微生物学通报  2020, Vol. 47 Issue (2): 571−582

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陈章, 汪清峰, 刘晓露, 何长生, 魏建忠, 孙裴, 刘雪兰, 李郁
CHEN Zhang, WANG Qing-Feng, LIU Xiao-Lu, HE Chang-Sheng, WEI Jian-Zhong, SUN Pei, LIU Xue-Lan, LI Yu
副猪嗜血杆菌安徽株血清型、基因型及耐药性
Serotype, genotype and drug resistance of Haemophilus parasuis in Anhui province
微生物学通报, 2020, 47(2): 571-582
Microbiology China, 2020, 47(2): 571-582
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190362

文章历史

收稿日期: 2019-04-23
接受日期: 2019-08-15
网络首发日期: 2019-09-16
副猪嗜血杆菌安徽株血清型、基因型及耐药性
陈章1 Δ, 汪清峰1 Δ, 刘晓露1 , 何长生2 , 魏建忠1 , 孙裴1 , 刘雪兰1 , 李郁1     
1. 安徽农业大学动物科技学院    安徽  合肥    230036;
2. 安徽省动物疾病预防与控制中心    安徽  合肥    230061
摘要: 【背景】 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glässer’s disease)的病原体,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,目前对该病无法形成有效防控。【目的】 了解安徽地区副猪嗜血杆菌血清型、基因型及耐药性特征,为猪革拉瑟氏病的有效防控提供科学依据和技术支撑。【方法】 针对2008–2017年安徽地区分离的44株HPS,利用PCR反应鉴定血清型,应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行基因分型,通过微量稀释法测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。【结果】 44株HPS共检测出6种血清型(1、4、5、7、13、14),血清型4型和13型为优势血清型,各占40.91%;9种ST型(ST241、ST267、ST268、ST269、ST270、ST271、ST272、ST273和ST274)中ST267和ST268为优势基因型,各占40.91%;对庆大霉素、青霉素的敏感率分别为100%和93.2%,86.4%的分离株呈现多重耐药,耐药谱型有33种,其中以甲氧苄啶/磺胺甲噁唑-四环素构成比最大,为42.4%。【结论】 安徽地区HPS流行血清型和基因型呈现多元化,具有较高的遗传异质性,多重耐药现象严重,血清型、ST型与耐药性之间无明显相关性。
关键词: 副猪嗜血杆菌    血清型    基因型    耐药性    
Serotype, genotype and drug resistance of Haemophilus parasuis in Anhui province
CHEN Zhang1 Δ, WANG Qing-Feng1 Δ, LIU Xiao-Lu1 , HE Chang-Sheng2 , WEI Jian-Zhong1 , SUN Pei1 , LIU Xue-Lan1 , LI Yu1     
1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036, China;
2. Anhui Animal Disease Prevention and Control Center, Hefei, Anhui 230061, China
Abstract: [Background] HPS is the pathogen of Glässer's disease. Due to the drug resistance caused by long-term use of antibiotics and the lack of interactive immune protection of inactivated vaccines, it's impossible to effectively prevent and control Glässer's disease at present. [Objective] The purpose of this study was to understand the serotypes, genotypes and drug resistance characteristics of HPS in Anhui province, and to prevent and control Glässer's disease more effectively. [Methods] The serotypes of 44 strains of HPS, isolated in Anhui province from 2008 to 2017 were identified by polymerase chain reaction (PCR), the genotyping was carried out by MLST, and MIC was determined by microdilution method. [Results] A total of 6 serotypes (1, 4, 5, 7, 13 and 14) were detected in 44 strains of HPS, serotypes 4 and 13 were dominant serotypes, each accounting for 40.91%. A total of 9 ST types (ST241, ST267, ST268, ST269, ST270, ST271, ST272, ST273 and ST274) were detected in MLST classification, the dominant genotypes were ST267 and ST268, respectively accounting for 40.91%. Drug resistance analysis showed that the susceptibility rates of gentamycin (GEN) and penicillin (PEN) were 100% and 93.2%, respectively. There were 86.4% of the isolates showed multiple drug resistance, and there were 33 types of multi-drug resistance spectrum, among which the ratio of COT-TET was the largest (42.4%). [Conclusion] The epidemic serotypes and genotypes of HPS in Anhui province are diversified, with high genetic heterogeneity and severe multi-drug resistance. There was no significant correlation between serotype, ST type and drug resistance.
Keywords: Haemophilus parasuis    Serotype    Genotype    Drug resistance    

