2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 王小兵, 钱娜, 汪晓丽, 成立, 张正杨, 钱海明, 王海潮
- WANG Xiao-Bing, QIAN Na, WANG Xiao-Li, CHENG Li, ZHANG Zheng-Yang, QIAN Hai-Ming, WANG Hai-Chao
- 抗病促生复合芽孢杆菌水分散粒剂的研制与应用
- Preparation and application of compound Bacillus sp. water dispersible granules with disease resistance and growth promoting activity
- 微生物学通报, 2020, 47(12): 4349-4358
- Microbiology China, 2020, 47(12): 4349-4358
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200148
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文章历史
- 收稿日期: 2020-02-25
- 接受日期: 2020-06-06
- 网络首发日期: 2020-06-29
2. 江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心 江苏 南京 210095;
3. 镇江贝斯特有机活性肥料有限公司 江苏 镇江 212400;
4. 江西省烟草公司 江西 南昌 330025;
5. 苏州傲龙环保科技有限公司 江苏 苏州 215159
2. Jiangsu Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing, Jiangsu 210095, China;
3. Zhenjiang Beisite Organic Active Fertilizer Company Limited, Zhenjiang, Jiangsu 212400, China;
4. Jiangxi Tobacco Company, Nanchang, Jiangxi 330025, China;
5. Suzhou Aolong Environmental Protection Science and Technology Company Limited, Suzhou, Jiangsu 215159, China
我国是设施农业大国，农户为追求较高的经济收益，普遍依赖大肥大水提高作物产量，导致设施土壤次生盐渍化及土传病害发生严重[1]。近年来，对根际微生物的研究范围越来越广泛，对根际微生物与植物的相互作用机制研究越来越深入，根际微生物不仅能够促进植物养分的吸收，而且可以提高作物的产量[2-3]。李秀明[4]用生防木霉菌T4和枯草芽孢杆菌B99-2研制出一种生物药剂，可以有效防治葡萄灰霉病；孙中华[5]利用木霉菌Tr8和枯草芽孢杆菌B67研制出一种复配水分散粒剂，可以有效防治黄瓜枯萎病。王小兵等从江苏省沿海滩涂植物根际土壤中筛选到一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) SC-12菌株，其16S rRNA基因序列在NCBI的登录号为KF012032，其ACC脱氨酶比活力达0.087 U/mg，并具有较强的产铁载体能力，菌株SC-12在100 mmol/L和200 mmol/L硝酸盐胁迫条件下，能显著提高辣椒、番茄发芽率[6]；另外，王小兵等从花生青枯发病区健康花生植株体内获得一株抗病效果较好的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) BZ6-1菌株，其16S rRNA基因序列在NCBI的登录号为JF693628，该菌对花生青枯病原菌等细菌性病害和水稻纹枯病菌、稻瘟病菌等真菌性病害均有较强的抑制作用，具有较广的抗菌谱[7]。
传统生物菌剂剂型主要是乳油、可湿性粉剂和粉剂，含有苯类有机溶剂及粉尘，会对环境造成污染，而且田间试验性状表现极不稳定[8]；随着现代社会对环保越来越重视，传统生物菌剂剂型对环境都存在不容忽视的缺陷[9]。水分散粒剂(water dispersible granule)是一种环保新剂型，由药剂原药、分散剂、润湿剂、粘结剂、崩解剂以及载体加工造粒而成，外观为颗粒状，使用时投入水中迅速崩解分散，形成高悬浮体系[10]，以其高分散性、高有效性、高稳定性、环境友好性、附加值高、市场潜力大等优点，被认为是21世纪最具发展前景的剂型之一[11]。
