2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 赵雅, 张岱, 杨志辉, 朱杰华, 赵冬梅, 薛雪
- ZHAO Ya, ZHANG Dai, YANG Zhi-Hui, ZHU Jie-Hua, ZHAO Dong-Mei, XUE Xue
- 贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株发酵液稳定性测定及抑菌活性成分分析
- Determination of the stability of fermentation broth and analysis of active components of Bacillus velezensis HN-Q-8
- 微生物学通报, 2020, 47(2): 490-499
- Microbiology China, 2020, 47(2): 490-499
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190496
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文章历史
- 收稿日期: 2019-06-12
- 接受日期: 2019-09-03
- 网络首发日期: 2019-10-10
2. 新加坡利农私人有限公司 北京 100026
2. Singapore AGROLEX Private Limited Beijing Representative Office, Beijing 100026, China
芽胞杆菌(Bacillus spp.)是农业生产中应用较多的一种生防菌，作为微生态环境的优势种群，具有繁殖力强，理化性质稳定，广泛的抑菌谱，以及促进植物生长，修复农化污染环境等特点，能够满足农药减量控害增效以及绿色农业可持续发展的要求[1]，目前中国已自主开发出多种生防菌剂[2]。
目前应用于生物防治研究中芽胞杆菌的种类主要有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)[3]、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)[4]、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)[5]和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)[6]。枯草芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌等多个芽胞杆菌种的基因组测序已完成，其基因组差异较大。对生防芽胞杆菌的研究已不再局限于菌株的分离筛选，而是通过研究芽胞杆菌与病原菌互作，探索生防机制。芽胞杆菌能够产生次生代谢产物，主要包括脂肽类抗生素和抗菌蛋白两类拮抗因子，通过溶解病原体的细胞壁或细胞膜，干扰其蛋白合成、能量代谢和细胞分裂等作用，从而抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发[7]。莫哈韦芽胞杆菌(Bacillus mojavensis)能够合成蛋白酶和脂肽类物质抑制大丽花轮枝孢和黑白轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的孢子萌发[8]。贝莱斯芽胞杆菌S6产生的抗菌蛋白能够拮抗茄链格孢(Alternaria solani)，使其菌丝发生扭曲、畸形、肿大，抑制其孢子萌发[9]。但是，生防芽胞杆菌产生的活性物质易受到温度、光照和pH等因素影响，导致稳定性下降。苏云金芽胞杆菌Bt185发酵上清液在50 ℃以上高温处理后抑菌活性开始下降[10]；解淀粉芽胞杆菌HZM9菌株发酵液经光照处理12 h后抑菌活性减弱[11]；枯草芽胞杆菌a1产生的抗真菌活性物质在pH > 8.0时，其活性降低[12]。
贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株是本实验室从黑痣病病害发生严重的马铃薯连作地块根际土壤中分离得到[13]。通过对贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株发酵液稳定性、抑菌活性物质等方面进行探究，为进一步阐释抑菌机制奠定基础，为开发生物菌剂提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8由本实验室分离保存。供试马铃薯病原菌5种：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄链格孢(Alternaria solani)、茄病镰孢(Fusarium sambucinum)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthora infestans)，均由本实验室分离保存。立枯丝核菌ZB4菌株作为HN-Q-8抑菌稳定性测定的主要靶标菌。
