微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (2): 665−672

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余昌霞, 陈明杰, 李正鹏, 赵妍, 汪虹, 杨焕玲, 奚莉萍
YU Chang-Xia, CHEN Ming-Jie, LI Zheng-Peng, ZHAO Yan, WANG Hong, YANG Huan-Ling, XI Li-Ping
草菇9715液体菌种培养过程的生理变化及培养终点
Physiological changes of Volvariella volvacea 9715 during submerged spawn culture
微生物学通报, 2020, 47(2): 665-672
Microbiology China, 2020, 47(2): 665-672
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190261

文章历史

收稿日期: 2019-03-30
接受日期: 2019-05-30
网络首发日期: 2019-05-30
草菇9715液体菌种培养过程的生理变化及培养终点
余昌霞 , 陈明杰 , 李正鹏 , 赵妍 , 汪虹 , 杨焕玲 , 奚莉萍     
上海市农业科学院食用菌研究所 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌工程技术研究中心 国家食用菌加工技术研发中心 上海市农业遗传育种重点开放实验室 上海 201403
摘要: 【背景】 草菇是最具中国特色的食用菌品种之一,其消费量逐年增加,产业发展潜力巨大。液体菌种应用于草菇栽培是其工厂化生产的发展趋势,目前关于草菇液体菌种的研究主要集中在优化配方和生长条件,有关草菇液体菌种培养过程中菌丝活性的研究较少。【目的】 研究草菇液体菌种培养过程中的生理活性变化,并确定其培养终点。【方法】 对草菇液体菌种培养过程中菌丝体干重、蛋白含量、培养液pH值、糖度、还原糖含量、酶活性等进行测定与分析。【结果】 草菇液体菌种在培养84 h后,菌丝干重增长减缓,pH值、糖度、还原糖含量逐渐减少,纤维素酶和半纤维素酶活性逐渐降低,培养96 h后,菌丝体蛋白质含量呈下降趋势,培养液蛋白含量则呈上升趋势。【结论】 草菇9715液体菌种培养终点应控制在84−96 h,研究结果可为9715液体菌种应用于草菇工厂化生产提供重要参考。
关键词: 草菇    液体菌种    生理变化    培养终点    
Physiological changes of Volvariella volvacea 9715 during submerged spawn culture
YU Chang-Xia , CHEN Ming-Jie , LI Zheng-Peng , ZHAO Yan , WANG Hong , YANG Huan-Ling , XI Li-Ping     
Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Edible Fungal Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture; National Engineering Research Center of Edible Fungi, National R & D Center for Edible Fungal Processing, Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding, Shanghai 201403, China
Abstract: [Background] Straw mushroom (Volvariella volvacea) is one of the most varieties of edible fungi with Chinese characteristics, and its consumption increased year by year, the potential industrial development for V. volvacea is tremendous. Liquid spawn used in straw mushroom cultivation is the development trend of factory production, the current research in liquid spawn of straw mushroom are mainly focus on the optimized formula and growth condition, however, less research was done on the mycelial activity during the cultivation process. [Objective] Study the physiological changes of straw mushroom in liquid spawn cultivation, and analyze the cultivation end-point. [Methods] Since cultivation 48 h, collection samples every 12 h, the biomass and protein content of mycelia were measured in 168 h. Moreover, pH value, sugar degree, reducing sugar contents, cellulase, hemicellulase and laccase activities of liquid spawn filtrate were determinated and analyzed in the cultivation process. [Results] The results showed that after 84 h of cultivation, the growth rate of mycelia diminishing and the biomass increased slowly, the pH value, sugar degree and reducing sugar contents reduced gradually, cellulase and hemicellulase activities also declined gradually. After 96 h, the protein content of mycelia declined while protein content of filtrate rised obviously. [Conclusion] The research on physiological changes of 9715 liquid spawn indicated that 84−96 h was the cultivation end-point, and the results can provide important reference value for liquid spawn application in the straw mushroom 9715 factory production.
Keywords: Volvariella volvacea    Liquid spawn    Physiological changes    Cultivation end-point    