猪革拉瑟氏病(Glässer’s disease)是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的猪细菌性传染病,以关节炎和多发性纤维素性浆膜炎为主要特征,存在于许多养猪国家,流行趋势日益上升,危害愈发严重。目前预防和控制猪革拉瑟氏病的主要措施是使用抗生素和接种疫苗。由于HPS血清型众多且地方性特征明显,不同的血清型菌株之间交叉保护性较低,毒力与血清型的严格关系尚未得到证实[1]。相比于血清分型,基因分型的一个重要优势是可以对所有HPS分离株分型,对于区分致病的毒力菌株与寄居的无毒菌株以及促进疫苗的发展具有重要意义[2]。不同国家、地区和时间的HPS分离菌对抗生素的敏感性存在差异,因而影响着对药物的选择和使用[3]

本研究针对安徽地区2008–2017年临床分离鉴定的44株HPS,先利用PCR进行血清型鉴定分析,再应用MLST进行基因分型研究,最后通过微量稀释法测定抗生素对HPS的MIC。本实验旨在了解安徽地区HPS血清型的特征性分布,评价安徽地区HPS流行株的遗传背景和进化关系,并掌握安徽地区HPS分离株对抗生素的敏感性,为安徽地区有效防控猪革拉瑟氏病提供科学依据和技术支撑。

