双斑东方鲀(Takifugu bimaculatus)，隶属鲀形目、鲀科、东方鲀属，为近海暖温性底层鱼类，其肉质细嫩、鲜美，营养价值高，被誉为“鱼中之王”，为福建省当地特色养殖鱼类品种，已在福建沿海规模化养殖。随着双斑东方鲀产业规模的扩大，养殖过程中病害时有发生。国内有关东方鲀病害研究主要集中在红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的病害^[1-9]，而针对双斑东方鲀的病害研究则比较少，仅袁定清等^[10]对双斑东方鲀的病害种类进行了调查及防治技术初探，其病害有待于进一步深入研究。

2016年6月福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地部分养殖的双斑东方鲀体表出现溃烂，病鱼特征为：游动缓慢，停止摄食，口角、表皮、鳍条缺损溃烂，溃烂处周边皮肤发红，病鱼易出现死亡。本研究对引起双斑东方鲀皮肤溃烂的病原进行分离、纯化，通过菌株形态学、生理生化特征分析、16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建对菌株进行鉴定，开展了病原菌致病性和药物敏感性分析，以期为养殖过程中该疾病的有效防治提供技术参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼

双斑东方鲀试验鱼来自福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地。取具有典型皮肤溃烂症病鱼用于病原分离；取体表无损伤、健康活泼、平均体长18.0±1.0 cm、体重161.0±3.5 g的双斑东方鲀个体用于人工感染试验。

1.1.2 主要试剂和仪器

细菌生化微量反应管和药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司。PCR仪，Thermo公司；VITEK^Ⓡ 2 COMPACT全自动微生物分析仪，梅里埃公司。

1.1.3 培养基

2216E培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，柠檬酸铁0.1，琼脂16.0，pH 7.6。

TCBS培养基(g/L)：琼脂15.0，酵母浸粉5.0，蛋白胨10.0，硫代硫酸钠10.0，枸橼酸钠10.0，牛胆粉5.0，牛胆酸钠3.0，蔗糖20.0，氯化钠10.0，柠檬酸铁1.0。

2216E液体培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏1.0，柠檬酸铁0.1，氯化钠19.5，氯化镁5.9，硫酸钠3.2，氯化钙1.8，氯化钾0.6，碳酸氢钠0.2。

1.2 病原菌分离

观察病鱼(濒死)体表体征及内脏器官情况；取体表黏液、溃疡处肌肉组织、鳃及内脏器官等显微镜检，观察是否有寄生虫或真菌感染。用灭菌海水清洗病鱼(濒死)体表，无菌操作条件下从病鱼的脾脏、肾脏和溃疡处肌肉等器官组织分离细菌，划线接种于2216E平板和TCBS培养基上，置28 ℃恒温箱培养。24 h后观察菌落大小及形态，挑取形态一致的优势菌落纯化培养，纯化2-3次后再转接至斜面培养基上，用甘油生理盐水(30%)保存于超低温冰箱，备用。

1.3 人工感染实验

将1.2所分离纯化的优势菌株接种于2216E液体培养基，100 r/min、28 ℃培养24 h。用无菌生理盐水将细菌培养物梯度稀释，配制成浓度分别为3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵ CFU/mL的菌悬液，备用。参照文献[2]进行人工感染实验设计，实验组分4个注射浓度梯度，分别为3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵ CFU/mL，采用肌肉注射方式感染，注射菌悬液量为0.2 mL/尾，对照组注射相同剂量无菌生理盐水，每组各30尾鱼。试验期间每天正常饲养、投饵、换水，连续观察14 d，记录各组实验鱼发病及死亡情况。采用冠氏法计算菌株对双斑东方鲀的半致死浓度(LD₅₀)^[11]。从人工感染后濒死患病鱼的肾脏、脾脏和溃疡处肌肉等组织再次分离、纯化细菌，并再重复人工感染一次。

1.4 病原菌鉴定确认

病原菌部分生理生化鉴定参照《伯杰氏鉴定细菌学手册》^[12]和《常见细菌系统鉴定手册》^[13]方法进行，同时采用VITEK^Ⓡ 2 COMPACT全自动微生物分析仪对病原菌进行其它理化指标分析。病原菌经培养基28 ℃培养24 h后，涂片、革兰氏染色观察、透射电镜观察拍照。

1.5 16S rRNA基因序列分析鉴定与系统发育分析

1.5.1 模板DNA制备及扩增

将分离纯化的菌株接种于液体培养基，100 r/min、28 ℃培养过夜，取培养菌液10 μL于PCR反应管，8 000 r/min离心5 min，弃上清，加10 μL ddH₂O，99 ℃加热10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清(细菌DNA)作为PCR反应模板。PCR扩增引物为27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系：细菌DNA 1 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTPs 200 μmol/L，引物各0.4 μmol/L，Taq聚合酶1.25 U。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.2 16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建

PCR扩增产物送至Invitrogen公司测序。去除前后模糊序列后，将测得基因序列经BLAST程序与GenBank核酸数据库进行相似性比对分析，相似的序列在ClustalX软件进行多重匹配并聚类分析。采用MEGA 4.0软件邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