草菇(Volvariella volvacea (Bull.) Singer),又名兰花菇、稻草菇、中国菇等,是最具中国特色的食用菌品种之一,富含多种人体必需氨基酸、维生素和矿物质,也是一种高蛋白、低脂肪的健康食用菌,素有“放一片,香一锅”之美誉,并有免疫调节、抗肿瘤、降低胆固醇等药用功效[1]。草菇栽培起源于我国南方,距今已有300多年的历史,其因味道鲜美而深受消费者欢迎,市场知名度高,消费量逐年增加,售价也一直居高不下,其产业发展潜力巨大[2-3]。草菇目前虽实现了周年化栽培,但其特殊的生物学特性、菌种不稳定等原因导致发展十分缓慢[4],其栽培模式还停留在以人工为主的劳动密集型产业,一直采用的固体制种方式也存在制种复杂、繁琐、周期长、操作不便、菌龄不一致等缺点[5-7],将液体菌种应用于草菇栽培是草菇工厂化生产的发展方向。

有关草菇液体菌种的研究,已见报道的主要集中在针对特定品种优化草菇液体菌种培养基配方[8-9]、筛选草菇液体菌种的最适生长条件[10-12],最终达到液体菌种生长明显优于固体菌种的目的,有关草菇液体菌种培养过程中菌丝活性生理指标变化的研究较少。菌种质量会直接影响到后续菌丝的生长及出菇情况[13-14],在一些关于液体菌种发酵终点的报道中,常将菌丝体重量作为唯一的衡量指标[15-16],然而菌丝生物量与菌丝活力之间并没有必然联系。张一帆等对草菇V23液体菌种培养终点进行研究,结果表明草菇V23液体菌种摇瓶的最佳培养终点时间为6 d[17],对于短菌龄的草菇而言,尚缺乏有效判断培养过程中菌丝活力的生理变化。本实验在此基础上,以草菇主栽品种9715菌株为研究对象,对培养48−168 h的草菇液体菌种进行试验,通过检测草菇液体菌种培养过程中菌丝体的各项理化指标变化,为工厂化草菇液体菌种生产过程的控制提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

草菇菌株9715由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供,因其菌丝生长旺盛、生物学效率高,为生产上的主要栽培品种。

1.2 培养基

固体培养基为PDA培养基,购自BD公司,称取39 g加蒸馏水定容至1 L。

液体培养基(g/L):葡萄糖25.0,酵母浸粉4.0,KH2PO4 1.0,MgSO4 1.0,加蒸馏水定容至1 L,pH调至9.0,用于摇瓶培养菌丝。

所有培养基均在1×105 Pa下灭菌20 min。

1.3 主要试剂和仪器

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;酵母浸粉,Oxoid公司;羧甲基纤维素酶试剂盒、半纤维素酶试剂盒、漆酶试剂盒,上海索桥生物科技有限公司。冷冻干燥机,Thermo公司;酶标仪,Bio-Rad公司。

1.4 草菇液体菌种生理指标的测定

1.4.1 草菇液体菌种的制备

将保存的菌种转接至PDA平板活化,32 ℃恒温培养3 d可得母种。然后将活化的母种用直径为9 mm的打孔器沿菌落边缘打孔,取50个菌块置于100 mL液体培养基中经均质仪打碎30 s,取培养基装液量120 mL的250 mL三角瓶,每瓶接入2.4 mL菌液,于32 ℃、150 r/min摇床振荡培养7 d,接种48 h后,每12 h收取5瓶为一组进行各项指标检测。

1.4.2 菌丝体质量的测定

接种后的液体菌种在恒温摇床中培养48 h时,三角瓶中有明显的菌丝可供收集,收集菌丝及培养液。用无纺布过滤培养的菌丝,无菌水冲洗后,于−80 ℃冰箱冷冻过夜,转入最低温保持在−50 ℃的冷冻干燥机中充分干燥至恒重,用分析天平称量菌丝体干重。

1.4.3 pH值测定

采用pH计测定滤出培养液的pH值。

1.4.4 OD540值、糖度测定

将滤出的培养液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min,取上清用酶标仪在波长540 nm处测定OD540值,同时采用糖度仪测定糖度。

1.4.5 还原糖的测定

培养液经4 ℃、4 000 r/min离心10 min后,采用3, 5-二硝基水杨酸(3, 5-dinitrosalicylic acid, DNS)法[18-19]测定培养液的还原糖含量。