1 材料与方法 1.1 菌株

1.1.1 受试菌株

受试菌株源于2008-2017年临床发病猪,由安徽农业大学动物传染病实验室分离、鉴定与保存,共计44株HPS (表 1)。

表 1 44株HPS安徽分离株的背景信息 Table 1 Background information of 44 HPS Anhui isolates
序号Order 菌株编号Strains 分离时间Time 分离地点Location 分离部位Origin 疾病Disease
1 HB-1 20170106 淮北Huaibei 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
2 HB-3 20170323 淮北Huaibei 脾Spleen 多发性浆膜炎Polyserositis
3 FX-1 2008 肥西Feixi 肺Lung 肺炎Pneumonia
4 FY-1 2008 阜阳Fuyang 肺Lung 肺炎Pneumonia
5 HS-1 2008 黄山Huangshan 肺Lung 肺炎Pneumonia
6 LA 2008 六安Liuan 肺Lung 肺炎Pneumonia
7 SZ-1 2008 宿州Suzhou 肺Lung 肺炎Pneumonia
8 WH-1 20090816 芜湖Wuhu 脾Spleen 肺炎Pneumonia
9 AT-1 20101115 合肥Hefei 脾Spleen 多发性浆膜炎Polyserositis
10 BB-1 20110424 蚌埠Bengbu 肺Lung 肺炎Pneumonia
11 BB-2 20130312 蚌埠Bengbu 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
12 HF-2 20130313 合肥Hefei 肺Lung 肺炎Pneumonia
13 AT-2 20130706 合肥Hefei 脾Spleen 肺炎Pneumonia
14 LX 20131214 淮北Huaibei 脑Brain 多发性浆膜炎Polyserositis
15 HJ-1 20140109 合肥Hefei 肺Lung 肺炎Pneumonia
16 SX-1 20141020 寿县Shou county 肺Lung 肺炎Pneumonia
17 HJ-4 20141226 合肥Hefei 肺Lung 肺炎Pneumonia
18 FY-2 20150803 阜阳Fuyang 肺Lung 肺炎Pneumonia
19 FN 20160404 阜南Funan 肺Lung 肺炎Pneumonia
20 HF-3 20160618 合肥Hefei 肺Lung 肺炎Pneumonia
21 LA-1 20151128 六安霍邱Liuan Huoqiu 肺Lung 肺炎Pneumonia
22 FX-5 20161123 肥西Feixi 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
23 CH-1 20151009 巢湖Chaohu 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
24 HB-2 20170106 淮北Huaibei 鼻腔Nasal cavity 多发性浆膜炎Polyserositis
25 LA-2 20170628 六安Liuan 肺Lung 肺炎Pneumonia
26 SC 2008 舒城Shucheng 关节Joint 关节炎Arthritis
27 LJ-2 2008 庐江LuJiang 脑Brain 多发性浆膜炎Polyserositis
28 LJ-3 2008 庐江LuJiang 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
29 TL 2008 铜城Tongcheng 肺Lung 肺炎Pneumonia
30 FD-1 20090816 肥东Feidong 肺Lung 肺炎Pneumonia
31 FD-2 20101115 肥东Feidong 肺Lung 肺炎Pneumonia
32 FX-2 20101122 肥西Feixi 肺Lung 肺炎Pneumonia
33 DY 20110522 定远Dingyuan 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
34 AQ 20111027 安庆Anqing 肺Lung 多发性浆膜炎Polyserositis
35 HB 20131214 淮北Huaibei 肺Lung 肺炎Pneumonia
36 CF 20140307 长丰Changfeng 肺Lung 肺炎Pneumonia
37 CZ 20140808 滁州凤阳Chuzhou Fengyang 肺Lung 肺炎Pneumonia
38 SX-2 20141020 寿县Shou county 肺Lung 肺炎Pneumonia
39 FX-3 20141202 肥西Feixi 关节Joint 多发性浆膜炎Polyserositis
40 HJ-2 20141202 合肥Hefei 肺Lung 肺炎Pneumonia
41 HJ-3 20141226 合肥Hefei 关节Joint 关节炎Arthritis
42 HQ-2 20150408 六安霍邱Liuan Huoqiu 肺Lung 肺炎Pneumonia
43 CZ-1 20160113 池州Chizhou 脾Spleen 多发性浆膜炎Polyserositis
44 SZ-2 20160121 宿州泗县Suzhou Si county 肺Lung 肺炎Pneumonia

1.1.2 质控菌株

大肠埃希菌(Escherichia coliE. coli) ATCC 25922和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP) ATCC 27090均由安徽农业大学动物传染病实验室保存和提供。

1.2 主要试剂和仪器

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE),绍兴天恒生物科技有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),生工生物工程(上海)股份有限公司;新生小牛血清,北京索莱宝科技有限公司;细菌基因组提取试剂盒,TaKaRa公司;18种抗生素,杭州天和微生物试剂有限公司。

PCR扩增仪,Bio-Rad公司;恒温振荡培养箱,上海福玛实验设备有限公司;双目生物显微镜,南京江南光电股份有限公司;8孔微量多点加样器,V & P Scientific公司。

1.3 引物合成

参照汪清峰[4]的方法合成HPS血清分型用15种基因引物和HPS MLST分型用7种管家基因引物,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 血清分型

采取细菌基因组提取试剂盒提取HPS基因组DNA作为模板,用于PCR鉴定HPS的血清型。PCR反应体系(25 µL):2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL,上、下游引物(20 µmol/L)各0.25 µL,模板DNA 2 µL,ddH2O 10 µL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,35个循环;68 ℃ 5 min。将PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上进行观察,并记录结果。

1.5 MLST分型

参照Mullins等[5]建立的HPS MLST分型方法。PCR反应体系(50 μL):2×Taq PCR Master Mix 25 µL,上、下游引物(20 µmol/L)各2 µL,模板DNA 2.5 µL,ddH2O 18.5 µL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,45 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 10 min。扩增产物由上海桑尼生物科技有限公司测序。将所有测序菌株的7种基因位点序列上传至HPS MLST数据库(http://pubmlst.org/hparasuis),得到对应等位基因的编号,最终确定ST型,并在MLST数据库中完成新发现等位基因序列的提交。