基于水分散粒剂生产成本较低、使用方便、储存时间长和稳定性高等优点[12]，本研究以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) SC-12和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) BZ6-1为研究对象，筛选复合芽孢杆菌水分散粒剂最佳载体和助剂，优化造粒条件，以期研制成耐盐促生和生防抗病双重效果的复合水分散粒剂，为复合水分散粒剂的产业化生产提供技术基础。
1 材料与方法 1.1 材料短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) SC-12和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) BZ6-1混合发酵液(含量1.2×108 CFU/mL，短小芽孢杆菌SC-12和解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌落数比值约为0.95)；载体：滑石粉(talcum powder，TP)，碳酸钙(calcarea carbonic，CC)，硅藻土(diatomite，DT)，生物炭(biochar，BC)；湿润剂：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS)、皂角粉(fructusgleditsiaesinensis，FD)；分散剂：木质素磺酸钠(converted ligninsulfonates，CLF)、羟甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose，CMC)和三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，STPP)；崩解剂：氯化钙(calcium chloride，CaCl2)、硫酸铵[ammonia sulfate，(NH4)2SO4]和氯化钠(sodium chloride，NaCl)；粘结剂：聚乙烯醇(polyvinyl，PV)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PG)和可溶性淀粉(starch，ST)；所有载体和助剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：氯化钠10.0，酵母膏5.0，蛋白胨10.0，pH 7.2。
气流粉碎机，山东埃尔派粉体科技股份有限公司；旋转式挤压造粒机，江苏张家港市开创机械制造有限公司。
1.2 方法 1.2.1 复合芽孢杆菌水分散粒剂工艺流程在转速为132 r/min，发酵温度为30 ℃的混合培养条件下，将混合培养的Bacillus amyloliquefaciens BZ6-1和Bacillus pumilus SC-12菌液10 000 r/min离心10 min，40 ℃干燥后制成菌粉，在载体和湿润剂、分散剂、崩解剂、粘结剂等助剂充分混合粉碎后，利用气流粉碎机进行超微粉碎，并与1%的菌粉混合均匀后加水捏合、挤压造粒，40 ℃烘干后筛分获得产品[13]。
1.2.2 复合芽孢杆菌水分散粒剂载体、助剂生物相容性的测定按5% (质量体积比)载体和助剂与牛肉膏蛋白胨培养基混合均匀制成液体培养基，将复合芽孢杆菌接种到液体培养基内，30 ℃培养1 d后，将培养的菌液稀释后均匀地涂在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，记录不同处理下的菌落数，其中以不含载体和助剂成分的培养基为对照。
1.2.3 复合芽孢杆菌水分散粒剂助剂用量的优化按2%、4%、6%、8% (质量体积比)润湿剂与菌粉混合，载体补足100%，加水造粒后40 ℃干燥1 h制成样品，根据润湿时间国家标准(GB/T5451-2001)筛选适合的润湿剂用量[14]。
按4%、5%、6%、7% (质量体积比)分散剂与湿润剂、菌粉混合，载体补足100%，加水造粒后40 ℃干燥1 h制成样品，根据悬浮率国家标准(GB/T14825-2006)[15]筛选适合的分散剂。