1.1.2 培养基LB培养基(g/L)：酵母膏5.0，氯化钠10.0，蛋白胨10.0，pH 7.0−7.2；黑麦培养基(g/L)：黑麦60.0，琼脂10.0−15.0，蔗糖20.0；PDA (potato dextrose agar)固体培养基(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂20.0。所有培养基均在1×105 Pa灭菌20 min备用。
1.1.3 主要试剂和仪器酵母膏、蛋白胨、琼脂，北京奥博星生物技术有限公司；甲醇、氯化钠、蔗糖、葡萄糖，国产分析纯。
恒温振荡器，上海右一仪器有限公司；高速离心机，赛默飞世尔科技有限公司；恒温培养箱，宁波江南仪器厂；三重串联四级杆质谱仪，安捷伦科技股份有限公司。
1.2 方法 1.2.1 HN-Q-8菌株发酵液制备将HN-Q-8菌株接种于LB液体培养基，37 ℃、200 r/min培养24 h，取100 μL接种到100 mL LB液体培养基继续培养48 h。HN-Q-8菌株发酵液于9 500 r/min离心25 min，取上清液备用。
1.2.2 对5种马铃薯病原菌的拮抗作用HN-Q-8菌株发酵液与各培养基按1:9体积比充分混合，制成含HN-Q-8菌株无菌发酵液的培养基，以无菌水做空白对照。在平板中心分别接入5种供试病原菌(茄病镰孢、立枯丝核菌、茄链格孢、致病疫霉、尖镰孢菌)菌饼(5 mm)，每个处理重复3次。将致病疫霉置于18 ℃培养，其余4种供试病原菌置于25 ℃培养，待对照组菌落长满培养皿时，测量对照组和处理组菌落的生长直径，计算HN-Q-8菌株发酵液的抑菌率。抑菌率=(对照组菌落生长直径−处理组菌落生长直径)/(对照组菌落生长直径−菌饼直径)×100%。
1.2.3 HN-Q-8菌株活性成分的稳定性紫外光稳定性：将HN-Q-8菌株发酵液置于距离30 W紫外灯30 cm处，分别照射5、10、15、25、35 min，以未经紫外线处理的HN-Q-8菌株发酵液为对照，以未经紫外处理的无菌水为空白对照，置于25 ℃条件下培养4 d，每个处理重复3次。以立枯丝核菌ZB4为指示菌，计算HN-Q-8菌株发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=(空白对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/(空白对照菌落生长直径−未处理菌落生长直径)×100%。
自然光稳定性：将HN-Q-8菌株发酵液置于4 000 lx的光照箱中央，分别照射2、4、6、8、10、12 h后，以未经自然光处理的HN-Q-8菌株发酵液为对照，以未经自然光处理的无菌水为空白对照，置于25 ℃条件下培养4 d。每个处理重复3次。以立枯丝核菌ZB4为指示菌，计算HN-Q-8菌株发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=(空白对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/(空白对照菌落生长直径−未处理菌落生长直径)×100%。
蛋白酶稳定性：将HN-Q-8菌株发酵液分别加入蛋白酶K和胰蛋白酶，酶的终浓度为5 μg/mL，37 ℃处理2 h，制成含药培养基，以未处理的发酵液为对照，以未经蛋白酶处理的无菌水为空白对照，置于25 ℃条件下培养4 d。每个处理重复3次。以立枯丝核菌ZB4为指示菌，计算HN-Q-8菌株发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=(空白对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/(空白对照菌落生长直径−未处理菌落生长直径)×100%。
热稳定性：将HN-Q-8菌株发酵液分别在30、40、50、60、70、80、90、100和121 ℃条件下处理30 min，待温度冷却后，以未经温度处理的发酵液为对照，以未经温度处理的无菌水为空白对照，25 ℃条件下培养4 d。每个处理重复3次。以立枯丝核菌ZB4为指示菌，测定不同温度处理下HN-Q-8菌株发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=(空白对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/(空白对照菌落生长直径−未处理菌落生长直径)×100%。
酸碱稳定性：将HN-Q-8菌株发酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分别调整pH值为2、4、6、8、10、12，静置24 h后，调至pH值为7.5 (初始pH)，以未经酸碱处理的发酵液为对照，以未经酸碱处理的无菌水为空白对照，25 ℃条件下培养4 d。每处理重复3次。以立枯丝核菌ZB4为指示菌，计算HN-Q-8菌株发酵液的相对抑菌率。相对抑菌率=(空白对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/(空白对照菌落生长直径−未处理菌落生长直径)×100%。