1.6 MLST分析

利用eBURST3.0软件对HPS MLST分型结果展开ST型克隆群(clonal complex,CC)的归类,当单个克隆群中的ST型存在6种等位基因与某个ST型相同时,则可以将此ST型归于该克隆群。利用START V2.0软件构建UPGMA系统进化树作聚类分析。

1.7 耐药性测定

根据CLSI推荐的微量稀释法,挑取单个菌落接种于TSB-YE培养液,于37 ℃、180 r/min培养24 h,将细菌浓度调至0.5麦氏浊度并稀释1 000倍,同时将18种抗生素储存液以初浓度5 120 μg/mL、体积100 μL连续2倍比稀释14次,配制成梯度浓度的抗生素微量稀释盘,分别加入100 μL稀释菌悬液,37 ℃孵育24 h后,通过肉眼观察无细菌生长的最低抗生素浓度即为该菌株的MIC。由于依据MIC值选择抗生素浓度不能达到很好的抑菌效果,需借助MIC50和MIC90来对抗生素进行抗菌评价。依照CLSI所公布的细菌耐药临界点,完成各试验菌株对不同抗生素的耐药率计算。实验设置阳性对照(受试菌株菌液)、阴性对照(TSB-YE)以及两组平行对照,同时以E. coli (ATCC 25922)和APP (ATCC 27090)作为质控菌株。

1.8 数据分析

采用SPASS 22.0软件进行数据处理,P>0.05表示差异不显著,P < 0.05表示差异显著。

2 结果与分析 2.1 血清分型

44株HPS安徽株共检测出6种血清型,包括血清1、4、5、7、13和14型(图 1)。血清4型和13型各18株,占40.91% (18/44);血清5型3株,占6.82% (3/44);血清1型和7型各2株,占4.55% (2/44);血清14型1株,占2.27% (1/44) (表 2)。

图 1 HPS不同血清型的PCR鉴定 Figure 1 PCR identification of different serotypes of HPS 注:M:DL2000 DNA marker;-:阴性对照;1:血清1型funB;2:血清4型wciP;3:血清5型funK;4:血清7型funQ;5:血清13型gltP;6:血清14型funAB. Note: M: DL2000 DNA marker; –: Negative control; 1: Serotype 1 funB; 2: Serotype 4 wciP; 3: Serotype 5 funK; 4: Serotype 7 funQ; 5: Serotype 13 gltP; 6: Serotype 14 funAB.

表 2 44株HPS安徽株血清分型结果 Table 2 Serotype typing results of 44 HPS Anhui isolates
血清型Serotype 百分比Percentage (%)
1 4.55 (2/44)
4 40.91 (18/44)
5 6.82 (3/44)
7 4.55 (2/44)
13 40.91 (18/44)
14 2.27 (1/44)
2.2 MLST分型

44株HPS安徽株共检测出9种ST型,包括ST241、ST267、ST268、ST269、ST270、ST271、ST272、ST273和ST274 (图 2)。ST267和ST268各18株,占40.91% (18/44);ST269为2株,占4.55% (2/44);ST270、ST271、ST272、ST273、ST274和ST241各1株,占2.27% (1/44) (表 3)。

图 2 HPS 7种管家基因的PCR鉴定 Figure 2 PCR identification of 7 housekeeping genes of HPS 注:M:DL2000 DNA marker;其他条带为7种管家基因;-:阴性对照. Note: M: DL2000 DNA marker; The other strips are 7 housekeeping genes; -: Negative control.

