微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (2): 659−664

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吕沁风, 廖静, 罗鹏, 郑伟, 刘建礼, 郭利川, 应清界
LÜ Qin-Feng, LIAO Jing, LUO Peng, ZHENG Wei, LIU Jian-Li, GUO Li-Chuan, YING Qing-Jie
西尼罗病毒的逆转录重组酶介导扩增检测方法
Development of a reverse transcription recombinase aided amplification assay for detection of West Nile virus
微生物学通报, 2020, 47(2): 659-664
Microbiology China, 2020, 47(2): 659-664
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190325

文章历史

收稿日期: 2019-04-15
接受日期: 2019-07-10
网络首发日期: 2019-08-26
西尼罗病毒的逆转录重组酶介导扩增检测方法
吕沁风1 , 廖静1 , 罗鹏1 , 郑伟1 , 刘建礼2 , 郭利川3 , 应清界3     
1. 浙江国际旅行卫生保健中心 浙江 杭州 310012;
2. 北京国际旅行卫生保健中心 北京 100088;
3. 江苏奇天基因生物科技有限公司 江苏 无锡 214135
摘要: 【背景】 随着西尼罗热在全球范围内广泛流行,西尼罗热传入我国的风险加大。研究西尼罗病毒的快速检测方法,为西尼罗病毒检测建立方法储备。【目的】 建立西尼罗病毒逆转录重组酶介导扩增(reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)检测方法。【方法】 根据西尼罗病毒基因保守区序列设计引物和探针,建立西尼罗病毒RT-RAA检测方法,并评价该方法的重复性、特异性和灵敏度。【结果】 RT-RAA方法的整个扩增反应过程温度恒定,反应温度为39 ℃,检测时间较短(20 min内),并且检测限可达10 copies,与基孔肯雅病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性,样本检测符合预期。【结论】 建立的西尼罗病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,可用于西尼罗病毒的口岸快速检测和流行病学监测。
关键词: 西尼罗病毒    重组酶介导扩增    检测    
Development of a reverse transcription recombinase aided amplification assay for detection of West Nile virus
LÜ Qin-Feng1 , LIAO Jing1 , LUO Peng1 , ZHENG Wei1 , LIU Jian-Li2 , GUO Li-Chuan3 , YING Qing-Jie3     
1. Zhejiang International Travel Healthcare Center, Hangzhou, Zhejiang 310012, China;
2. Beijing International Travel Healthcare Center, Beijing 100088, China;
3. Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co. Ltd., Wuxi, Jiangsu 214135, China
Abstract: [Background] West Nile fever is widely prevalent in the world, the risk of West Nile fever spreading to China has increased. The rapid detection method of West Nile virus (WNV) was studied to establish the method reserve for West Nile virus detection. [Objective] To establish a reverse transcription recombinase aided amplification (RT-RAA) assay for detection of WNV. [Methods] The primers and probes were designed based on the conserved genome sequence of WNV. An RT-RAA assay of WNV was constructed, and the reproducibility, specificity and sensitivity of the assay were evaluated. [Results] The RT-RAA assay had a constant temperature throughout the amplification reaction, the reaction temperature was 39 ℃. The detection time was less than 20 minutes and the detection sensitivity could reach 10 copies. The method had excellent specificity as it didn't have cross amplification with other arbovirus such as chikungunya virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus and Yellow fever virus. The results of sample detection also meet the expectation. [Conclusion] The RT-RAA assay of WNV established in our study was rapid, specific and sensitive. It can be used for rapid detection and epidemiological surveillance of WNV at the port.
Keywords: West Nile virus    Recombinase aided amplification    Detection    

西尼罗热(West Nile fever,WNF)是一种人畜共患传染病,因感染西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)而患病,1937年在乌干达北部尼罗河地区首先发现而命名[1]。西尼罗病毒属于黄病毒科黄热病毒属,与乙型脑炎、登革热、黄热病、圣路易脑炎、丙型肝炎等病毒同属。近年来西尼罗热在北美、欧洲、中东和东南亚等地引起流行,并成为目前影响美国最大的传染病。西尼罗病毒的传播是以鸟类为储存宿主,人类经库蚊等嗜鸟蚊叮咬传播感染。人、马和其他哺乳动物在被西尼罗病毒感染的蚊虫叮咬后发病,轻者出现发热、头痛等流感样症状,重者可表现为中枢神经系统症状,甚至死亡[2-4]