1.4.6 菌丝体及培养液蛋白质含量测定

取冻干后的菌丝体0.1 g,加提取液经冷冻研磨仪研磨至匀浆,定容至10 mL,4 ℃、4 000 r/min离心10 min后取上清液,采用考马斯亮蓝法测定菌丝体蛋白质含量[20-21]。取滤出培养液同上离心后取上清,采用考马斯亮蓝法测定培养液蛋白质含量。

1.4.7 漆酶活性测定

取10 mL培养液同上离心后取上清液,按照漆酶试剂盒说明书测定培养液中的漆酶活性[22-23]

1.4.8 羧甲基纤维素酶活性测定

取10 mL培养液同上离心后取上清液,按照羧甲基纤维素酶试剂盒说明书测定培养液中的纤维素酶活性[22, 24]

1.4.9 半纤维素酶活性测定

取10 mL培养液同上离心后取上清液,按照半纤维素酶试剂盒说明书测定培养液中的半纤维素酶活性[22]

2 结果与分析 2.1 草菇液体菌种菌丝体干重的变化

草菇液体菌种在培养过程中菌丝体干重的变化结果(图 1)表明,菌丝体干重随培养时间的延长呈显著(P < 0.05)上升趋势,在培养48−60 h期间的菌丝干重无显著(P > 0.05)变化,60−84 h时菌丝干重迅速增多,84 h后菌丝生长速率变慢,菌丝干重增长减缓,156 h时菌丝体干重达到最大值,为0.471 8 g/100 mL,168 h时菌丝体干重有所下降。

图 1 草菇液体菌种培养过程中菌丝体干重 Figure 1 Mycelial dry biomass of Volvariella volvacea in liquid spawn cultivation
2.2 草菇液体菌种培养液OD540值的变化

草菇液体菌种在培养过程中培养液的OD540

值变化结果(图 2)表明,OD540值随培养时间的延长呈先上升后下降再升高的趋势,在培养72−108 h期间稳定在0.16左右,108 h后波动较大,OD540值在培养后期仍有上升,与草菇菌丝老化产生的色素有关,表明可在此之前结束草菇液体菌种的培养。

图 2 草菇液体菌种培养过程中培养液OD540值的变化 Figure 2 OD540 value of Volvariella volvacea in liquid spawn cultivation
2.3 草菇液体菌种培养液pH值的变化

草菇液体菌种培养液的pH值随培养时间的延长呈下降趋势(图 3),培养前期pH值保持稳定趋势,培养108 h后pH值有较明显的下降,且120 h时pH值小于7.0,说明菌丝体生长过程中产生的酸性代谢物在培养液中积累逐渐增多,导致了培养液pH值的降低。草菇适宜在偏碱性的环境下生长,在液体环境变得不适合草菇菌丝生长或存活之前结束培养,有利于液体菌种的应用及保存。

图 3 草菇液体菌种培养过程中培养液pH值的变化 Figure 3 pH value of Volvariella volvacea in liquid spawn cultivation
2.4 草菇液体菌种培养液糖度的变化

培养液的糖度反应了菌丝体对碳源的消耗和利用情况,如图 4所示,培养液的糖度随培养时间的延长呈下降趋势,从培养72 h起,有明显(P < 0.05)的下降趋势,168 h时有所回升,这与菌丝体干重在培养过程中变化的时间点基本一致,而变化趋势相反。

图 4 草菇液体菌种培养过程中糖度的变化 Figure 4 Sugar degree of filtrate in cultivation liquid spawn of Volvariella volvacea
2.5 草菇液体菌种培养液还原糖含量的变化

草菇液体菌种在整个培养过程中,培养液的还原糖含量随培养时间的延长呈先上升再下降的趋势(图 5),在培养48−84 h期间,还原糖的含量呈显著(P < 0.05)上升趋势,84−96 h期间有所下降,96−108 h时又有所上升,并在108 h时达最大值83.19 mg/mL,之后呈下降趋势并保持稳定。培养初期,菌丝分解碳源的能力较强,还原糖的生成量大于利用量,因此还原糖含量呈上升趋势,而随着培养时间的延长,菌丝进一步生长,碳源物质也被逐渐消耗,导致还原糖含量下降。