表 3 44株HPS安徽株MLST分型结果 Table 3 MLST typing results of 44 HPS Anhui isolates
ST type atpD infB mdh rpoB 6pgd g3pd frdB Percentage (%)
241 2 22 4 6 7 3 2 2.27 (1/44)
267 2 2 4 6 27 19 6 40.91 (18/44)
268 26 39 34 1 60 1 2 40.91 (18/44)
269 7 11 17 3 21 3 49 4.55 (2/44)
270 7 4 6 5 27 3 23 2.27 (1/44)
271 7 1 6 3 27 19 38 2.27 (1/44)
272 5 11 4 1 3 1 2 2.27 (1/44)
273 24 23 43 1 3 1 50 2.27 (1/44)
274 5 11 4 3 21 1 2 2.27 (1/44)
2.3 MLST分析

运用eBURST3.0软件将9个ST型分成7个单一ST型和2个克隆群。其中ST254 (2008年上海分离株HK036)、ST94 (2005年比利时分离株05-11621)和ST241 (2014年肥西分离株FX-3)归类于同一克隆群;ST176 (2008年广东分离株H44)和ST268 (2009年肥东分离株FD-1)归类于同一克隆群;ST269、ST270、ST271、ST272、ST273、ST274和ST267为单个ST型(图 3)。构建的UPGMA系统发育树中,9种ST型分为4个分支,其中分支1包含ST269 (血清1型)、ST270 (血清7型)和ST271 (血清7型);分支2包含ST241 (血清14型)和ST267 (血清4型);分支3包含ST268 (血清13型)、ST272 (血清5型)和ST274 (血清5型);分支4包含ST273 (血清5型)。而分支1中既有无毒力菌株也有强毒力菌株,分支2、3和4中的菌株则全部趋向于强毒力(图 4)。

图 3 274株HPS的eBURST分群图谱 Figure 3 The 274 HPS in eBURST cluster map 注:黑色字体为HPS的MLST数据库中ST型,红色字体为本研究中HPS的ST型. Note: Black font is ST type in MLST database, red font is ST type of this study.

图 4 基于44株HPS安徽株ST型构建的UPGMA系统发育树 Figure 4 UPGMA dendrogram was contructed based on the STs of 44 HPS Anhui isolates 注:标尺表示序列差异的分支长度;分支点上的数字为菌株编号和ST型号;括号内的数字为7个管家基因所对应的等位基因编号;括号后的数字表示血清型;分支干上的数字为分支编号. Note: Bar: Nucleoride divergence; Numbers at the branch point are strain number and ST type; Numbers in parenthesis represented the allele number corresponding to the 7 housekeeping gene; Numbers after parentheses indicated serotype; Numbers on the branch trunk are the branch number.
2.4 耐药性测定

2.4.1 MIC

44株HPS安徽株对18种抗生素的MIC测定结果(表 4)显示,氨苄西林、红霉素、头孢噻呋、青霉素和庆大霉素具有较强的抑菌效果,敏感率为88.6%-100%;其次为氟苯尼考、四环素和左氧氟沙星,敏感率为59.1%-77.3%,氟苯尼考的MIC50值距耐药临界点只相差1个稀释度,而四环素和左氧氟沙星MIC50值距耐药临界分别相差4和3个稀释度;对甲氧苄啶+磺胺甲噁唑耐药率最高,为56.8%;其次是恩诺沙星,为43.2%;林可霉素、阿米卡星、强力霉素、链霉素、卡那霉素和阿莫西林等由于缺乏参照,耐药率无法计算(表 5)。

表 4 44株HPS安徽株对18种抗生素的MIC测定结果 Table 4 MIC of 18 antimicrobials in 44 HPS Anhui isolates
抗生素
Antimicrobial
MIC (μg/mL)
≤0.031 25 0.062 5 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 ≥218
阿莫西林AMX 4 4 10 8 1 3 4 6 3 1
庆大霉素GEN 1 2 3 1 2 8 12 15
左氧氟沙星LEV 2 2 6 8 16 3 5 2
氟苯尼考FLO 1 2 1 12 12 12 2 2 2
强力霉素DOX 2 4 14 2 12 2 4 2 2
环丙沙星CIP 2 3 14 11 1 1 8 4
氨苄西林AMP 3 4 10 14 2 2 4 2 2 1
卡那霉素KAN 5 5 15 5 3 1 1 1 1 3 5
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑COT 1 6 4 8 1 6 11 7
链霉素STR 1 5 15 5 1 2 2 2 2 3 6
林可霉素LIN 2 2 2 2 4 4 11 8 9
红霉素ERY 2 5 9 7 6 10 2 1 2
恩诺沙星ENO 2 4 4 4 7 4 2 4 2 3 7 1
青霉素PEN 6 3 9 8 8 5 2 2 1
四环素TET 3 2 7 4 5 2 4 8 5 4
阿米卡星AMI 1 2 7 9 2 2 6 6 5 4
头孢噻呋EFT 4 10 14 3 6 2 1 1 2 1

