2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 谢婷, 刘守强, 张宏周, 刘俭国, 谢书琴, 王雪洁, 刘建超
- XIE Ting, LIU Shou-Qiang, ZHANG Hong-Zhou, LIU Jian-Guo, XIE Shu-Qin, WANG Xue-Jie, LIU Jian-Chao
- 林可霉素生产中三级种子罐的发酵工艺优化
- Optimization of fermentation process of the third-stage seed fermenter in lincomycin production
- 微生物学通报, 2020, 47(12): 4359-4365
- Microbiology China, 2020, 47(12): 4359-4365
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.191082
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文章历史
- 收稿日期: 2019-12-25
- 接受日期: 2020-02-27
- 网络首发日期: 2020-04-09
林可霉素(lincomycin)属于林可酰胺类抗生素[1-2]，能够明显抑制革兰氏阳性细菌，是一种生物活性良好、副作用较小的广谱抗生素，具有重要的临床应用价值[3-7]。林可霉素由一分子4-甲基-脯氨酸和一分子含硫辛糖通过肽键缩合而成，化学结构见图 1[8-9]。
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| 图 1 林可霉素的化学结构 Figure 1 Chemical structure of lincomycin |
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目前林可霉素国内生产水平约在6 500- 7 500 U/mL，而国外已达10 000 U/mL左右，差距巨大，因此，提高林可霉素产量等问题亟需解决，以增强林可霉素国际市场竞争力[6, 10-11]。由于国内林可霉素工业发酵周期较长，发酵过程控制复杂，发酵后期易出现菌丝断裂、自溶等现象，导致林可霉素处于较低的生产水平[6]。为了防止菌体过快老化、自溶，提高发酵效价，国内外对选育优良菌株[12-15]、优化培养基配方[16-18]、过程工艺优化控制和代谢流程调控等[19-22]进行了研究。研究发现，培养基的组成对林肯链霉菌的菌体生长及林可霉素的生物合成有重要影响[17]。葡萄糖属于快速利用碳源，随着菌体的利用会分解为有机酸等产物，对发酵过程影响很大，还会出现葡萄糖效应等问题[23]。林可霉素发酵生产中的氮源主要有玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵等，林可霉素对氮源的利用，一部分是直接利用其中的某些物质本身，另一部分是利用其分解之后的物质，经过降解、转化之后形成可以直接利用的前体等[6, 10, 23]。
目前通过调控林可霉素四级发酵生产中三级种子罐相关参数优化林可霉素发酵工艺的研究较少，本文通过考察三级种子罐培养基中碳源(葡萄糖和淀粉)的浓度、主要氮源(玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵)的浓度、三级种子罐接种量和三级种子移种菌龄对林可霉素发酵效价的影响，调控发酵生产过程，以期能提高林可霉素的发酵效价和产量。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)，菌株编号：Js1918-37F3，由天方药业有限公司提供。
1.1.2 培养基二级种子罐培养基(g/L)：淀粉9.7，黄豆饼粉14.3，葡萄糖38.0，玉米浆13.3，(NH4)2SO4 4.0，NaNO3 6.3，KH2PO4 0.3，CaCO3 7.5，NaCl 7.1，NaOH 1.0，NH4NO3 4.0，泡敌0.4 mL，有机硅消泡剂0.6 mL，pH为7.0。
三级种子罐培养基(g/L)：淀粉5.0，黄豆饼粉13.5，葡萄糖63.0，玉米浆15.0，(NH4)2SO4 4.5，NaNO3 5.0，KH2PO4 0.3，CaCO3 8.0，NaCl 8.8，NaOH 1.0，NH4NO3 4.5，泡敌0.4 mL，有机硅消泡剂0.3 mL，pH为7.0。
斜面培养基、液体培养基、一级种子罐培养基、四级发酵罐培养基、稀料培养基和液化糖等，参照参考文献[3]配制。
1.1.3 主要试剂和仪器葡萄糖，河南飞天农业开发股份有限公司；玉米浆，河南鑫洋实业有限责任公司；淀粉，河南巨龙生物工程股份有限公司；黄豆饼粉，河南西洋生物技术有限公司；硫酸铵，西陇科学股份有限公司。
