环糊精(cyclodextrin，CD)是一类环状低聚糖，由多个D-吡喃葡萄糖单元通过α-1, 4糖苷键连接起来而组成。常见的环糊精包括α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，分别由6、7和8个葡萄糖单元组成。CD分子具有外部亲水性和内部疏水性，可以容纳疏水性分子或基团形成包合物，并且可以改变被包埋物的理化性质，如挥发性、溶解度及化学反应性能等。目前环糊精已经广泛应用于食品、药品、化妆品、纺织和生物技术等众多领域。

酶法合成是工业生产环糊精的主要方法，即以淀粉或相关基质作为底物，利用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)的环化反应合成环糊精。由于能够产生CGTase的天然菌株一般具有相对严格的调控机制，导致CGTase的产量低、成本高且产物特异性差^[1]。因此通常使用基因工程的方法构建CGTase基因重组载体，通过蛋白质的异源表达实现重组酶的高效表达。一般选用的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母。

1 CGTase的异源表达 1.1 CGTase在大肠杆菌中的表达

大肠杆菌是常用于生产重组蛋白的宿主之一，与其他原核表达系统相比，大肠杆菌因其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、操作简便、可大规模高密度发酵培养等优点被广泛应用于外源蛋白表达研究。

Hao等^[2]将原始菌株Y-112中的目的基因cgt在大肠杆菌BL21中表达，通过优化诱导条件获得可溶性且活性较高的重组蛋白。环化反应是CGTase催化的特征反应，是催化直线型淀粉低聚糖链生产环糊精的一种分子内的转糖基反应。环化活力的一个酶活单位(U)通常定义为在最适反应条件下每分钟生成1 µmol环糊精所需的酶量。比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示(U/mg)。Yang等^[3]构建重组质粒pET28b(+)- CGTase在大肠杆菌BL21中表达，通过优化培养基成分及诱导条件，α-CGTase的环化活力提高了2.1倍。在最佳发酵条件下尝试500 L发酵罐发酵，α-环化活力达到45.2 U/L。郭永华等^[4]通过易错PCR随机突变来源于嗜热脂肪芽孢杆菌CHB1的CGTase，得到突变体ep-9在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，突变株的总环化比活力比原始酶提高了34%，并且在pH稳定性方面较原始酶有所提高。Li等^[5]用大肠杆菌BL21表达来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase，并通过两段控温诱导(25 ℃诱导32 h，然后30 ℃诱导58 h)提高CGTase的表达效率，胞外α-CGTase活性比在25 ℃恒定温度下进行诱导时的活性高45%。该实验使用荧光探针N-苯-α萘胺(NPN)评估大肠杆菌外膜的渗透性，用比色探针邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)评估内膜的渗透性，证明诱导温度从25 ℃变为30 ℃导致两种膜的渗透性明显增加，促进了CGTase胞外分泌。从目前的研究情况来看，大肠杆菌是表达异源CGT酶最有效及最常用的宿主细胞。利用E. coli过量表达CGTase有利于其大规模生产，对降低环糊精的生产成本起到了巨大的推动作用。

1.2 CGTase在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达CGTase与大肠杆菌相比具有一定的优势。首先枯草芽孢杆菌是良好的分泌型宿主，可以实现重组蛋白的胞外分泌，不会形成不溶性的包涵体；其次枯草芽孢杆菌的细胞壁不含内毒素，是非致病性的土壤微生物，被美国授予GRAS (generally recognized as safe)等级，具有更高的安全性，因此更适用于CGTase在食品领域的生产和应用。

