2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 李梦石, 邹清华
- LI Meng-Shi, ZOU Qing-Hua
- 细菌Ⅵ型分泌系统调节因素的研究进展
- Research progress in the regulatory factors of the bacteria type Ⅵ secretion system
- 微生物学通报, 2020, 47(12): 4269-4277
- Microbiology China, 2020, 47(12): 4269-4277
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200087
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文章历史
- 收稿日期: 2020-02-07
- 接受日期: 2020-04-17
- 网络首发日期: 2020-05-09
细菌的致病过程需要一系列与黏附、侵袭以及毒力蛋白分泌等相关的毒力因子的协同作用，Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)便是这些毒力因子中的一个。越来越多的研究表明T6SS在细菌致病过程中发挥了重要作用，从而使其成为近些年学术界研究的热点。T6SS是一种由膜复合物(membrane complex)、底板(baseplate)及尾管/鞘复合物(tail tube/sheath complex)三部分组成的多蛋白复合结构，其利用类似弹簧的机制将效应物分泌到原核以及真核细胞中[1]。这些效应物在病原菌对宿主细胞的黏附、侵入以及对宿主的杀伤等方面发挥了重要作用。细菌可利用T6SS分泌作用于真核细胞的效应物，也可分泌能杀伤其他细菌的效应因子，从而使自己获得生存优势而引起疾病[1]。
然而，T6SS并非在细菌生命过程中的每时每刻都发挥作用，其功能的实施需要多个蛋白进行有机的组装和分泌，这些蛋白的永久表达和分泌无疑是一种浪费，所以所有蛋白都在严密的调控下进行表达，并时刻随周围环境的变化而进行相应的改变，以便有条不紊地发挥作用[1-2]。因此，对T6SS调控因素的研究有助于更好地认识细菌的致病性，从而对其进行控制。目前对细菌T6SS的分泌调节方面所做的研究仍然有限，相关的中文综述也较少。本文对目前研究中T6SS常见的调控因素进行归纳与整理，并试图概括T6SS的调控与细菌致病性之间的关系。
1 调节T6SS的环境因素细菌往往需要通过适应不同的生存环境来实现生长。研究发现T6SS可能在细菌适应环境中发挥了一定作用，这主要体现在一些环境因素对T6SS的调节上。
1.1 温度及渗透压温度和渗透压均是常见的环境信号，研究发现细菌会在类似于其自然生存环境的条件下表达T6SS。例如鼠疫耶尔森氏菌T6SS基因簇的表达在26 ℃被诱导而在37 ℃被抑制[3]。鼠疫耶尔森氏菌在自然界是以鼠-蚤-鼠的形式循环传播的，在漫长的疫病间歇期内，鼠疫耶尔森氏菌主要以蚤类单独保存的形式存在，这种低温环境类似于蚤类体内的温度。在假结核耶尔森氏菌基因组中，相比于37 ℃，28 ℃可更有效诱导T6SS4的表达[4]，与鼠疫耶尔森氏菌的结果类似，假结核耶尔森氏菌T6SS4的表达条件类似于其环境存活条件。对水生细菌而言，常见的生存环境是20-30 ℃的河流或海洋环境。河流弧菌VflT6SS2在25 ℃及30 ℃条件下被功能性激活，而在37 ℃条件下则不具备活性[5]。对于霍乱弧菌O1菌株A1552，其T6SS效应蛋白Hcp分泌的最佳温度为23 ℃[6]。除了温度，渗透压对细菌也是一种重要的环境条件。