酸度计，北京哈纳仪器厂；中型压力灭菌器，山东新华医疗器械厂；台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；一级种子罐(基础体积1.5 m3）、二级种子罐(基础体积20 m3)、三级种子罐(基础体积70 m3)和四级(基础体积100 m3)发酵罐，武汉同创工程设备有限公司；显微镜，南京庚辰科学仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 林可霉素发酵工艺流程[3](1) 林可霉素的发酵工艺为四级发酵，其工艺流程如下：
种子斜面→种子瓶→一级种子罐→二级种子罐→三级种子罐→四级发酵罐。
(2) 林可霉素发酵工艺要点：
种子摇瓶培养：挖取斜面培养基上1 cm2左右的菌块，接种于装有100 mL种子培养基的1 000 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min培养40-50 h，接种到一级种子罐，pH为7.0-7.4。
一级、二级和三级种子罐及四级发酵罐的操作要点见表 1。
| 发酵罐种类 Fermentation type |
接种量 Inoculation amount (%) |
培养温度 Culture temperature (℃) |
培养周期 Culture time (h) |
移种pH Transplanting pH |
| First-stage seed fermenter | 0.10 | 30 | 40-50 | 7.0-7.4 |
| Second-stage seed fermenter | 10-15 | 30 | 20-50 | 7.0-7.4 |
| Third-stage seed fermenter | 15-30 | 30 | 45-70 | 7.0-7.4 |
| Fourth-stage fermenter | 30-50 | 30 | 150-180 |
实际生产中，一级种子罐培养基灭菌后体积约1 m3，接种后体积约1 m3；二级种子罐培养基灭菌后体积约9 m3，接种后体积约10 m3；三级种子罐培养基灭菌后体积约40 m3，接种后体积约50 m3；四级发酵罐培养基灭菌后体积约20 m3，接种后体积约50 m3，通常一个三级种子罐移种时种子量约为60 m3，均分给两个四级罐各30 m3。
四级发酵罐补料：30 h后每8 h补一次，每次1-3 m3；补糖：接种后至放罐，整个发酵体系中还原糖控制在0.2%-1.8%，pH值控制在6.4-7.0。
1.2.2 培养方法(1) 三级种子罐培养基中碳源的优化
三级种子罐培养基中的葡萄糖和淀粉是林可霉素发酵的主要碳源，对二者进行组合优化，以得到培养基中较优的碳源浓度。通过比较葡萄糖浓度分别为62.0、63.0、64.0和65.0 g/L及淀粉浓度分别为4.0、5.0、6.0和7.0 g/L得到不同葡萄糖和淀粉浓度组合形成的三级种子罐培养基对四级发酵效价的影响，其中以原三级种子罐培养基为对照，确定三级种子罐培养基中碳源的最佳浓度。
(2) 三级种子罐培养基中氮源的优化
利用正交试验优化三级种子罐培养基中主要氮源(玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵)，采用3因素3水平(表 2)正交试验表L9(33)设计实验组。通过比较三级种子罐培养基中氮源不同浓度组合对四级发酵效价的影响，以原三级种子罐培养基为对照，确定三级种子罐培养基中氮源的最佳浓度。
| 水平Level | 因素 Factor |
||
| A玉米浆 Corn pulp (g/L) |
B黄豆饼粉 Soybean meal (g/L) |
C硫酸铵 Ammonium sulfate (g/L) |
|
| 1 | 14.0 | 12.5 | 3.5 |
| 2 | 15.0 | 13.5 | 4.5 |
| 3 | 16.0 | 14.5 | 5.5 |
(3) 三级种子罐接种量的确定
根据林可霉素发酵工艺要求及其二级种子罐的实际可能供种量，采用管道压差法对三级种子罐接种，考察15% (培养基灭菌后体积约42.5 m3，接种后体积约50 m3)、20% (培养基灭菌后体积约40 m3，接种后体积约50 m3)、25% (培养基灭菌后体积约37.5 m3，接种后体积约50 m3)和30% (培养基灭菌后体积约35 m3，接种后体积约50 m3)接种量对三级种子罐菌浓及四级发酵效价的影响，以生产常用接种量20%为对照，确定三级种子罐的接种量。
(4) 三级种子移种菌龄的确定
种子质量的好坏在很大程度上会决定发酵效价的高低，考察三级种子移种菌龄分别为40、50、60和70 h时对四级发酵效价的影响，以生产常用移种菌龄50 h为对照，其中，培养基灭菌后体积约37.5 m3，接种后体积约50 m3。确定三级种子的最佳移种菌龄。
1.2.3 测定方法(1) 菌体浓度的测定[3]