Paloheimo等^[6]构建了含有α-淀粉酶启动子和信号序列以及cgt基因的质粒pALK156，在枯草芽孢杆菌ALKO2189中进行表达，通过发酵罐发酵得到产酶量1.2 g/L，是原始菌株嗜碱性芽孢杆菌ATCC21783产酶量的33倍。Sin等^[7]以pUP110Ce为载体，将来源于Bacillus ohbensis的CGTase基因表达于B. subtilis中，测得水解活性为30 U/mL。唐上华等^[8]将来源于嗜碱性芽胞杆菌N-227的β-CGTase基因整合到枯草芽孢杆菌1A289的染色体上，通过反复地随机整合，得到一株遗传稳定的整合型基因工程菌株BS16-7-7，其产β-CGTase的环化活力达到13 000 U/mL。

虽然用枯草芽孢杆菌作为宿主菌表达CGTase的安全性更高，而且可以实现胞外表达，但与大肠杆菌表达系统比较，枯草芽孢杆菌表达系统还不是很成熟。在进一步发展和完善枯草芽孢杆菌表达系统过程中，势必要不断完善和扩大枯草芽孢杆菌载体系统和宿主系统^[9]。探索更加适合CGTase在枯草芽孢杆菌中高效表达的载体和信号肽，建立适用于枯草芽孢杆菌的分子伴侣与目标蛋白共表达体系是实现枯草芽孢杆菌工业化生产CGTase所努力的方向。

1.3 CGTase在酵母中的表达

相比于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这类传统的原核表达系统，毕赤酵母(Pichia pastoris)具有以下优势：(1)蛋白表达量高。P. pastoris甲醇代谢启动子AOX1是目前已知最有效的启动子之一，通过甲醇的充分诱导，AOX1的转录产物可以达到整个细胞转录产物的30%以上。(2)分泌效率高。外源蛋白在毕赤酵母中的分泌不易形成包涵体。(3)更好的后加工处理能力。P. pastoris的真核表达系统能够为外源蛋白的折叠修饰及后处理提供较合适的环境和条件。(4)稳定性好。外源基因能以同源重组的方式整合到毕赤酵母基因组中，不需要抗生素的筛选即能自行保持稳定^[10]。(5)易于目的蛋白的分离纯化。与其他表达系统相比，P. pastoris系统分泌出的自身蛋白非常少，这就有利于后期的蛋白分离纯化。

目前P. pastoris常用的表达系统主要包括两种：诱导型和组成型。Kabacaoğlu等^[11]将来源于Bacillus sp. SD5中的CGTase基因在Pichia pastoris X33中用甲醇诱导胞外表达，经过纯化后酶的环化活力为13.92 U/mL。陈龙军等^[12]利用酵母pGAP启动子成功实现了CGTase在P. pastoris X-33中的组成型表达，并通过优化发酵条件(pH 6.5，温度28 ℃，甘油添加量2.5%/24 h，发酵120 h)使酶环化活力达到0.36 U/mL，是优化前的1.7倍。

毕赤酵母目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，已有数千种蛋白通过毕赤酵母表达系统成功表达。近年来，毕赤酵母也已被美国FDA认定为GRAS，这有利于CGTase更好地应用于食品领域。

2 CGTase高效异源表达策略 2.1 表达载体及启动子

为提高异源蛋白的产量，在大肠杆菌中开发了大量的表达载体，载体上的启动子对于异源蛋白表达起着关键的作用。目前基于T7启动子的pET表达系统是大肠杆菌中最常用的载体系统，但利用T7启动子可能会因为蛋白表达率过高形成大量包涵体^[13]。因此Deng等^[14]研究了启动子T7、trp、lacUV5以及杂合启动子tacI、tacII对CGTase表达的影响，旨在找到一个更合适的启动子来表达CGTase，其中tacI表现出最高的转录活性，在对tacI启动子间隔序列进行优化后，细胞外CGTase歧化活性达到170.6 U/mL，是原始菌株歧化活性(25.2 U/mL)的7倍。