1.2.4 活性成分对菌丝生长的影响挑取1.2.2中HN-Q-8菌株发酵液抑菌圈边缘的立枯丝核菌ZB4的菌丝，在光学显微镜下观察其菌丝形态[14]，对照为正常生长的立枯丝核菌ZB4的边缘菌丝，分析HN-Q-8菌株发酵液对立枯丝核菌ZB4菌丝的影响。
1.2.5 HN-Q-8菌株甲醇粗提物的抑菌活性采用酸沉淀法提取活性物质[15]。将发酵液于4 ℃、8 000 r/min离心20 min，收集上清液，用6 mol/L的HCl调节pH至2.0，4 ℃过夜。4 ℃、8 000 r/min离心20 min收集沉淀，用甲醇反复抽提，过滤干燥，配成浓度为1 mg/mL的甲醇溶液。采用平板对峙培养法，取立枯丝核菌ZB4菌饼于PDA平板中央，将50 μL的甲醇提取物和甲醇分别接种于距离平板中央25 mm处。以只接立枯丝核菌ZB4的平板为对照，25 ℃培养4 d。每处理重复3次。
1.2.6 HN-Q-8菌株活性成分鉴定采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定甲醇粗提物的成分。方法参考文献[16]，确定仪器真空度为10-7-mbar或无，开始样品分析时先进行分子量校正，使用337 nm氮激光源解吸附和电离，采用α-氰-4-羟肉桂酸为基质，取1 μL样品与等体积的基质混匀，置于仪器离子源进行测定。质量扫描范围为1 000−2 000 Da。
1.3 数据分析应用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 HN-Q-8菌株对5种马铃薯病原菌的拮抗作用HN-Q-8菌株发酵液对立枯丝核菌、尖镰孢菌、茄链格孢和致病疫霉均有较强的拮抗作用，培养4−7 d后均出现明显的抑菌圈(图 1)，对抑菌直径测定计算后，抑菌率可达49%−89%。对茄病镰孢抑菌效果一般，抑菌率仅为24% (表 1)。
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| 图 1 贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株发酵液对5种马铃薯病原菌的抑菌作用 Figure 1 Inhibitory effects of fermentation broth of B. velezensis HN-Q-8 on five pathogens of potato 注：A：立枯丝核菌；B：茄病镰孢；C：茄链格孢；D：尖镰孢菌；E：致病疫霉.左：处理后生长的病原菌；右：正常生长的病原菌. Note: A: Rhizoctonia solani; B: Fusarium sambucinum; C: Alternaria solani; D: Fusarium oxysporum; E: Phytophthora infestans. Left: Treated growth pathogens; Right: Normal growth pathogens. |
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| 病原菌 Pathogens |
抑菌直径 Inhibitory diameter (cm) |
抑菌率 Inhibiting rate (%) |
| 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani |
5.56±0.50a | 89.68±0.79a |
| 茄病镰孢 Fusarium sambucinum |
1.58±0.92e | 24.17±1.42d |
| 茄链格孢 Alternaria solani |
3.85±0.17d | 72.85±0.32b |
| 尖镰孢菌 Fusarium oxysporum |
3.10±0.83c | 50.78±1.38c |
| 致病疫霉 Phytophthora infestans |
2.73±0.36b | 49.82±0.91c |
| 注：表中数据为平均数±标准差.不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: Data are mean±SD. Different letters on the bars indicate significant difference at P < 0.05 level by Duncan’s new multiple range test. | ||
从图 2A可以看出，HN-Q-8菌株发酵液经5−10 min的紫外照射，其抑菌活性没有明显变化，紫外照射35 min后抑菌活性略有降低，但其相对抑菌率仍达到74%，表明HN-Q-8菌株发酵液在紫外照射下仍具有较强的抑菌作用，HN-Q-8菌株发酵液具有较好的紫外稳定性。