1.6 病原菌药物敏感性分析

药敏试验采用KB纸片扩散法。纯化的病原菌通过梯度稀释，配制成1.0×10⁹ CFU/mL菌悬液，吸取0.1 mL均匀涂布在2216E平板上，用无菌镊子将抗生素纸片贴在2216E培养基上，每一平板放置3片药敏纸片，28 ℃培养24 h后，测定抑菌圈的直径。根据天和微生物试剂有限公司网站所给出药敏纸片抑菌范围解释标准，判断致病菌株对药物的敏感程度。

2 结果与分析 2.1 病鱼体征和病原菌分离结果及致病性确定

2.1.1 病鱼体征

病鱼特征为：游动缓慢，停止摄食，口角和表皮溃烂，鳍条缺损溃烂，溃烂处周边皮肤发红，肾脏、脾脏充血严重。体表病灶组织、鳃、内脏器官等镜检未发现有寄生虫或真菌。

2.1.2 病原菌分离结果

从脾脏和肾脏中均可分离到单一的SBDFT-1#菌落；从患病鱼体表病灶分离出4株菌，4株菌菌落形态各不同，其中SBDFT-1#为优势菌，SBDFT-2#、SBDFT-3#和SBDFT-4#为少数菌。SBDFT-1#在2216E平板上培养24 h后菌落形态为乳白色，边缘透明，中间凸起，直径1.0-1.5 mm左右(图 1A)；在TCBS培养基上培养24 h后菌落呈黄色，直径为1.5-2.0 mm，表面光滑，边缘整齐，中央隆起(图 1B)。根据内脏器官和体表病灶分离菌株结果及病鱼体表病灶特征，确认以优势菌株SBDFT-1#进行后续所有实验。

2.1.3 致病性确定

人工感染实验结果显示，优势菌SBDFT-1#对双斑东方鲀具有明显致病性。感染后患病(濒死)的双斑东方鲀症状表现为：体表溃烂，溃烂处周边皮肤发红，鳍条缺损，肾脏、脾脏充血严重；这些特征与自然发病症状大致相同，但感染初期鱼体皮肤发红，注射部位肿胀明显，后期发脓严重且液化(图 2)。不同浓度菌悬液肌肉注射感染后，对双斑东方鲀的致死率见表 1，3×10⁸ CFU/mL组实验鱼第3天就出现死亡，第10天全部死亡；3×10⁷ CFU/mL组第6天出现死亡，至第14天死亡率为50%；3×10⁶ CFU/mL组第10天出现死亡，至第14天死亡率为10%；3×10⁵ CFU/mL组实验鱼有症状，但至第14天未出现死亡。根据实验鱼死亡情况，计算出菌株SBDFT-1#对双斑东方鲀的半致死浓度LD₅₀为2.38×10⁷ CFU/mL。人工感染后，从发病双斑东方鲀的脾脏、肾脏和体表病灶部位均可重新分离到与SBDFT-1#形态一致的菌落，其理化性质也一致。再次分离到菌株重新人工感染获得相同结果。根据人工感染和重新人工感染的患病鱼症状及重分离细菌鉴定结果，确定菌株SBDFT-1#为病原致病菌。

2.2 病原菌的菌种鉴定

2.2.1 病原菌菌株形态观察

透射电镜结果显示：菌株SBDFT-1#菌体大小约为0.9×2.0 µm，呈短杆状，极生单鞭毛，两端钝圆(图 3A)；菌株革兰氏染色为阴性(图 3B)。

2.2.2 病原菌生理生化特性

病原菌SBDFT-1#生理生化分析结果见表 2，其生理生化特征为：具运动性，氧化酶、接触酶阳性，生长需要NaCl，4 ℃和42 ℃不生长，葡萄糖发酵，丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶、D-海藻糖、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-甘露醇、磷酸酶、甘氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶等反应为阳性，其余反应为阴性(表 2)。参考文献[12-14]进行了60项相关生理生化指标测定，结果显示其与哈维氏弧菌生理生化特征相似，初步判断菌株SBDFT-1#为哈维氏弧菌。

2.2.3 病原菌16S rRNA基因序列分析

对菌株SBDFT-1#进行PCR扩增，获得长度为1 426 bp的核酸片段。上传测序序列至NCBI数据库获得序列登录号为MK685121.1，并进行BLAST比对，结果显示菌株SBDFT-1#与数据库中Vibrio harveyi的一致性最高，相似度为100%；利用MEGA 4.0软件构建的系统发育树结果显示，菌株SBDFT-1#与V. harveyi (EU090704.1)聚为一支，置信度98% (图 4)，结合生理生化实验结果将其鉴定为哈维氏弧菌。

2.3 病原菌药物敏感性分析

菌株SBDFT-1#对13大类32种抗生素敏感性分析结果：对14种药物敏感，9种药物中度敏感，9种药物耐药(表 3)。敏感性药物主要分布在青霉素类、头孢类、头霉素类、酰胺醇类、喹诺酮类、氨基糖苷类、氨基环醇类、磺胺类和其它类，具体包括苯唑西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢西叮、氯霉素、氧氟沙星、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、大观霉素、复方新诺明、呋喃妥因、多粘菌素B等；耐药性药物包括青霉素类的氨苄西林、青霉素、哌拉西林，头孢类的头孢唑啉、头孢吡肟，四环素类的四环素和大环内酯类的红霉素、克拉霉素、麦迪霉素等。