表 5 44株HPS安徽株对18种抗生素的MIC50、MIC90和耐药率 Table 5 MIC50, MIC90 and drug resistance rates of 18 antimicrobials in 44 HPS Anhui isolates
抗生素
Antimicrobial
MIC50 MIC90 敏感率
Sensitivity (%)
耐药率
Resistance rate (%)
阿莫西林AMX 0.5 8 - -
庆大霉素GEN 2 8 100 0
左氧氟沙星LEV 0.5 16 77.3 15.9
氟苯尼考FLO 2 8 59.1 13.6
强力霉素DOX 0.5 16 - -
环丙沙星CIP 2 16 43.2 31.8
氨苄西林AMP 0.25 4 88.6 6.8
卡那霉素KAN 0.5 64 - -
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑COT 8 32 43.2 56.8
链霉素STR 0.5 218 - -
林可霉素LIN 32 218 - -
红霉素ERY 0.25 32 88.6 11.4
恩诺沙星ENO 1 64 - 43.2
青霉素PEN 0.25 2 93.2 6.8
四环素TET 2 32 61.4 38.6
阿米卡星AMI 2 16 - -
头孢噻呋EFT 0.25 4 88.6 9.1
注:-:无可引用的耐药临界点.
Note: -: An unreferenced critical point for drug resistance.

2.4.2 多重耐药性

44株HPS安徽株对11种抗生素的多重耐药性结果显示,11株(25.0%)耐受2种,11株(25.0%)耐受3种,7株(15.9%)耐受4种,5株(11.4%)耐受5种,2株(4.5%)耐受6种,耐受7种和8种的各1株(2.3%),无单一耐药菌株(图 5);共呈现33种多重耐药谱,其中COT-TET构成比最大,为42.4% (表 6)。

图 5 44株HPS安徽株多重耐药性 Figure 5 The multi-drug resistance of 44 HPS Anhui isolates

表 6 44株HPS安徽株对18种抗生素的多重耐药谱 Table 6 The multi-drug resistance spectrum of 18 antimicrobials in 44 HPS Anhui isolates
耐抗生素种数
Number of antibiotics
菌株数
Number of strains
耐药谱
Antibiogram
2 1 COT+AMP
2 COT+CIP
3 COT+ENO
1 COT+LEV
1 COT+TET
1 ENO+FLO
1 ENO+GEN
1 ENO+TET
3 2 COT+ENO+CIP
1 COT+ENO+FLO
1 COT+ENO+GEN
1 COT+ENO+TET
1 COT+TET+AMP
1 COT+TET+ERY
1 COT+TET+PEN
1 ENO+CIP+FLO
1 ENO+CIP+ERY
1 ENO+TET+EFT
4 1 COT+ENO+TET+ERY
2 COT+ENO+TET+CIP
1 CIP+TET+EFT+FLO
1 ENO+LEV+CIP+AMP
1 ENO+TET+CIP+ERY
1 TET+PEN+CIP+FLO
5 1 COT+TET+ENO+LEV+CIP
1 COT+TET+ERY+CIP+AMP
1 COT+TET+ERY+CIP+FLO
1 ENO+AMP+CIP+TET+ERY
1 ENO+AMP+TET+EFT+FLO
6 1 COT+CIP+TET+ERY+ENO+FLO
1 COT+CIP+TET+ERY+EFT+AMP
7 1 COT+CIP+EFT+ENO+ERY+FLO+TET
8 1 COT+CIP+EFT+ENO+ERY+FLO+TET+AMP
多重耐药谱(构成比)
Multi-drug resistance spectrum to antibiotics (constituent ratio)
COT-TET (42.4%)