采用刻度量筒试验法[16]，按2%、3%、4%、5% (质量体积比)崩解剂与湿润剂、分散剂、菌粉混合，载体补足100%，加水造粒后40 ℃干燥1 h制成样品，根据样品颗粒的崩解时间确定最适崩解剂。
按3%、4%、5%、6% (质量体积比)粘结剂与湿润剂、分散剂、崩解剂、菌粉混合，载体补足100%，加水造粒后40 ℃干燥1 h制成样品，根据测得样品颗粒的崩解时间、颗粒强度确定最适粘结剂。
1.2.4 复合芽孢杆菌水分散粒剂挤压造粒条件的优化按0.8、1.0、1.2 mm筛孔粒径和30、40、50 ℃烘干温度以及15、30、45、60 min烘干时间进行优化，每处理3次重复。采用平板计数法计算芽孢杆菌菌落数。
1.2.5 复合芽孢杆菌水分散粒剂质量检测复合芽孢杆菌水分散粒剂悬浮率测定按照GB/T14825-2006[15]进行，pH值测定按照GB/T1601-1993[17]进行检测，水分测定按照GB/T1600-2001[10]进行检测，润湿时间按照GB/T5451-2001[14]进行检测。
1.2.6 复合芽孢杆菌水分散粒剂贮藏稳定性测定分别取制成的复合水分散粒剂在4 ℃和25 ℃条件下贮存，每隔一个月测定样品中的含菌量，测定时长为12个月，评估复合芽孢杆菌水分散粒剂的贮藏稳定性。
1.2.7 复合芽孢杆菌水分散粒剂对辣椒抗病促生的田间试验试验于2019年3-8月在江苏省扬州高邮丰盛果蔬土地股份专业合作社设施大棚内进行。供试土壤pH 7.1，全氮1.9 g/kg，有机质32.0 g/kg。采用随机区组设计，钙镁磷肥900 kg/hm2、硫酸钾
360 kg/hm2做基肥，实验分以下4个处理：处理1为CK；处理2为复合水分散粒剂1.5 kg/hm2 (CB15)；处理3为复合水分散粒剂3.0 kg/hm2 (CB30)；处理4为复合水分散粒剂6.0 kg/hm2 (CB60)。每处理3个重复，一共12个小区，小区间设保护行，每个小区面积为15 m2。复合芽孢杆菌水分散粒剂施用方式为100倍液稀释后在定植后和盛果期各灌溉一次，收获期记录每个小区辣椒产量，并测定辣椒维生素C、蛋白质和可溶性糖含量等品质相关指标。维生素C含量采用2, 6-二氯酚靛酚滴定法，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，可溶性糖含量测定采用分光光度法[18]。辣椒青枯病发病率和防病效果参照邱敬萍等[19]测定方法。
1.2.8 数据处理采用Excel 2010进行数据整理，采用Origin 8.5进行数据作图，采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并结合邓肯法(Duncan)进行不同处理的差异显著性检验，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 复合芽孢杆菌水分散粒剂载体的筛选复合芽孢杆菌水分散粒剂载体的筛选见图 1，含有载体的复合芽孢杆菌菌落数均略低于对照，表明载体对芽孢杆菌生长均产生一定的影响。不同载体之间的比较发现，硅藻土与两种芽孢杆菌相容性较好，总菌落数为0.86×107 CFU/mL，其次是生物碳、滑石粉，相容性最小的载体是碳酸钙；当硅藻土为载体时，两种芽孢杆菌菌落数比值为0.87，其次是生物碳、碳酸钙，最小的是滑石粉。综合考虑，最适载体为硅藻土。
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| 图 1 不同载体对两种芽孢杆菌菌落数和比例的影响 Figure 1 Effect of carriers on the number and ratio of two strains of Bacillus 注：CK：对照；TP：滑石粉；DT：硅藻土；CC：碳酸钙；BC：生物碳.不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05). Note: CK: Control; TP: Talcum powder; DT: Diatomite; CC: Calcarea carbonic; BC: Biochar. Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. |