近年来,由于国际间交流与合作的深入,各国间来往频繁,旅行者数量逐年递增,同时因候鸟迁徙等因素,增加了西尼罗热传入我国的概率[5]。因此,建立该病毒的快速检测方法,并将其应用于口岸西尼罗病毒的监测工作,对防治该病传入我国具有重要的现实意义。重组酶介导扩增(recombinase aided amplification,RAA)技术,利用来自大肠杆菌的重组酶在常温下可以与DNA紧密结合并与引物形成聚合体,在单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用下代替传统PCR的热循环解链过程,实现在恒温条件下的核酸快速扩增[6]。本研究基于RAA技术建立了西尼罗病毒的快速逆转录重组酶介导扩增(reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)荧光检测方法。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样本

西尼罗病毒来自美国病理学家协会(College of American Pathologists,CAP)室间质评灭活阳性样本;黄热病毒为黄热减毒活疫苗,购自北京天坛生物制品股份有限公司;乙型脑炎病毒为乙型脑炎减毒活疫苗,来自成都生物制品研究所有限责任公司;2型登革病毒阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、健康人血清以及入境发热人员血清由浙江国际旅行卫生保健中心提供,其中2型登革热病毒及基孔肯雅热病毒阳性血清由上海之江生物及达安基因检测试剂盒检测均为阳性。

1.1.2 主要试剂和仪器

引物、探针和质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;西尼罗热病毒荧光定量RT-PCR试剂盒,上海之江生物公司;病毒RNA提取试剂盒、荧光定量PCR仪,Life公司;全自动核酸提取仪,Thermo公司;恒温核酸扩增检测仪、RAA基础反应试剂盒,江苏奇天基因生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建

在genbank中找到38株来源不同的西尼罗病毒相应的全基因组序列,运用DNAStar软件进行同源性分析和blast序列分析,筛出西尼罗病毒高度保守序列,以高度保守序列作为检测目的基因,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA质粒,目的基因片段250 bp,基因序列如下:5′-CTCTAACTTCCAAGGGAAGGTGATGATGACGGTAAATGCTACTGACGTCACAGATGTCATCACGATTCCAACAGCTGCTGGAAAGAACCTATGCTTGTCAGAGCAATGGATGTGGGATACATGTGCGATGATACTATCACTTATGAATGCCCAGTGCTGTCGGCTGGTAATGATCCAGAAGACATCGACTGTTGGTGCACAAAGTCAGCAGTCTACGTCAGGTATGGAAGATGCACCAAGACACGCCAC-3′。

1.2.2 引物探针合成

经分析比对,根据共有高度保守区域进行引物和探针设计,RT-RAA的引物长度一般在30−35 bp。经过分析比对,引物和探针序列如表 1所示。

1.2.3 探针修饰

探针的修饰方法包括:荧光标记基团为FAM,荧光淬灭基团为BHQ1。荧光报告基团修饰在探针序列距5′端碱基数31 bp的位置上;荧光淬灭基团修饰在探针序列距3′端碱基数17 bp的位置上,荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基GA,其中碱基A用四氢呋喃残基替换。经过修饰的探针为:5′-CAGAGCAATGGAYGTGGGATACA TGTGYGA(BHQ1-dT)G(THF)(FAM-dT)ACTATCACTTATGAAT-3′。