目前大肠杆菌异源表达目的蛋白选用的启动子多为可控制表达，通过IPTG诱导表达或温度控制。实验室多用IPTG进行诱导表达，多项研究表明降低IPTG诱导温度有利于CGTase的可溶性表达^[15-18]。虽然IPTG诱导是目前最常用的诱导方式，但是IPTG有毒且价格昂贵，因此存在着局限性，不利于工业化生产。相比IPTG，乳糖作为一种易被菌体代谢吸收的诱导剂，无毒、价格低廉、诱导条件温和、诱导表达的蛋白可溶性好，国内外已有多种工程菌菌株应用乳糖培养基发酵使目的蛋白得到高效表达。林晓栩等^[19]分别用乳糖与IPTG诱导表达来源于Geobacillus CHB1的重组高温CGTase，发现乳糖诱导的胞外酶活性较高，表明乳糖诱导更利于重组CGTase的可溶性表达。在诱导起始菌浓度OD₆₀₀为1.4的条件下，加入0.5%的乳糖25 ℃诱导，经过初步优化，CGTase总环化活力最高可达21.35 U/mL，胞外酶的环化活力达到19.87 U/mL。

在枯草芽孢杆菌表达系统中，表达质粒主链对基因表达效率有直接影响。李才明等^[20]构建分泌型表达载体cgt/pST，在枯草芽孢杆菌WB600中成功表达了β-CGTase，之后又通过摇瓶发酵条件优化及添加亮氨酸、天冬氨酸及Fe³⁺，将胞外环化酶活提高到36.9 U/mL。这是目前报道的β-CGTase在枯草芽孢杆菌中胞外表达的最高β-环化活力。启动子是实现枯草芽孢杆菌外源基因高效表达的关键。为了实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌的高水平分泌表达，研究人员在启动子筛选方面进行了多次尝试，许多研究表明双启动子可以显著提高异源基因的表达水平。Yang等^[21]利用启动子陷阱技术在地衣芽孢杆菌基因组DNA中筛选到一种包含一个杂合启动子和PluxS的双启动子，有望在枯草芽孢杆菌中高效表达异源蛋白。Zhang等^[22]通过优化启动子在B. subtilis CCTCC M2016536中高效表达β-CGTase，筛选出表达CGTase活力较高的6个启动子P_srf、P_xyl′、P_gsiB、P_HpaII、P_amyQ′、P_nprE，分别与表达酶活最高的启动子P_amyQ′构建了6种双启动子。结果表明双启动子P_HpaII-P_amyQ′产生最高的细胞外β-CGTase活性(30.5 U/mL)，并通过3 L发酵罐发酵使胞外β-CGTase活性达到571.2 U/mL。

醇氧化酶基因的启动子P_AOX1是毕赤酵母表达系统中最常用的启动子，尤其在P. pastoris的大规模、高密度发酵培养中应用广泛，已实现了多种外源蛋白的高效表达。P_AOX1属于诱导型启动子，需要甲醇做诱导剂来启动基因表达，而甲醇易燃、易挥发、有毒等特性限制了P_AOX1的广泛应用^[23]。Zhang等^[24]以pPIC9K为表达载体，将来源于Bacillus pseudalcaliphilus 8SB的CGTase基因导入Komagataella phaffii，通过密码子优化和发酵条件优化(温度28 ℃，接种量6%，甲醇添加量1.5%)得到酶的最大环化活力3 885.1 U/mL。这是到目前为止以酵母表达CGTase酶活报道的最大值。

2.2 信号肽

由于大肠杆菌一般将重组蛋白分泌在胞内，这样会使重组蛋白不能正确折叠或被降解而失去活性，并使目的蛋白的提取和纯化过程变得复杂。因此，通过利用高匹配度的信号肽引导重组蛋白胞外分泌是提高目的蛋白高效异源表达的有效策略。文献报道利用信号肽可以成功实现外源重组蛋白在大肠杆菌中的分泌表达^[25]。信号肽首先介导目的蛋白跨过内膜转运到周质空间，然后通过非特异性渗漏或培养基添加剂等方法促进周质中的蛋白释放到胞外培养基中，实现蛋白的胞外分泌。OmpA^[26]、PelB是目前大肠杆菌异源表达常用的信号肽，除此之外一些新型高效的信号肽不断被研究发现。