图 5 草菇液体菌种培养过程中培养液还原糖含量的变化 Figure 5 Reducing sugar contents of filtrate in cultivation liquid spawn of Volvariella volvacea
2.6 草菇液体菌种菌丝体及培养液蛋白含量的变化

草菇液体菌种在培养过程中,菌丝体蛋白质含

量总体呈先上升,之后趋于平稳,然后再下降的趋势(图 6)。在培养48−72 h期间,菌丝体蛋白质含量呈现上升趋势,说明在此阶段菌丝体蛋白质在合成;72−96 h期间,菌丝体蛋白质含量的总体变化较小,84 h时有所下降,但在96 h又有所回升,并达到最大值19.22 mg/g;96−168 h期间,草菇液体菌种菌丝体蛋白质含量总体呈下降趋势。

图 6 草菇液体菌种菌丝体和菌液的蛋白含量变化 Figure 6 Protein content of Volvariella volvacea mycelial and filtrate in liquid spawn cultivation

培养液中蛋白含量随培养时间的延长则呈显著(P < 0.05)上升趋势,在培养48−72 h期间,其蛋白含量缓慢增长;72−168 h时,培养液的蛋白质含量迅速增长,并在156−168 h期间增长最快,168 h时达到最大值,结合菌丝体干重在156−168 h期间有下降趋势,可以推断草菇液体菌种培养后期菌丝球老化,菌丝体的结构性蛋白质发生分解,导致培养液中可溶性蛋白含量迅速增高。

2.7 草菇液体菌种培养液的酶活性变化

草菇液体菌种培养过程中,培养液的纤维素酶活性总体呈先上升再下降的趋势,在培养48−84 h期间呈上升趋势,并在84 h时活性最大,然后迅速下降;半纤维素酶活性变化趋势和纤维素酶活性一致,总体也呈先上升再下降的趋势,在培养48−84 h期间呈上升趋势,且在84 h时活性最大(图 7)。草菇液体菌种在培养前期,菌丝生长迅速,需要更多的养分,从而分泌出大量的酶,基质分解速度加快,纤维素酶和半纤维素酶活性随之升高;培养84 h后,菌丝生长速度减缓,纤维素酶和半纤维素酶活性也随之呈下降趋势,其生长逐渐进入衰退期,对养分的需求变小或培养液不能再提供充足的养分,菌丝活力随之下降。草菇培养液中的漆酶活性在整个培养过程中总体呈下降趋势,在培养72−84 h期间下降幅度较大,之后下降幅度变小并基本保持稳定。

图 7 草菇液体菌种培养液酶活性变化 Figure 7 Enzyme activity of filtrate in liquid spawn cultivation of Volvariella volvacea
3 讨论与结论

液体菌种用于工厂化生产是食用菌产业发展的必然趋势,菌种质量是决定食用菌生产成败的关键。食用菌菌种随培养时间的延长,菌丝易老化甚至退化,菌种的活力与其生理生化活性密切相关[14]。食用菌菌丝在生长过程中不断分解利用培养基质中的养料,从而达到自身物质和能量积累使其生物量产生变化,菌丝生物量可用来表征微生物的生长状况,菌丝体干重也常被用来作为液体菌种培养终点的指标[15-16]。本试验草菇液体菌种菌丝体干重随培养时间的延长呈总体上升趋势,在培养60−84 h时菌丝干重迅速增多,84 h后菌丝生长速率变慢,菌丝干重增长减缓。培养前期,即60 h之前菌丝量较少,说明菌丝在接入液体培养基后要对新环境有所适应,待菌丝活力恢复、吸收养分后菌丝量得到积累,随培养时间的延长,培养液中的养分不足或菌丝代谢活性降低,导致菌丝量增长缓慢。pH值是食用菌生长及代谢的一个重要环境条件,pH值过高或过低都会影响菌丝正常生长。草菇是喜偏碱性环境的食用菌,其菌丝生长最适pH值为7.0−7.5,张丽蓉[14]对草菇菌种质量的研究结果表明,灭菌后pH值低于7.0与高于7.0的草菇菌种相比,出菇产量显著降低。本试验中草菇液体菌种在培养108 h后培养液的pH开始有较明显的下降趋势,120 h时pH小于7.0,说明到108 h时液体培养环境中酸性代谢物积累增多,开始不利于草菇菌丝进一步生长。糖类是液体培养基中的主要碳源物质,为菌丝生长代谢活动提供能量,因此测定液体菌种培养液糖度和还原糖含量可反映菌丝的生长情况。本试验液体菌种培养液的糖度下降与菌丝体干重上升的趋势截然相反,但发生变化的时间点高度吻合,说明菌丝不断利用培养液中的糖类物质以达到自身生长的目的,168 h时菌丝体干重变少、糖度回升,表明液体菌种到达衰亡期,菌丝细胞释放出的多糖类物质导致培养液的糖度升高。培养液还原糖含量变化整体呈先上升后下降趋势,60 h之前,还原糖含量上升明显,说明菌丝对新环境处于适应期,对碳源的利用较小,还原糖的生成量远远大于利用量;60−84 h期间,菌丝开始大量生长,对碳源的利用加大,还原糖的消耗量也变多,但菌丝活力较强,仍有大量还原糖生成,84 h后主要呈下降趋势并在132 h之后趋于稳定,说明培养液中的营养物质已被大量消耗。