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复合芽孢杆菌水分散粒剂助剂的筛选结果如图 2所示，助剂对芽孢杆菌的生长均有一定影响，均降低了芽孢杆菌的数量。不同助剂之间的比较发现，如图 2A所示，当湿润剂是十二烷基硫酸钠时，两种芽孢杆菌的总量最大为2.83×107 CFU/mL，此时两种菌落数之间的比值为0.82；如图 2B所示，当分散剂为羧甲基纤维素钠时，两种芽孢杆菌的总量最大为2.25×107 CFU/mL，此时两种芽孢杆菌菌落数比值为0.84；如图 2C所示，当崩解剂是硫酸铵时，两种芽孢杆菌的总量最大为2.51×107 CFU/mL，此时两种芽孢杆菌的比值为0.82；如图 2D所示，当粘结剂是聚乙二醇时，两种芽孢杆菌的总量最大为0.93×107 CFU/mL，此时两种芽孢杆菌的比值为0.79。
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| 图 2 不同助剂对两种芽孢杆菌菌落数和比例的影响 Figure 2 Effect of additives on the number and ratio of two strains of Bacillus 注：SDS：十二烷基硫酸钠；SDBS：十二烷基苯磺酸钠；FD：皂角粉；CMC：羧甲基纤维素钠；CLF：木质素磺酸钠；STPP：三聚磷酸钠；ST：可溶性淀粉；PG：聚乙二醇；PV：聚乙烯醇.不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05). Note: SDS: Sodium dodecyl sulfate; SDBS: Sodium dodecyl benzene sulfonate; FD: Fructusgle ditsiaesinensis; CMC: carboxymethylcellulose; CLF: Converted ligninsulfonates; STPP: Sodium tripolyphosphate; ST: Starch; PG: Polyethylene glycol; PV: Polyvinyl. Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. |
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复合芽孢杆菌水分散粒剂助剂用量筛选见表 1，湿润时间随着十二烷基硫酸钠含量的增加而减少，4%、6%和8%十二烷基硫酸钠的湿润时间差异不显著。从生产成本考虑，湿润剂选用4%十二烷基硫酸钠；分散剂羧甲基纤维素钠当含量为6%时，悬浮率显著高于其他含量，而且不同含量羧甲基纤维素钠湿润时间差异不显著，因此分散剂选用6%羧甲基纤维素钠；崩解剂硫酸铵崩解时间随着用量增加而减少，4%和5%硫酸铵崩解时间差异不显著，因此崩解剂选用4%硫酸铵；粘结剂聚乙二醇当含量为4%时，崩解时间最短而且差异显著，颗粒硬度适中，因此粘结剂选用4%聚乙二醇。
| 湿润剂 Wetting agent (%) |
湿润时间 Wetting time (s) |
分散剂 Dispersants (%) |
湿润时间 Wetting time (s) |
悬浮率 Suspensibility (%) |
崩解剂 Disintegration agent (%) |
崩解时间 Disintegration time (s) |
粘结剂 Binder (%) |
崩解时间 Disintegration time (s) |
颗粒硬度 Hardness of particles |
| 2 | 37.7±0.7a | 4 | 18.9±0.1a | 64.3±0.7d | 2 | 155.3±1.7a | 3 | 89.3±0.8b | 偏软 Soft |
| 4 | 21.5±1.0b | 5 | 19.2±0.2a | 72.1±0.8c | 3 | 101.8±1.1b | 4 | 86.8±0.8c | 适中 Moderate |
| 6 | 19.7±0.3bc | 6 | 19.1±0.2a | 86.2±1.0a | 4 | 89.7±0.8c | 5 | 94.7±1.3a | 偏硬 A little hard |
| 8 | 18.6±0.5bc | 7 | 18.3±0.1a | 75.5±0.5b | 5 | 87.2±0.3c | 6 | 93.2±1.3a | 硬 Hard |
| 注：湿润剂为十二烷基硫酸钠；分散剂为羧甲基纤维素钠；崩解剂为硫酸铵；粘结剂为聚乙二醇.不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05).