3 讨论与结论

病原菌鉴定是指将分离、纯化的病原菌进行系统分类鉴定。传统细菌分类鉴定依据菌株形态学及生理生化测定完成，鉴定过程耗时、繁琐；通过全自动微生物分析仪对细菌分类鉴定，可快速、准确测定细菌生理生化特性^[15]，但受制于全自动微生物鉴定系统中海洋微生物标准菌株数据库缺乏，无法完全达到鉴定到种；分子生物学鉴定快速、准确，但缺乏表型鉴定^[16]。目前海洋生物致病菌分类鉴定方法主要基于菌株生物学特性、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析相结合确认^[17-19]，其鉴定结果更加准确、可靠。本研究从患皮肤溃烂症双斑东方鲀内脏器官分离、纯化出致病菌，结合人工感染试验，采用菌株形态学、生理生化特征分析、16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建等手段，鉴定致病菌SBDFT-1#为哈维氏弧菌。

哈维氏弧菌是一种广泛分布于海洋水体中的细菌^[20]，属于比较流行、常见的致病性弧菌，可引起多种海水养殖经济鱼类(如红鳍东方鲀、大黄鱼、花鲈、斜带石斑鱼、大菱鲆、鮸鱼、半滑舌鳎、浅色黄姑鱼、豹纹鳃棘鲈、海马、美洲黑石斑等)^{[2, 21-30]}感染发生皮肤溃疡。本研究首次从患病双斑东方鲀分离出哈维氏弧菌，并确认其致病性。其致病特征为双斑东方鲀口角、表皮、鳍条缺损溃烂，病灶处周边皮肤发红，游动缓慢，肾脏、脾脏充血，病鱼停止摄食，易出现死亡。多数患哈维氏弧菌病的鱼类会出现皮肤肌肉溃烂、眼球突出、体表出血、内脏充血肿大等症状^{[14, 31]}，而本研究报道的双斑东方鲀和王斌等^[2]报道的红鳍东方鲀患病后未出现眼球突出症状，Qin等^[29]报道线纹海马患病后体表出现穿孔症状，表明不同鱼类患哈维氏弧菌病的发病特征有差异。研究发现哈维氏弧菌肌肉注射感染试验鱼，其注射部位组织症状表现为肿大发炎，后液化溃烂^{[2, 21-22, 30, 32]}，本研究证实了双斑东方鲀肌内注射感染试验也会出现相似症状。

本研究选32种抗生素进行药敏试验，目的在于分析菌株SBDFT-1#对不同药物的敏感性和耐药谱情况，而并非可用于养殖生产，仅供临床参考。在水产许可药物目录内(农业部第1435号公告、第1506号公告、第1759号公告和第1960号公告及2010年版《中华人民共和国兽药典》中予以公布的)，菌株SBDFT-1#对磺胺类药物(复方新诺明)敏感，对多数喹诺酮类药物中度敏感，可使用复方新诺明防治该养殖区双斑东方鲀哈维氏弧菌病。不同来源地区、不同宿主的哈维氏弧菌株耐药谱型存在差异，谢楚萍等^[27]从浅色黄姑鱼分离出哈维氏弧菌耐药谱为氨苄西林、青霉素、苯唑青霉素、先锋霉素VI、羧苄青霉素和卡那霉素；陈建国等^[30]从美洲黑石斑鱼分离出哈维氏弧菌耐药谱为氨苄西林、头孢氨苄、诺氟沙星、头孢拉定、多粘菌素B、阿奇霉素、青霉素等；Austin等^[33]研究发现哈维氏弧菌耐药谱为氨苄青霉素、链霉素、磺胺二甲唑；本研究从双斑东方鲀分离出的哈维氏弧菌耐药谱为氨苄西林、青霉素、哌拉西林、头孢唑啉、四环素、克拉霉素、麦迪霉素等；而刘开放等^[34]认为来源于不同养殖水体的哈维氏弧菌耐药谱型多样，且差异明显。哈维氏弧菌的耐药谱型复杂多样，因此各养殖区应做好不同来源哈维氏弧菌的药敏分析实验和耐药谱型调查，然后根据菌株药敏实验结果指导生产用药。使用抗生素是防治水生生物微生物疾病的主要手段，但是长期滥用抗生素会导致病原产生耐药性，药物也会残留在生物体内。所以生产上应在药敏实验基础上选择适合的许可药物进行病害防治，且商品鱼上市前留有足够休药期。

在养殖过程中，双斑东方鲀因水环境恶化、相互咬伤或发生寄生虫感染致抵抗力变弱，易导致哈维氏弧菌感染。生产上防治哈维氏弧菌病应以预防为主：合理控制养殖密度，尽量避免相互咬伤或皮肤损伤，同时加强营养、提高鱼体免疫力；病发期，要加强病鱼隔离，及时正确药物治疗。