Sonnendecker等^[27]比较了大肠杆菌信号肽PelB、DacD和野生菌株G825-6自身的信号肽G825-6 CGTase SP对重组CGTase胞外分泌的影响，结果显示DacD与其他两种信号肽相比不仅能够最高效地促进CGTase胞外分泌，还能提高总酶活。Ismail等^[28]研究了信号肽定点突变对重组环糊精酶在大肠杆菌中分泌表达的影响，结果表明调整信号肽氨基酸组成可以促进重组CGTase分泌到周质及培养基，减少包涵体数量，并且可以减少细胞裂解，推测原因是因为突变信号肽N端带正电荷的氨基酸与细胞质膜阴离子磷脂的互相作用可以增加分泌效率。Jonet等^[29]突变Bacillus sp. G1自身天然信号肽获得信号肽M5引导来源于Bacillus sp. G1的CGTase在大肠杆菌表达。与大肠杆菌自身信号肽相比，胞外CGTase分泌量提高了1.9倍，且细胞裂解量少。随后该团队Ling等^[30]从Bacillus lehensis G1的细胞外蛋白中筛选出14种信号肽与CGTase融合，实验证明14种信号肽都能引导CGTase分泌到胞外培养基。其中GlcNAc-binding protein A (GAP)效果最好，与天然信号肽G1相比，细胞外和周质的CGTase环化活性分别提高了735%和205%，细胞裂解量只增加了约1.7倍。

与大肠杆菌实现胞外分泌需要穿过两层膜不同，枯草芽孢杆菌只需要穿过一层细胞膜即可实现蛋白的胞外分泌。因此，芽孢杆菌是生产外源蛋白的理想宿主，但是由于分泌途径中的瓶颈，导致产量不尽如人意，而信号肽的作用是能够保证分泌蛋白质的正确定位和转移。周勇等^[31]对枯草芽孢杆菌体系中Sec和Tat这两个主要分泌途径的信号肽进行了筛选，结果显示Tat途径中的phoD信号肽分泌效果明显优于其他信号肽。总体而言，目前枯草芽孢杆菌分泌表达CGTase研究报道中所选用的信号肽种类较少，也未见有系统性研究信号肽结构对CGTase胞外分泌效果影响的报道。

对于通常用于酵母的分泌表达载体，可用于选择的信号肽一般分为两类：酵母自身的信号肽和基因本身的信号肽。最常用和最有效的信号肽是α因子前导肽。尽管外源基因的信号肽本身可介导目的蛋白的分泌，但已显示自身信号肽可优于外源蛋白信号肽序列^[32]。张燕等^[33]分别利用带有α分泌信号肽的质粒pPICZaA-cgt、pPIC9k-cgt与带有自身信号肽的质粒pPICZA-sig-cgt在毕赤酵母胞外表达CGTase，结果显示利用CGTase自身信号肽能够将CGTase分泌至胞外，但利用酵母表达载体上的信号肽分泌表达效果更佳，胞外表达酶活高于不带信号肽的胞内表达，且实验操作更简便。

2.3 密码子优化

过去很长一段时间，人们一直认为同义密码子取代是无关紧要的。但是研究证明，即使一个同义密码子的替换也可能会影响基因的表达水平、蛋白质的折叠以及蛋白质结构及功能的改变^[34]。由于产生CGTase的天然菌株与表达宿主菌具有种属差异，CGTase在宿主菌表达一般在一定程度上受到相应tRNA匮乏的不利影响。密码子优化就是在保证不改变CGTase氨基酸序列的基础上将酶基因的密码子优化为表达宿主菌偏好型。经研究^{[17, 35-36]}证明，该方法能大幅度提高外源蛋白的表达量。

