建的4-甲基苯酚消减菌株也可定殖于白酒酿造体系。

2.3 4-甲基苯酚消减菌的构建

谷氨酸棒杆菌的4-甲基苯酚降解途径区别于其他菌，主要是其含有的4-甲基苯基磷酸酯合成酶能将4-甲基苯酚的酚羟基进行磷酸酯化^[24]。而4-甲基苯酚在白酒中能检出，主要是由于4-甲基苯酚的沸点(202 ℃)高于乙醇(78 ℃)和水(100 ℃)，但由于固体蒸馏的夹带作用较强，4-甲基苯酚能随酒精及其他风味成分一起被蒸馏出来。若将4-甲基苯酚转变为4-甲基苯基磷酸酯，沸点将增加至347 ℃以上(参照磷酸单苯酯CAS号为701-64-4的沸点，347 ℃)，照此推测被蒸馏出的4-甲基苯酚将减少。4-甲基苯酚的磷酸酯化主要是由CreI和CreH协同发挥作用，CreI为磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸结合的丙酮酸磷酸激酶(pyruvate binding pyruvate phosphate dikinase)，CreH为磷酸烯醇式丙酮酸利用酶(utilizing enzyme)^{[22, 24]}。本研究采用creI与creH串联表达方式在短乳杆菌中表达。

以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板分别扩增creI (图 4A)与creH (图 4B)，与RBS串联后连接至表达载体pMG36e，获得过表达载体pMG36e-creIH (图 4C)。过表达载体经测序验证正确后，电转至短乳杆菌D17中得到Lactobacillus brevis D17 (pMG36e-creIH)过表达菌株(图 4D)。同时将空质粒pMG36e电转入短乳杆菌D17中，得到空白对照菌Lactobacillus brevis D17 (pMG36e)。

2.4 CreIH异源表达乳杆菌菌株对4-甲基苯酚的消减能力

2.4.1 过表达菌株的过表达质粒稳定性

构建的creIH短乳杆菌过表达菌株需要应用于白酒酿造体系中消减4-甲基苯酚，但红霉素的添加会引起白酒酿造体系中发酵菌群紊乱，且存在食品安全隐患，因此在白酒酿造体系中不适合添加红霉素发酵。在测试creIH过表达菌株对4-甲基苯酚的消减效果前，对该过表达菌株的过表达质粒稳定性进行了测试。由图 5可以看出，随着发酵时间的延长，creIH过表达菌株中的质粒维持率逐步降低，但发酵72 h质粒维持率仍可达80%。可见所用的pMG36e质粒在短乳杆菌D17菌株中较稳定。

2.4.2 过表达菌株消减4-甲基苯酚

creIH过表达菌株与空白对照菌在不添加红霉素且接种量相同的条件下，37 ℃静置培养48 h，4-甲基苯酚消减结果如图 6所示。结果表明，空白对照菌几乎不消减4-甲基苯酚，而creIH过表达菌株可消减4-甲基苯酚，4-甲基苯酚消减量为2 130 μg/L。说明creIH已在短乳杆菌中成功表达，推测creIH过表达菌株中合成的4-甲基苯基磷酸酯合成酶发挥了将4-甲基苯酚转换为4-甲基苯基磷酸酯的作用。

2.4.3 过表达菌株在白酒酿造体系中对4-甲基苯酚的消减能力

为探究creIH过表达菌株对白酒酿造体系中4-甲基苯酚的消减效果，选取含有4-甲基苯酚的出池酒醅模拟发酵验证。将creIH过表达菌株与空白对照菌制成菌悬液，按相同接种量接入出池酒醅中，不添加红霉素，静置培养48 h。4-甲基苯酚消减结果如表 3所示，结果表明：空白对照菌株对4-甲基苯酚几乎无消减能力，而creIH过表达菌可消减530 μg/kg左右的4-甲基苯酚，消减率达37.9%。

3 讨论与结论

4-甲基苯酚作为异嗅味物质常影响发酵食品的风味和品质^[31]。目前发现多种4-甲基苯酚降解菌具有较好的4-甲基苯酚降解能力，如谷氨酸棒杆菌对低浓度(百万分之一) 4-甲基苯酚的降解率可达99%以上，但此类菌株需在中性或弱碱性环境中才能生长，无法应用于酸性的发酵食品体系^{[16, 19]}。本研究中，我们在短乳杆菌中表达谷氨酸棒杆菌4-甲基苯酚降解途径中的关键酶4-甲基苯基磷酸酯合成酶，通过将4-甲基苯酚磷酸酯化，提高产物沸点，以实现4-甲基苯酚在白酒酒体中的消减。我们选用的短乳杆菌D17菌株筛选自白酒酿造体系，且具有较好的耐酸性能，适合作为4-甲基苯酚降解酶系表达的宿主菌。

本研究表明，4-甲基苯基磷酸酯合成酶过表达菌株在模拟白酒酿造体系中能有效消减4-甲基苯酚，该研究为消减白酒发酵过程中以4-甲基苯酚为代表的酚类异嗅物质提供了新的思路。完整的谷氨酸棒杆菌4-甲基苯酚降解酶系由5个酶复合体组成，本研究仅对4-甲基苯基磷酸酯合成酶编码基因进行了过表达。当然，随着短乳杆菌遗传操作工具的完善，未来有望将谷氨酸棒杆菌完整的4-甲基苯酚降解基因簇导入乳杆菌中，并按照食品级乳酸菌菌株的构建规范进行表达，以实现乳酸菌对4-甲基苯酚的完全降解。