Note：Wetting agent: Sodium dodecyl benzene sulfonate; Dispersants: Carboxymethylcellulose; Disintegration agent: Ammonia sulfate; Binder: Polyethylene glycol. Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. | |||||||||
复合芽孢杆菌水分散粒剂造粒工艺优化见表 2，进行单因子优化可知当筛孔粒径为0.8 mm时，芽孢杆菌菌落数最多，达到2.36×108 CFU/g；烘干温度为40 ℃时，芽孢杆菌菌落数最多，达到2.31×108 CFU/g，与其他处理差异显著；烘干时间为45 min时，芽孢杆菌菌落数最多，达到2.46×108 CFU/g，与其他处理差异显著。验证试验表明在筛孔粒径0.8 mm、烘干温度40 ℃、烘干时间45 min条件下，芽孢杆菌菌落数含量达到2.52×108 CFU/g。
| 条件因子Factors | 处理Treatments | 芽孢杆菌落数(×108 CFU/g) |
| 筛孔粒径 | 0.8 | 2.36±0.15a |
| Sieve diameter | 1.0 | 2.01±0.12a |
| (mm) | 1.2 | 1.97±0.16a |
| 烘干温度 | 30 | 1.26±0.04b |
| Drying temperature | 40 | 2.31±0.07a |
| (℃) | 50 | 1.04±0.08b |
| 烘干时间 Drying time (min) |
15 | 1.76±0.13c |
| 30 | 2.18±0.11b | |
| 45 | 2.46±0.13a | |
| 60 | 1.64±0.16c | |
| 注：不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05). Note: Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. | ||
研制出的复合芽孢杆菌水分散粒剂含菌量为2.52×108 CFU/g，其中，解淀粉芽孢杆菌BZ6-1含菌量为1.37×108 CFU/g，短小芽孢杆菌SC-12含菌量为1.15×108 CFU/g，pH 6.8，水分含量为4.5%，悬浮率为79.3%，湿润时间为19.6 s，崩解时间为86.4 s，颗粒强度强，各项指标均符合生物农药国家标准[14]。
2.5.2 水分散粒剂的贮藏稳定性测定芽孢杆菌水分散粒剂的贮藏稳定性如图 3所示，在室温下水分散粒剂储藏12个月，芽孢杆菌存活率为66.67%；而在4 ℃条件下，芽孢杆菌存活率为69.44%，两种储藏方式对芽孢杆菌存活率的影响差异不显著。表明复合芽孢杆菌水分散粒剂在常温下长时间储存也可以保持较高的存活率和稳定性。
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| 图 3 不同储藏方式对复合芽孢杆菌水分散粒剂菌落数的影响 Figure 3 Effect of different storage on the number of two strains of Bacillus in compound Bacillus sp. water dispersible granules 注：不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05). Note:Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. |
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复合芽孢杆菌水分散粒剂对辣椒品质和产量的影响见表 3。复合芽孢杆菌水分散粒剂处理的辣椒产量均显著高于对照。施用复合芽孢杆菌水分散粒剂均显著提高了辣椒果实维生素C、可溶性糖和蛋白质含量。各处理间比较发现，维生素C含量差异显著，而蛋白质和可溶性糖各处理间差异不明显。
| 处理 Treatments |
产量 Yield (kg/hm2) |
维生素C Vitamin C (mg/kg) |
蛋白质 Protein (g/kg) |
可溶性糖 Soluble sugar (%) |
| CK | 3 137.29±29.52c | 71.25±0.88d | 1.22±0.01c | 2.82±0.02c |
| CB15 | 3 368.28±10.67b | 82.52±0.13c | 2.29±0.06ab | 3.74±0.03a |
| CB30 | 3 576.64±57.56a | 90.38±0.64b | 2.45±0.08ab | 3.91±0.06a |
| CB60 | 3 647.37±73.51a | 106.25±0.78a | 2.81±0.05a | 4.25±0.05a |
| 注：不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05).
Note：Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. | ||||
由表 4可知，试验结果表明施用复合芽孢杆菌水分散粒剂对辣椒青枯病的防治均有较好的效果，CB15、CB30和CB60的防治效果分别是42.0%、63.0%和63.1%，CB30和CB60防治效果相当。
| 处理 Treatments |
发病率 Incidence rate (%) |
防治效果 Control effect (%) |
| CK | 63.3±2.64a | - |
| CB15 | 36.7±5.00b | 42.0 |
| CB30 | 16.7±1.88c | 73.6 |
| CB60 | 13.3±3.50c | 78.9 |
| 注：-：没有抑菌效果；不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05).