1.2.4 病毒基因组核酸提取

取50 μL血清或疫苗样本,采用全自动核酸提取仪,按试剂盒说明书提取样本RNA,将提取的RNA进行分装,冻存于−80 ℃,作为扩增模板备用。

1.2.5 西尼罗病毒RT-RAA扩增体系和条件

优化RT-RAA扩增反应体系:RAA干粉管中依次加入1Buffer 25 μL,M-MLV逆转录酶(100 U/μL) 0.2−0.6 μL,正、反向引物工作浓度0.05− 0.1 mmol/L,探针工作浓度0.02−0.05 mmol/L,模板5 μL,最后加入醋酸镁(280 mmol/L) 2.5 μL,DEPC水补足至50 μl,混合均匀,300 r/min离心10 s。将上述反应管放入恒温核酸扩增检测仪中,39 ℃反应20 min。阴性对照为不含RNA模板的ddH2O,其余成分与阳性样本相同。

表 1 西尼罗病毒RT-RAA检测引物和探针核酸序列 Table 1 The primers and probe of WNV RT-RAA
引物/探针
Primer/Probe
序列
Sequences (5′→3′)
FP CACAGATGTCATCACGATTCCAACAGCTGC
TP CTTCTGGATCATTACCAGCCGACAGCACTG
Probe CAGAGCAATGGAYGTGGGATACATGTGYGATGATACTATCACTTATGAAT

1.2.6 特异性实验

采用与蚊媒传染相关或者临床症状相近的病毒样本,对黄病毒属的黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒及甲病毒属的基孔肯雅病毒同时进行检测,评价西尼罗病毒RT-RAA检测方法的特异性。

1.2.7 敏感性测定

重组质粒通过转入大肠杆菌培养并提取,得到质粒后测定浓度并进行拷贝数计算,按浓度梯度10倍比稀释制备成1.0×101−1.0×1010 copies/μL阳性标准品备用。利用优化好的RT-RAA扩增反应体系依次对上述定量样品进行测定,考察方法的检出限。同时将西尼罗病毒重组质粒用上海之江生物生产的西尼罗病毒荧光定量RT-PCR试剂盒在荧光定量PCR仪上按说明书进行检测,检测时间约为100 min,比较两种方法的敏感性。

1.2.8 重复性试验

4个配制好的RT-RAA反应试剂试管中分别加入5 μL阴性对照,其他3个反应管中分别加入5 μL西尼罗病毒质粒DNA。加好样后每个反应管进行充分混匀,每个反应管总体积为50 μL。将混匀的4个反应管放入恒温核酸扩增检测仪中,设定反应温度为39 ℃,反应时间20 min。

1.2.9 临床样本检测

采用CAP提供的西尼罗病毒室间质评样本,同时收集出入境体检健康人血清样本20例及14例入境口岸发热人员血清样本,采用本研究建立的西尼罗病毒RT-RAA检测方法进行测试,观察检测结果。

2 结果与分析 2.1 西尼罗病毒一步法RT-RAA扩增体系的建立

优化西尼罗病毒一步法RT-RAA扩增体系,选择最佳引物、探针及逆转录酶浓度。上、下游引物浓度为0.05−0.1 mmol/L,经试验0.08 mmol/L为最佳引物浓度。探针浓度为0.02−0.05 mmol/L,经试验0.04 mmol/L为最佳探针浓度。直接在每个RAA基础荧光通用反应试中加入逆转录酶0.2− 0.6 μL,加入0.4 μL反转录酶为最佳。建立扩增效率最优的西尼罗病毒RT-RAA检测方法。扩增在5−10 min内即开始起峰,在20 min内达到峰值。

2.2 特异性试验

检测结果如图 1所示,只有西尼罗病毒质粒DNA出现扩增曲线,为阳性结果,其他样本如乙脑病毒RNA、基孔肯雅病毒RNA、黄热病毒RNA、2型登革病毒RNA及阴性对照均没有扩增曲线,均为阴性。结果表明建立的西尼罗病毒RT-RAA检测方法具有良好的特异性。

图 1 西尼罗病毒RT-RAA特异性试验 Figure 1 The specificity of RT-RAA for WNV
2.3 敏感性检测

西尼罗病毒RT-RAA检测结果如图 2所示,结果显示最快5 min即可出现明显扩增,10 min左右所有标准工作品均有扩增,由此可见最低检出限可以达到1.0×101 copies。根据检测结果显示RT-PCR方法的最低检出限可以达到1.0×102 copies。两种方法经过比较,RT-RAA检测法的敏感性比RT-PCR法高10倍左右,说明RT-RAA检测法具有较高的敏感性。