Liu等^[35]用优化后的培养条件同时表达经过密码子优化的coα-cgt和野生型wtα-cgt，通过3 L发酵罐发酵，培养27 h胞外CGTase酶活达到最大，与野生型酶基因wtα-cgt表达(环化活力14.6 U/mL)相比，密码子优化基因(环化活力47.55 U/mL)的分泌水平增加了226%，该实验证明了密码子优化是提高α-CGTase酶活经济有效的方法。Jiang等^[36]将来源于Paenibacillus macerans的CGTase基因进行密码子优化后导入质粒pET-28a(+)并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，与未优化的野生酶基因表达相比，明显缩短了发酵时间。王琰等^[17]对Bacillus clarkii 7364来源的γ-CGTase按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化，构建了工程菌株pET22b(+)-γ-CGTase/ E. coli BL21(DE3)，通过在28 ℃低温条件下诱导实现了γ-CGTase的高效可溶性表达，结果显示该酶催化产物中γ-环糊精的比例高达90.9%，与天然酶的79%相比提高了15%。

外源基因中(G+C)mol%含量过高或过低都会对其转录产生显著影响，进而影响其空间折叠、翻译以及胞内降解，最终影响蛋白的表达。研究表明适合在毕赤酵母表达的基因(G+C)mol%含量应在40%−50%的范围内^[10]。张燕等^[33]通过将CGTase基因中的中低偏爱性密码子替换为酵母高偏爱性密码子，并将序列(G+C)mol%含量从37%提升到39%。将来源于Bacillus pseudalcaliphilus 8SB菌株的γ-CGTase在毕赤酵母中高效表达，环化活力达到了83.65 U/mL，是野生菌活力的39.3倍，是大肠杆菌表达活力的8.7倍^[33]。通过密码子优化提高异源蛋白表达量的研究近年来有不少报道^[37-39]，这些研究结果都表明密码子优化能够有效提高异源蛋白的表达量。随着基因技术的飞速发展，密码子优化成为一种获取异源基因的表达最为简洁有效的方式。

2.4 分子伴侣共表达

在大肠杆菌中表达的CGTase因不能正确折叠形成天然构型，所以易聚集形成没有活性的包涵体，研究表明分子伴侣和折叠酶作为共表达的折叠辅助蛋白，可以在一定程度上增加异源蛋白的可溶性表达。截至目前，分子伴侣触发因子(trigger factor，TF)、肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)、伴侣蛋白GroEL/ES和热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)中的Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE)等已经被报道有助于不同重组蛋白的蛋白质折叠活性。

郭永华等^[40]构建了5种分子伴侣共表达系统pKJE7、pKJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16共表达重组质粒pET-28a(+)-ompA-cgt，结果表明目的蛋白的可溶性表达量均有不同程度的提高，其中能同时表达3种分子伴侣蛋白(DnaK-DnaJ-GrpE、GroEL-GroES和TF)的pKJE8共表达效果最为明显，且在25 ℃、0.50 g/L L-阿拉伯糖诱导条件下胞外酶环化活力达到最大11.2 U/mL。

3 结语

近年来，随着分子生物学研究的深入，基因改造和异源表达技术日趋成熟。与此同时，商业上对于环糊精的生产也提出了更高的要求，利用CGTase的转糖基功能转化抗环血酸(Vc)生成性质更加稳定的2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是目前环糊精酶应用的研究热点。通过研究高效高产的CGTase可以降低该应用的生产成本，得到纯度更高的AA-2G，因此CGTase生产技术的创新对于满足环糊精的生产需求至关重要。本文介绍的用于异源表达CGTase的不同种类工程菌以及有利于CGTase高效表达的各种策略表明，目前对于CGTase的表达研究已经取得了一些成果，但是表达体系和策略没有普遍适用性，重组CGTase的胞外生产强度普遍较低和产物特异性差等问题仍然限制着CGTase的工业生产应用，研究更加高效及具有良好产物特异性的重组CGTase仍然任重道远。