研究发现霍乱弧菌在类似于其河口栖息地的高渗环境(255 mmol/L蔗糖或340 mmol/L NaCl)中可以分泌Hcp[7]。一些生活周期不同阶段有不同生存环境的细菌可以启动不同的T6SS以适应各种环境。副溶血弧菌具有两种T6SS系统——T6SS1及T6SS2，T6SS1在高盐度培养基及温暖(30 ℃)条件下最活跃；而T6SS2在寒冷(23 ℃)或温暖(30 ℃)及低盐(LB培养基)条件下活性最高[8]。T6SS1的活跃条件类似于夏季的海洋条件，而T6SS2的活跃条件类似于海洋动物体内环境，二者皆为副溶血弧菌的不同生存环境。本课题组对鼠伤寒沙门氏菌的T6SS研究发现，其T6SS的两个Hcp效应蛋白受温度和盐浓度的调节不同，Hcp1在23 ℃时高表达，在高盐环境中表达受抑制，而Hcp2在37 ℃时高表达，在高盐环境中不表达，这些结果提示鼠伤寒沙门氏菌T6SS可能在不同的环境中通过调节不同的效应蛋白的表达发挥不同的作用[9]。
1.2 生长时相研究发现对于一些微生物而言，T6SS的分泌具有生长时相依赖性。Ishikawa等将霍乱弧菌O1菌株A1552在LB培养基中培养，并通过免疫印迹分析细菌不同生长期Hcp的表达水平，结果发现，在OD600为1.0时检测到了Hcp的表达，在OD600为2.0时检测到了最高的Hcp水平，而无法在对数期其他时间或培养过夜后的稳定后期的上清液中检测出Hcp，究其原因是Hcp表达缺失及表达产物降解(被某些稳定期表达蛋白酶降解)共同导致[10]。Hcp仅在细菌对数生长期的某些特定时刻表达，这种现象也存在于其他一些微生物中。以河流弧菌为例，Huang等将河流弧菌85003菌株在不同的生长时刻(OD600为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.8及过夜)进行检测，结果显示，除培养过夜条件外，其他时刻均可检测到hcp基因表达，但Hcp的分泌仅可在OD600为1.0、1.5、2.0时检测到。然而培养过夜后细菌群体进入稳定期，Hcp的表达可能已经关闭或Hcp被蛋白酶水解[5]。在不同的细菌中，生长周期现象稍有不同。Sheng等发现，在鱼类溶藻弧菌生长的对数期与稳定期均可检测到hcp基因的表达，但随着培养时间的延长(2、4、8、12 h)，其表达水平明显降低[11]。然而，无论哪个时间均无法在上清液中检测到分泌出的Hcp蛋白。
1.3 抗生素研究表明，多种类别的亚抑制浓度抗生素可以充当信号分子，激活或抑制大量细菌基因的转录，例如亚抑制性甲氧苄啶诱导泰国芽孢杆菌产生100多种次级代谢产物[12]。研究发现当肺炎克雷伯氏菌HS11286菌株暴露于亚抑制浓度的β-内酰胺类抗生素(美罗培南4 mg/L或头孢他啶32 mg/L)时，其T6SS会被诱导表达，而在无抗生素的LB培养基或M9培养基培养时T6SS无活性；除此之外，用阿普霉素也可以得到相似的结果，说明β-内酰胺等抗生素可以诱导T6SS的分泌[13]。同样，亚抑制浓度的卡那霉素可以诱导铜绿假单胞菌H1-T6SS的表达，这种诱导效果在卡那霉素浓度为60 μg/mL时达到最大，但其并未促进T6SS的分泌，这种诱导需要功能性的LadS/Gac/Rsm途径[14]。可能的推测是，在抗生素存在的条件下，H1-T6SS仅仅被组装，但需要其他信号(如细胞间的接触)来激活分泌。Losada等发现，亚抑制浓度的喹诺酮类抗生素激活了类鼻疽伯克氏菌T6SS-2的表达；亚抑制浓度环丙沙星还增加了其T6SS-3、T6SS-4、T6SS-6的表达，但具体的分子机制仍有待研究[15]。综合以上报道，我们可以提出一个假设，即在有抗生素和生存竞争等环境压力存在的情况下，细菌可以通过表达T6SS来对抗环境压力，从而增强自身的生长优势，比如前文提到β-内酰胺类抗生素可诱导肺炎克雷伯菌T6SS表达，并发挥杀灭作用以获得生长优势[13]。