图 2 西尼罗病毒RT-RAA敏感性试验 Figure 2 The sensitivity of RT-RAA for WNV
2.4 重复性试验

配制好3管相同浓度(1.0×105 copies/μL)的西尼罗病毒质粒DNA和1管阴性对照放入恒温核酸扩增检测仪中进行检测,检测结果如图 3所示。结果显示扩增反应起峰时间一致,曲线形态接近,具有良好的重复性。

图 3 西尼罗病毒RT-RAA重复性试验 Figure 3 The repeatability test of WNV RT-RAA
2.5 临床样本检测

CAP提供的西尼罗病毒灭活样本(20例出入境体检阴性血清样本和14例入境口岸发热人员血清样本)采用本研究建立的西尼罗病毒RT-RAA检测方法进行检测,检测结果见图 4。可见CAP提供的样本可用本方法扩增,检测结果为阳性;20例出入境体检血清样本均为阴性,符合实验预期;14例入境口岸发热人员血清样本检测结果也为阴性。

图 4 RT-RAA方法样本检测结果 Figure 4 The test results of samples by RT-RAA
3 讨论与结论

西尼罗热在1999年侵入美国,在数年间西尼罗病毒感染迅速在美国本土48州蔓延,西尼罗热病例报道在2003年达到高峰9 862例,至2017年底,西尼罗热总病例达到48 070例,其中死亡2 138例[7]。西尼罗病毒危害极大,不仅给流行地区造成了巨大的经济损失,而且严重威胁公共卫生安全,被世界卫生组织列为全球重大流行病之一。西尼罗病毒的传播媒介在我国分布广泛,同时由于鸟类在全球大规模迁徙扩大了病毒传播的范围,应时刻注意西尼罗病毒的传入。建立未输入我国病原体的高效快速的检测方法,具有重要的现实意义。

诊断西尼罗病毒的方法通常有病毒培养法、血清学诊断法和核酸检测等[8-9]。病毒培养法和血清学诊断法操作复杂还费时费力,或是敏感度和特异性不高,不能快速得出检测结果。以RT-PCR技术为代表的多重RT-PCR、套式RT-PCR以及实时定量RT-PCR以其高度的特异性及敏感性在西尼罗病毒检测方面趋于成熟[10-14],但是这些方法需要投入昂贵的仪器设备,并对实验室环境有较高的要求,且RT-PCR反应时间较长,而本研究中RT-RAA的反应时间明显较短。等温核酸扩增技术近年来一直是分子生物学领域的研究热点,其中的LAMP方法克服了PCR技术需要昂贵的设备仪器等缺点,具有操作简便、结果判断简单等优点,李淑华等、Nyan等、Kumar等建立了西尼罗病毒RT-LAMP检测方法,已应用于西尼罗病毒的检测[15-17]。将RAA和LAMP两种等温扩增技术相比,LAMP技术要求设计多对引物且对靶基因的要求较高,RAA则需一对严格配对的引物,对模板的要求不高;LAMP扩增温度在60−65 ℃,RAA的工作温度相对低很多;RAA的扩增效率明显较高,反应在30 min内完成,LAMP一般需要1 h左右;RAA的工作体系需要多个酶协同作用,因此对酶的比例和缓冲体系的要求较高。

本研究基于重组酶介导扩增技术设计特异引物和探针,优化反应体系,并建立基于RT-RAA荧光法快速检测西尼罗病毒的试剂盒。实现检测温度保持恒定39 ℃,20 min内即可完成西尼罗病毒的检测。本研究中西尼罗病毒RT-RAA检测法的敏感性比RT-PCR高10倍左右,RT-RAA的检测时间仅为RT-PCR的1/5左右。RT-RAA检测法具有快速、灵敏、操作简便的特点,不需要昂贵的大型设备,可适用于现场快速检测,尤其在口岸对西尼罗病毒的检测具有重要意义。经过试验研究评价该方法快速、准确、可靠,适合在口岸或基层进一步推广,具有广阔的应用前景。

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