2.4.3 耐药性变化趋势

2008-2012年,HPS安徽株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、红霉素、环丙沙星、四环素、头孢噻呋、左氧氟沙星、氟苯尼考、甲氧苄嘧/磺胺甲噁唑和恩诺沙星的耐药率分别为4.5%、4.5%、9.1%、0.0%、36.4%、59.1%、9.1%、27.3%、4.5%、45.5%和27.3%;2013-2017年,耐药率分别为9.1%、9.1%、9.1%、22.7%、27.3%、18.1%、9.1%、4.5%、22.7%、68.1%和59.1% (图 6),对比分析显示HPS分离株对青霉素、氨苄西林、红霉素、氟苯尼考、甲氧苄嘧/磺胺甲噁唑和恩诺沙星耐药率分别上升4.6%、4.6%、22.7%、18.2%、22.6%和31.8%,对环丙沙星、四环素和左氧氟沙星耐药率分别下降9.1%、41.0%和22.8%。

图 6 2008–2017年HPS安徽分离株耐药性的变化趋势 Figure 6 Trends of drug resistance to HPS Anhui isolates from 2008 to 2017
2.5 耐药性与血清型及基因型的关系

在44株HPS安徽株中,有38株对抗生素产生耐药性(表 7),血清型和基因型鉴定结果显示,其中36株优势血清型/基因型菌株有32株耐药,耐药率为88.9%;而8株其他血清型/基因型菌株中有6株菌株耐药,耐药率为75%。通过卡方检验显示,优势血清型/基因型与其他血清型/基因型菌株之间的耐药率无显著性差异(χ2=1.072,P=0.3>0.05),表明不同血清型/基因型菌株之间的耐药性无显著性差异。

表 7 HPS安徽株的耐药性与其血清型、基因型的相关性 Table 7 Correlation between drug resistance and serotype and genotype of HPS Anhui isolates
项目Item 敏感株数
Sensitive strains
耐药株数
Resistant strains
合计株数
Total strains
耐药率
Resistance rate (%)
优势血清型/基因型
Dominant serotypes/genotypes
4 32 36 88.9a
其他血清型/基因型
Other serotypes/genotypes
2 6 8 75a
合计Total 6 38 44 86.4
注:同列字母相同表示差异不显著(P>0.05).
Note: No significant difference was found with the same letter (P>0.05).
3 讨论

近几年,国内猪革拉瑟氏病的流行愈发猛烈,给养殖业带来了巨大的经济损失。目前主要采用药物治疗和疫苗接种进行防控,但已知的HPS血清型就有15种,且不同血清型菌株之间的交叉保护力较低[6],因而监测和调查HPS流行血清型有助于筛选对应型别的疫苗对该病进行有效防控。同时,鉴于当前HPS利用血清型分型还存在较高比例无法定型的菌株,MLST作为一种高分辨率的分型方法,可实现跨区域性细菌流行病学监测,广泛应用于HPS的流行病学调查。此外,抗生素的滥用拓宽了HPS的耐药谱,引发日趋严重的多重耐药现象,通过耐药性分析可正确选择有效药物防控猪革拉瑟氏病。

国外HPS流行血清型主要是血清4型和5型,我国流行的血清型是血清4、5和13型[7],不同国家和地区的的血清型流行情况不同,相同血清型的不同地方分离株其致病力也不尽相同,具有明显的地方性特征[8]。2008-2013年安徽地区HPS主要流行血清4型和13型,2014-2017年新增了血清1、5、7和14型,流行血清型不断增多且不同时间段的流行情况存在差异,提示安徽地区商品化灭活疫苗所针对的血清型与HPS流行血清型型别之间不契合,在免疫保护中存在局限性[9]