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| 图 2 不同条件下贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株发酵液的抑菌稳定性 Figure 2 Antifungal stability of B. velezensis HN-Q-8 fermentation broth under different conditions 注：A：紫外光；B：日光灯；C：蛋白酶种类；D：温度；E：酸碱度.图中数据为平均数±标准差.不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著. Note: A: Ultraviolet light; B: Lamp light; C: Protease types; D: Temperature; E: Acidity and alkakinity. Data are mean±SD. Different letters on the bars indicate significant difference at P < 0.05 level by Duncan's new multiple range test. |
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经不同时间段自然光照射，HN-Q-8菌株发酵液抑菌活性发生一定变化(图 2B)。自然光照射2−10 h，HN-Q-8菌株发酵液的抑菌活性较强，相对抑菌率均在90%以上；照射8 h时，相对抑菌率高达100%；自然光照射12 h，相对抑菌率降低，为69%。说明HN-Q-8菌株发酵液具有较好的自然光稳定性。
2.2.3 蛋白酶稳定性HN-Q-8发酵液经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后，抑菌活性较对照无显著差异(图 2C)。表明HN-Q-8发酵液对两种供试的蛋白酶不敏感。
2.2.4 热稳定性由图 2D可知，在30−100 ℃处理30 min后发酵液的相对抑菌率保持在80%以上。加热至100 ℃，相对抑菌率仍然达到98%。121 ℃高温灭菌处理30 min后，其相对抑菌率降到了69%。说明发酵液中的抑菌活性物质对高温有较强的耐受性，30−100 ℃具有良好的热稳定性。
2.2.5 酸碱稳定性如图 2E所示，pH 8.0时，相对抑菌率最大为107%。但在强酸和强碱处理下抑菌活性均呈下降趋势，即pH 2.0时，抑菌活性下降，相对抑菌率为72%；pH为12.0时，抑菌活性明显下降，相对抑菌率最低，为34%。表明该抑菌活性物质不耐强酸、强碱，适宜pH为4.0−10.0。
2.3 HN-Q-8菌株活性成分对菌丝形态的影响对照组病原真菌菌丝生长正常(图 3A)，形态均匀(图 3B)；而处理组病菌真菌菌丝受到HN-Q-8菌株活性成分的抑制，菌丝生长不均匀(图 3C)，形态畸形扭曲，顶端弯曲(图 3D)。说明HN-Q-8菌株发酵液中含有活性物质能使病原真菌菌丝表型形态畸形，从而抑制立枯丝核菌ZB4的生长，达到拮抗立枯丝核菌的效果。
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| 图 3 贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液对立枯丝核菌菌丝的影响 Figure 3 Effect of B. velezensis HN-Q-8 fermentation broth on hyphae of Rhizoctonia solani 注：A−B：40倍和200倍镜下正常生长的菌丝；C−D：40倍和200倍镜下HN-Q-8发酵液作用后的菌丝. Note: A−B: Normal mycelium under 40-and 200-fold microscopic observation; C−D: Treated mycelium under 40-and 200-fold microscopic observation. |
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HN-Q-8菌株甲醇粗提取物可以明显抑制马铃薯黑痣病菌的生长，溶剂甲醇对马铃薯黑痣病菌的生长无抑制作用(图 4)，说明HN-Q-8菌株甲醇粗提物中含有活性成分，对马铃薯黑痣病菌ZB4有抑制作用。
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| 图 4 贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株甲醇粗提物对立枯丝核菌的抑菌作用 Figure 4 Antifungal effect of methanol extract of B. velezensis HN-Q-8 on Rhizoctonia solani 注：A：正常生长的立枯丝核菌；B：被抑菌活性物质作用后的立枯丝核菌. Note: A: Untreated control Rhizoctonia solani; B: Rhizoctonia solani after co-culture with HN-Q-8 active substances. |