Note: -: No inhibitory effect; Different lowercase letters meant significantly difference between treatments at 0.05 level. | ||
由于生物制剂多为活菌制剂，本实验通过生物相容性研制的水分散粒剂能够有效克服传统水剂和可湿性粉剂存在的储存时间短和粉尘飞散等缺点，同时具有高分散性、高稳定性、环境友好性等优势，在生产上有广泛的应用前景[20]；载体是水分散粒剂必不可少的成分，载体可以将菌株、助剂均匀地分布在载体的粒子表面，使其稀释成为均匀的混合物。本实验结果表明复合芽孢杆菌水分散粒剂的最佳载体为硅藻土，其应用效果优于滑石粉、碳酸钙等常用载体，这与骞天佑等[21]的报道一致。硅藻土的主要成分为SiO2，其结构呈微孔状，孔隙度较宽、孔洞排列整齐、吸收性好、比表面积大、耐磨、热稳定好，附着力强，对微生物有保护作用，是生产微生物菌剂常用的载体之一[22-23]。
水分散粒剂的贮存稳定性直接影响其产品质量与应用效果。选择合适助剂可以提高微生物菌剂的贮存稳定性[24]。王建方[17]在草甘膦铵盐水分散性粒剂研制过程中筛选出最佳湿润剂是3%十二烷基硫酸钠；孙中华[5]在研制复配生物农药水分散粒剂时筛选的最佳分散剂是5%的羧甲基纤维素钠；杨波[25]在天维菌素生物活性研究及水分散粒剂研制过程中筛选出最佳的崩解剂是4.5%硫酸铵；潘森林[26]在75%烟嘧磺隆水分散粒剂的研制过程中筛选出最佳粘结剂为2%聚乙二醇。本研究表明复合芽孢杆菌水分散粒剂在润湿剂为4%十二烷基硫酸钠、分散剂为6%羧甲基纤维素钠、崩解剂为4%硫酸铵、粘结剂为4%聚乙烯醇条件下含菌量为2.52×108 CFU/g。
本试验研制的复合芽孢杆菌水分散粒剂由两种芽孢杆菌复配而成，克服了单一生物防治菌株依赖环境性强、适应性差、需菌量大和防治效果偏低等问题。同时，复合芽孢杆菌水分散粒剂结合各菌株作用机理的协同作用能更好地防治辣椒土传病害[27-28]，提高辣椒产量和品质，效果均优于单一型水分散粒剂[29-31]。本试验研究发现施用复合芽孢杆菌水分散粒剂显著提高了辣椒含量，可能是由于微生物菌剂中大量功能菌的迅速繁殖提高了土壤酶的活性，加快了土壤有机物质的分解，促进土壤中固定养分向有效养分的转化，从而提高了辣椒VC含量，这与左烨[32]研究结果一致。复合芽孢杆菌水分散粒剂施用对辣椒青枯病的防治效果发现，其剂量3.0 kg/hm2和6.0 kg/hm2的防治效果显著优于1.5 kg/hm2，而3.0 kg/hm2和6.0 kg/hm2效果相当，推荐复合芽孢杆菌水分散粒剂最适用量为3.0 kg/hm2。
4 结论复合芽孢杆菌水分散粒剂的最佳配方是：润湿剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为羧甲基纤维素钠，崩解剂为硫酸铵，粘结剂为聚乙二醇，含量分别为4%、6%、4%、4%，载体为硅藻土82%。最佳造粒条件为筛孔粒径0.8 mm，烘干温度为40 ℃，烘干时间为45 min，制备的复合芽孢杆菌水分散粒剂菌落数为2.52×108 CFU/g，悬浮率79.3%，pH 6.8，水分含量为4.5%，湿润时间为19.6 s，崩解时间为86.4 s，颗粒强度适中。分散粒剂的各项指标均达到了生物农药国家标准，田间实验表明施用复合水分散粒剂能显著提高辣椒产量和品质，推荐复合芽孢杆菌水分散粒剂的最适用量为3.0 kg/hm2。
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