与血清型分型相比,基因分型的一个重要优势是能够对所有HPS进行分型。Olvera等[10]通过MLST方法对131株HPS西班牙分离株进行分型,共获得109个ST型,最常见的ST型是ST46;贾爱卿等[11]通过MLST方法对21株HPS广东分离株进行分型,共获得16个ST型,ST121出现频率最高。不同国家和地区HPS的基因型流行情况存在差异,甚至采集于相同猪场的同一头猪的菌株基因型都可能有所不同。2008-2013年安徽地区HPS主要流行ST267和ST268,2014-2017年新增了ST241、ST269、ST270、ST271、ST272、ST273和ST274,基因型种类不断增多,呈现复杂化趋势,表明HPS存在高度的遗传异质性[10]。本研究通过MLST方法对44株HPS安徽分离株进行分型时也发现这7种管家基因位点存在不同程度的突变,且每个位点都具有多个等位基因,但通过基因位点多态性分析显示这些突变大部分为同义突变,不会改变编码的蛋白质。利用BURST软件进行菌群结构分析,发现ST241和ST268型HPS分别被划分在不同的克隆群,其中同一克隆群中的HPS分离株均来源于不同地区以及不同猪场,但具有一定的亲缘关系,推测ST268和ST241型HPS的出现与地区间生猪贸易引起的菌株流入存在相关性。

HPS共有15种血清型,血清型1、5、10、12、13、14型菌株为强毒力菌株,2、4、8和15型菌株具有中等毒力,而3、6、7、9和11型菌株没有毒力,血清型与毒力之间存在一定联系[12]。本研究通过构建UPGMA系统发育树进行聚类分析,发现血清型7型菌株的基因型有ST270和ST271,血清型5型菌株的基因型有ST272、ST273和ST274,而不同基因型菌株之间只对应一种血清型,表明ST型与血清型之间存在一定的交叉性,同一血清型菌株可具有多个ST型,但单个ST型只能被定义到唯一血清型[13]。44株安徽地区HPS分离株被划分在4个分支上,分支1中分离株包含无毒力和强毒力菌株,主要分离于鼻腔,分支2、3和4中分离株全部趋向于强毒力,多分离于肺、脑和关节等病理损害部位,这表明在特定分支之间不同ST型HPS菌株的毒力具有一定联系,该发现为基因水平上区分非致病性和致病性HPS提供了依据。

耐药性分析是选择有效药物的基本依据。本研究测定了44株HPS安徽分离株对18种抗生素的MIC,结果显示庆大霉素、青霉素、氨苄西林、头孢噻呋和红霉素对细菌的抑制效果最好,敏感率为88.6%-100%。而英国HPS分离株对红霉素、头孢噻呋、替米考星、氟苯尼考和青霉素敏感[14],上海HPS分离株对替米考星、头孢噻呋、泰妙菌素、阿奇霉素和阿米卡星敏感[15],这表明不同地区HPS分离株对抗生素的敏感性存在差异,因此,在实际生产中一定要通过药敏试验筛选出有效药物,并科学合理使用。然而,不同地区HPS分离株的多重耐药性日趋严重,耐药谱不断扩大。四川地区的82株HPS分离株中5-8种耐药占比最多,为21.95%-30.49%,有7株可耐受多达13种药物[16]。华南地区的115株HPS分离株对3种或3种以上药物耐药率为100%,7重耐药菌株占19.13%,8重耐药菌株占17.39%[17]。抗生素的不合理使用,以及不同耐药基因在细菌间的相互传递和蔓延导致多重耐药性的流行[18]。此外,安徽地区HPS分离株在2008–2012年间主要对环丙沙星、四环素和甲氧苄嘧/磺胺甲噁唑表现出较强的耐药性,而在2013–2017年间则对甲氧苄嘧/磺胺甲噁唑和恩诺沙星耐药严重,表明不同时间段内HPS分离株的耐药情况都在发生变化,这主要是药物的选择压力所造成[19]

4 结论

安徽地区HPS流行菌株血清型和基因型呈现多元化,具有较高的遗传异质性;HPS耐药率逐年上升,多重耐药现象严重,青霉素和庆大霉素为目前临床防治猪革拉瑟氏病的首选药物,血清型、ST型与耐药性之间无明显相关性。

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