蛋白质是生物体的重要组成部分,参与构成生物体的结构和重要的生理活动,蛋白质的含量变化可以反映液体菌种菌丝的活力。对草菇液体菌种培养过程中菌丝体蛋白质含量及培养液蛋白含量的测定显示,在培养前96 h内,两者均随培养时间的延长呈上升趋势,96 h后两者变化趋势相反,菌丝体蛋白质呈下降趋势并在132−156 h保持稳定,156−168 h骤减,培养液蛋白含量在96 h后仍呈上升趋势,132−156 h也保持稳定,156−168 h骤增,蛋白质是通过消耗培养基质中的氮源来合成的,说明前期菌丝体利用培养基质中的氮源合成蛋白质,并将可溶性蛋白释放到培养液中,二者的蛋白质含量均升高;培养后期草菇菌丝出现老化,菌丝体结构性蛋白质分解,菌丝干重减少,释放到培养液中的蛋白质含量增多,使得培养液中蛋白含量上升。草菇是一种草腐类真菌,具有较完备的纤维素酶系[25]和半纤维素酶系[26],同时具有一定的漆酶活性[27-28]。草菇胞外木质纤维素酶活性对其生物转化率具有重要影响,纤维素酶对纤维素的分解,以及半纤维素酶对半纤维素的分解利用可为草菇菌丝生长提供更多的养分,因此两种酶活性的高低可以反映菌丝活性的强弱[22, 29]。漆酶是降解木质素大分子物质的主要酚氧化酶,通过对木质素物质的分解为菌丝提供所需养分,胞外漆酶活性越高,菌株分解能力越强,菌丝生长速度越快。本试验培养液的纤维素酶活性及半纤维素酶活性均在84 h时最大,之后呈下降趋势,说明可在此时结束草菇液体菌种的培养。本研究的漆酶活性在整个培养过程中呈下降趋势,这与雷德柱等[27]的研究结果相似,其筛选产漆酶的草菇菌株,表明草菇产漆酶的时间主要集中在前5天,第5天之后漆酶活性逐渐降低;据已有的报道,草菇漆酶可能与子实体的形态构建有关[22],其与草菇液体菌种菌丝活力的关系还有待进一步研究。本试验的结果说明漆酶活性不能作为草菇液体菌种活力的指标。

本试验在张一帆等[17]的研究基础上,进一步研究了草菇液体菌种培养液的还原糖含量、蛋白含量及酶活性变化,由于草菇生长迅速、菌龄短,从有明显菌丝球产生的48 h起,每隔12 h进行取样,对草菇液体菌种进行系统研究,综合各检测指标结果,表明草菇9715液体菌种的培养时间应控制在84−96 h (即3−4 d),与张一帆等的研究结果草菇V23菌株的培养时间6 d不同。本研究显示,培养156 h时,草菇9715液体菌种已进入衰亡期,菌丝球老化,培养时间过长的草菇菌丝活性下降,不利于草菇的栽培生产。本研究结果初步阐明了草菇9715液体菌种培养过程中的生理变化,对草菇液体菌种在实际生产中的菌种质量控制具有指导意义,并为液体菌种应用于草菇工厂化生产提供重要参考。

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