然而，对于抗生素的作用也存在不同的实验证据。Weber等的结果显示，对于鲍曼不动杆菌，在其感染患者(尤其是正在接受抗菌治疗的患者)期间，抑制T6SS表达或删除该基因簇对细菌生长是有利的，因为鲍曼不动杆菌不太可能在接受治疗的患者体内(高抗生素环境)遇到竞争对手，因此无需T6SS介导杀伤，此时节约更多的能量以表达抗生素抗性基因无疑是有益的[16]。相关的证据也陆续被发现，例如在一些鲍曼不动杆菌临床分离株中，T6SS基因簇被发现缺失[17]。此外，多药耐药株往往会抑制T6SS表达[18-19]，这可能是由于当细菌同时携带几个抗生素抗性基因时，表达T6SS的成本过于高昂。
1.4 离子/分子细菌需要启动不同的生存对策以应对不同的环境，而不同的环境中往往有不同的离子/分子浓度，因此，一些细菌进化出感知机制去响应环境中某种特定离子/分子浓度的变化，以启动不同的基因表达。已发现一些离子/分子会影响多种细菌T6SS的表达。
1.4.1 铁离子环境中铁离子对于T6SS的作用可以通过铁摄取调节蛋白(Fur)实现的，这是一种二聚体金属依赖性DNA结合蛋白。Fe可以通过Fur结合启动子Fur盒抑制T6SS，例如在迟钝爱德华菌中，Fur直接与T6SS基因簇中第一个基因上游的启动子结合以抑制转录，并且这种结合只能在高铁的环境中进行[20]。铜绿假单胞菌H2-T6SS与鼠伤寒沙门菌T6SS核心组分ClpV均可受此途径调节[21-22]。在肠聚集性大肠杆菌的T6SS启动子中存在两个Fur盒，Fur可与之结合降低T6SS转录。此外，该启动子区域还存在3个GATC基序(可被DNA腺嘌呤甲基化酶Dam识别并甲基化)，Fur可抑制该基序的甲基化，而该位点的甲基化可反过来抑制Fur与Fur盒的结合[23]。
1.4.2 磷酸盐磷是生物体中第六丰富的元素，磷酸盐(Pi)是其在体内存在的重要形式。已有研究表明，Pi与铜绿假单胞菌、大肠杆菌、根瘤农杆菌、霍乱弧菌等细菌的毒性、生物膜形成、定殖能力等均有关系；Pi在细菌内由Pho调节子感知与调控，而Pho调节子又可由双组分系统控制[24]。在迟钝爱德华菌中，低Pi浓度会被PhoR感知，这将导致PhoR自身磷酸化，使得PhoB被进一步磷酸化，磷酸化的PhoB暴露自身DNA结合位点与T6SS启动子Pho盒结合，促进基因的转录；而高Pi (> 4 μmol/L)环境会使Pst系统(高亲和力磷酸盐特异性转运系统)与PhoR形成抑制复合物以阻止PhoB的活化[20]。除了直接影响T6SS的转录以外，Pi水平或许还可以通过PhoB间接影响T6SS。已知在霍乱弧菌中，低水平的c-di-GMP可以促进T6SS的表达[25]，而PhoB可以影响细菌中c-di-GMP的水平，这种影响直接导致了霍乱弧菌生物被膜形成及运动性的改变[26]。
1.4.3 锌离子Zn对T6SS的影响主要通过ZntR与Zur两种途径进行。ZntR是MerR家族转录调控因子，在假结核耶尔森氏菌中，ZntR可与T6SS4启动子区域结合以促进T6SS4的表达，而T6SS4反过来也可以吸收环境中Zn以维持细菌的ROS稳态[27]。与Fur、Fur盒类似，Zur与Zur盒也在一些微生物中被发现[28-30]。Zur可与泰国芽孢杆菌T6SS4启动子前类似Fur盒的区域结合，抑制其T6SS4基因(icmF4，clpV4，hcp4)表达[31]。