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将HN-Q-8菌株甲醇提取物的活性物质进行MALDI-TOF-MS测定。如图 5所示，发现其质谱峰峰值m/z为1 058.700 00和1 477.900 00，为表面活性素钠离子加合峰和丰原素质子加合峰。说明HN-Q-8菌株甲醇提取物的活性物质中含有表面活性素(suractin)和丰原素(fengycin)两种脂肽类化合物。
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| 图 5 贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株甲醇提取物活性物质的MALDI-TOF-MS分析 Figure 5 MALDI-TOF-MS analysis of antifungal active substances in methanol extract of B. velezensis HN-Q-8 |
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本研究中HN-Q-8菌株发酵液经温度、紫外光、自然光、pH等不同条件处理后，其抑菌活性不同，说明芽胞杆菌活性物质稳定性易受到外界条件的影响。这与前人研究结果相一致，吴艳清等[17]研究发现芽胞杆菌YQ5在经100 ℃高温处理30 min抑菌率下降到52.9%；王琦等[18]研究发现海洋解淀粉芽胞杆菌GM-1在光照16 h后抑菌活性明显下降；李颖等[19]研究发现枯草芽胞杆菌SH-1产生的活性物质不耐强酸强碱。此外，不同芽胞杆菌菌株发酵液的稳定性不同。胡忠亮等研究发现，解淀粉芽胞杆菌HZM9菌株发酵液121 ℃处理30 min后抑菌活性下降到28.94%[11]，而本研究中HN-Q-8发酵液在121 ℃处理30 min后其相对抑菌率仍然为69%；海洋多粘类芽胞杆菌L1-9发酵液经紫外线照射5 min中后抑菌活性明显下降[20]，而本研究中HN-Q-8发酵液在紫外照射35 min后相对抑菌率仍达到74%。说明本实验室筛选得到的菌株具有较强的耐热和耐紫外的能力。HN-Q-8菌株发酵液稳定性良好，适用于田间条件下储存及应用，具有一定的开发前景。
芽胞杆菌代谢产生的脂肽类抗生素具有广谱抗真菌活性，是芽胞杆菌发挥生防作用的主要因子[21]。根据结构不同，可将其分为丰原素家族(fengycins)、伊枯草菌素家族(bacillomycins)和表面活性素家族(surfactins)[22]。这些物质能够导致病原菌菌丝生长畸形、顶端膨大，以及抑制病原菌的孢子萌发[23]。向亚萍等[24]发现解淀粉芽胞杆菌B1619菌株能产生Bacillomycin L、Fengycin和Surfactin三种脂肽类化合物，抑制尖镰孢菌菌丝的生长。解淀粉芽胞杆菌C06能产生Bacillomycin和Fengycin，抑制果产核盘菌孢子萌发和菌丝生长[25]。本研究中贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8菌株发酵液主要活性物质为Fengycin和Surfactin两种脂肽类化合物，对立枯丝核菌菌丝有致畸作用，与上述结果相似。另外，3种脂肽类抗生素对不同病原菌群体拮抗能力存在差异。表面活性素具有抗病毒、抗支原体和抗细菌的活性[26]。与表面活性素相比，伊枯草菌素和丰原素具有更强的抗真菌能力[27]和一定程度的抗细菌能力。但是，3种脂肽类抗生素在抑菌过程中会表现出协同增效作用[28]。因此，本研究中HN-Q-8菌株产生的两种活性物质，在抑制立枯丝核菌过程中的具体作用方式还有待进一步研究。
本研究采用MALDI-TOF-MS方法，对HN-Q-8菌株活性成分进行了分析鉴定。MALDI-TOF-MS方法通过脉冲激光将待测样品离子化，产生的离子在加速电压作用下分离，不同质荷比的离子飞行速度不同，根据不同飞行时间对物质进行鉴定[29]。MALDI-TOF-MS方法有准确性高、灵敏度高、检测范围宽及操作方便等特点[30]；并且分析时间短，有较强的抗干扰性，而且样品用量少，一般只需要毫克级的质量。样品不必做精细纯化，前处理过程简单易操作，待测组分中含有一些杂质也不会影响检测准确性[31]。本研究只通过盐酸沉淀和甲醇萃取等少量纯化步骤，最大限度地保留活性成分，使实验结果更加准确。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)只能通过保留时间来推测物质成分[32]，检测准确性低。
总之，HN-Q-8菌株发酵液具有很强的抑菌活性和稳定性，能产生脂肽类化合物Fengycin和Surfactin抑制立枯丝核菌的生长。在马铃薯黑痣病的防治中有很好的应用前景，为开发新型
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