取10 mL发酵液倒入10 mL离心试管中，2 500 r/min离心5 min，取上清液的体积，记作A，计算菌体的湿菌浓度(简称菌浓)，本研究用菌浓表示菌体的生长量，菌浓计算公式如下：
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(2) 发酵液效价的测定
发酵液效价的测定采用管碟法[23]。用微生物法测定林可霉素的生物活性单位，用U表示，林可霉素中所含的抗菌活性部分的质量与生物活性单位的关系为1 μg相当于1 U，即林可霉素发酵单位的测定，μg/mL为U/mL，本研究中林可霉素的效价单位采用U/mL。
2 结果与讨论 2.1 三级种子罐培养基中碳源的优化考察了三级种子罐培养基中碳源(葡萄糖和淀粉)对四级发酵效价的影响，以效价作为评价指标，结果如表 3和表 4所示。
| 葡萄糖Glucose (g/L) | 淀粉Starch (g/L) | |||
| 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | |
| 62.0 | 7 007 | 7 037 | 7 100 | 7 090 |
| 63.0 | 7 098 | 7 156 | 7 183 | 7 134 |
| 64.0 | 7 198 | 7 378 | 7 207 | 7 195 |
| 65.0 | 7 067 | 7 300 | 7 197 | 7 117 |
| 方差来源 Source of variance |
离均差平方和 SS |
自由度 DF |
均方 MS |
F值 F value |
P值 P value |
F临界值 F crit-value |
| Glucose | 70 804.50 | 3 | 23 601.50 | 7.00 | 0.01 | 3.86 |
| Starch | 34 245.50 | 3 | 11 415.17 | 3.39 | 0.07 | 3.86 |
| Error | 30 346 | 9 | 3 371.78 | |||
| Sum total | 135 396 | 15 |
从表 3可以看出：三级种子罐培养基中同一葡萄糖浓度条件下，四级发酵效价随着淀粉浓度的增大先提高后下降，但是变化幅度很小；而同一淀粉浓度条件下，四级发酵效价均随着葡萄糖浓度的增大先明显提高而后下降。最优组合方案是：葡萄糖和淀粉的浓度分别为64.0 g/L和5.0 g/L，此条件下，四级发酵效价最高为7 378 U/mL，比对照组的效价(7 156 U/mL)提高了222 U/mL。
如表 4所示，运用Excel双因素方差分析，当α=0.05时，葡萄糖对四级发酵效价的影响极为显著。葡萄糖作为速效碳源，为三级种子罐中的菌体生长提供了足够的碳源，为四级发酵罐提供了足够的种子力，但是葡萄糖浓度过高反而不利于发酵效价的提高，可能是产生了葡萄糖效应所致；淀粉作为迟效碳源，为菌体生长提供了一定碳源，但当培养体系中葡萄糖的可获得性不足时，淀粉并不能为菌体生长提供足够的碳源，因而其对四级发酵效价的影响并不明显。
2.2 三级种子罐培养基中主要氮源的优化采用正交试验考察了三级种子罐培养基中主要氮源(玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵)对四级发酵效价的影响，以效价作为评价指标，结果如表 5所示。
| 实验编号 Experiment No. |
A玉米浆 Corn pulp (g/L) |
B黄豆饼粉 Soybean meal (g/L) |
C硫酸铵 Ammonium sulfate (g/L) |
效价 Titer (U/mL) |
| 1 | 14.0 | 12.5 | 3.5 | 7 277 |
| 2 | 14.0 | 13.5 | 4.5 | 7 304 |
| 3 | 14.0 | 14.5 | 5.5 | 7 186 |
| 4 | 15.0 | 12.5 | 4.5 | 7 339 |
| 5 | 15.0 | 13.5 | 5.5 | 7 417 |
| 6 | 15.0 | 14.5 | 3.5 | 7 511 |
| 7 | 16.0 | 12.5 | 5.5 | 7 325 |
| 8 | 16.0 | 13.5 | 3.5 | 7 363 |
| 9 | 16.0 | 14.5 | 4.5 | 7 421 |
| K1 | 21 767 | 21 941 | 22 209 | |
| K2 | 22 267 | 22 084 | 22 064 | |
| K3 | 22 109 | 22 118 | 21 928 | |
| K1' | 7 256 | 7 314 | 7 403 | |
| K2' | 7 422 | 7 361 | 7 355 | |
| K3' | 7 370 | 7 373 | 7 309 | |
| R | 167 | 59 | 94 |
由表 5可知，采用极差分析法发现，三级种子罐培养基主要氮源对四级发酵效价的影响为玉米浆 > 硫酸铵 > 黄豆饼粉，最佳组合方案为A2B3C1，即实验6，此组合中玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵浓度分别为15.0、14.5和3.5 g/L，在此条件下四级发酵效价为7 511 U/mL，比对照的效价(7 370 U/mL)提高了141 U/mL。3种氮源中玉米浆对四级发酵效价的影响最显著，表明玉米浆是一种很容易被林肯链霉菌利用的氮源[24]；铵离子能够调节林肯链霉菌的生长和林可霉素的合成，合适浓度的铵离子更有助于林可霉素发酵的进行；黄豆饼粉为较难分解消化的迟效氮源，调整其在三级种子罐培养基中的浓度对四级发酵效价的影响不显著。
2.3 三级种子罐接种量的确定考察了三级种子罐接种量对三级种子罐菌浓及对四级发酵效价的影响，结果如图 2所示。
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| 图 2 接种量对林可霉素发酵的影响 Figure 2 Influence of inoculation amount on lincomycin fermentation 注：A：接种量对三级种子罐菌浓的影响；B：接种量对四级发酵效价的影响. Note: A: Influence of inoculation amount on concentration of cells of third-stage seed fermenter; B: Influence of inoculation amount on titer of fourth-stage fermenter. |
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由图 2A可知，三级种子罐菌浓的整体趋势均是随着发酵周期的延长而增加，且随着接种量的增加而增加(接种量30%后期除外)，在52 h左右达到平稳，其中接种量为25%时的菌浓最高达50%，比对照(接种量20%)高了9%，而接种量为15%和30%时的菌浓分别比对照降低和提高了5%和4%；由图 2B可知，四级发酵效价随着三级种子罐接种量的增加先提高后下降，接种量为25%时的效价最高达7 705 U/mL，比对照(7 503 U/mL)提高了202 U/mL，而接种量为15%和30%时的效价均低于对照。可见，接种量增加会加快菌体生长，但是接种量过大也可能导致菌丝过早成熟、断裂、菌浓下降，进而影响四级发酵效价。三级种子罐合适的接种量，不仅可以提高三级种子发酵液的菌浓，为四级发酵提供足够的种子力，还可以提高种子质量、缩短菌种适应期、提高四级发酵效价，因此，三级种子罐接种量为25%时最佳。
2.4 三级种子移种菌龄的确定考察三级种子移种菌龄对四级发酵效价的影响，结果如图 3所示。
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| 图 3 移种菌龄对林可霉素发酵效价的影响 Figure 3 Influence of transplanting ages on fermentation titer of lincomycin |
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由图 3可知，四级发酵效价随着三级种子移种菌龄的增加先提高后下降，移种菌龄为60 h时的效价最高达7 883 U/mL，比对照(50 h时效价7 700 U/mL)提高了183 U/mL，而移种菌龄为40 h和70 h时的效价均低于对照。可见，随着移种菌龄的增加菌丝质量会越好(粗壮、伸展)，但是菌龄过大时部分菌丝断裂也会影响种子质量。合适的三级种子移种菌龄不仅可以为四级发酵提供高质量的种子，还可以缩短菌种适应期，进而提高四级发酵效价，因此，三级种子移种菌龄为60 h时最佳。
3 结论在林可霉素发酵工艺的基础上，通过对生产中三级种子罐相关参数进行调控，得到了优化的发酵工艺，即三级种子罐培养基中的碳源-葡萄糖和淀粉分别为64.0 g/L和5.0 g/L，主要的氮源-玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵浓度分别为15.0、14.5和3.5 g/L，三级种子罐接种量为25%及三级种子移种菌龄为60 h，在此优化条件下，林可霉素四级发酵效价高达7 883 U/mL，比优化前发酵效价提高了10%。
研究结果表明培养基配方及种子质量对林可霉素发酵效价有显著影响，通过对相关参数的调控可以优化林可霉素发酵工艺，进而提高发酵效价，为工厂带来一定的经济效益。本研究为调控林可霉素发酵生产过程其他各级罐相关参数奠定了实验基础，为林可霉素发酵工艺优化提供了新思路。
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