2 调节T6SS的调控因子 2.1 H-NS蛋白H-NS蛋白具有N端寡聚域和C端DNA结合域[32]，既可以自体聚合，也可以与DNA相结合。H-NS蛋白通过识别高亲和力成核位点结合富含AT基序、带有弯曲的DNA序列，然后在其上进行寡聚，形成核蛋白丝，这将使DNA被压缩，或解卷为扩展的构象，从而影响转录、DNA折叠、基因组进化等[33]。H-NS主要负责约5%细菌基因组的沉默，其中许多基因与细菌毒力相关。在副溶血弧菌中，H-NS对该菌主要的毒力位点(T3SS1，Vp-PAI，T6SS2)均有直接的负向调节作用，其可以识别T6SS2基因座中的3个操纵子，每个H-NS结合位点均与靶操纵子的核心启动子区域重叠[34]。H-NS似乎还在低盐条件下抑制副溶血性弧菌的T6SS1，但并未发现H-NS介导温度依赖性T6SS1的抑制[35]。此外，H-NS介导环境因子对T6SS的影响也在肺炎克雷伯菌中被报道，已在3种肺炎克雷伯菌的T6SS基因上游检测出了H-NS结合位点，并有明确的实验证据指出H-NS与NTUH-K2044菌株T6SS成分tssD基因启动子结合并沉默了TssD[36]。来自巨噬细胞感染的证据则显示在感染早期肺炎克雷伯菌H-NS表达而T6SS表达下降[37]。除此之外，在鼠伤寒沙门氏菌中，H-NS先与SPI-6 T6SS的两个操纵子启动子的高亲和力成核位点相结合，然后从这些位点开始形成延伸的核蛋白丝，占据上游和下游广泛的DNA区域[38]。这种对T6SS的沉默模型也在爱德华菌属细菌中被发现，H-NS介导了DNA发夹环的形成并捕获RNA聚合酶，最终的结果是沉默EvpX蛋白家族成员(一种T6SS分泌蛋白家族，具有毒力、介导侵袭等作用)[39]。
2.2 双组分系统(two components system，TCS)在细菌中，周围环境变化所导致的基因表达改变经常是通过TCS的方式进行的。经典的TCS包括一个响应物理/化学变化的传感器蛋白及一个同源调节蛋白，传感器蛋白可以控制调节蛋白的磷酸化状态，而调节蛋白通常是与DNA直接结合的转录激活/抑制因子，调节蛋白磷酸化通常会增强其与DNA的亲和水平[40-41]。当细菌经历某种TCS的诱导条件时，磷酸化调节蛋白的水平会上升。TCS对T6SS的作用已经在多种细菌中被发现并描述。如鱼类病原体迟钝爱德华菌，PhoR-PhoB系统介导了环境中Pi对T6SS的调控；当环境Pi含量下降时，PhoR作为传感器蛋白被激活并被磷酸化，随即将磷酸基团传递给PhoB使其磷酸化，磷酸化的PhoB释放其原本结合的DNA区域，这使得Pho启动子得以结合DNA，促进T6SS的转录[20]。另一种爱德华菌——Edwardsiella piscicida的致病性也受TCS影响，其中EsrA-EsrB是对致病性最重要的TCS，EsrB通过结合DNA而促进T3SS及T6SS的表达[42]。对于霍乱弧菌的研究显示，其基因组共编码52种TCS的调节蛋白，其中VCA0566基因编码的VxrB蛋白磷酸化对于激活T6SS表达(包括Hcp分泌，细菌间竞争等)十分重要[43]。VxrA是VxrB上游的传感器蛋白，但控制VxrAB表达与活性的信号及其如何整合进T6SS调节网络仍有待研究。霍乱弧菌的T6SS还受ChiS传感器蛋白的影响，当ChiS感受到霍乱弧菌在几丁质表面生长的环境信号时，其可以激活TfoX而促进T6SS表达，这有利于霍乱弧菌在水生环境中的存活，但ChiS下游的调节蛋白也仍未确定[44]。在假结核耶尔森氏菌中，EnvZ-OmpR可以响应薄膜损伤及高渗透压，激活T6SS-4基因座的转录[45]。除了动物病原体，TCS也在植物病原体的T6SS中发挥作用，如VfmL-VfmH在Dickeya zeae中积极调节毒性基因，vfmH的缺失突变株的T1SS、T2SS、T3SS、T6SS表达均会下降，并且T6SS受到的影响最严重[46]。此外，对于根瘤农杆菌，环境的酸性信号可以使exoR失去对传感器蛋白ChvG的物理接触抑制，ChvG使调节蛋白ChvI磷酸化并结合T6SS启动子而促进表达，该通路导致了细菌生长及根瘤形成[47]。
2.3 RpoN及bEBPRpoN (σ54 factor)是一种细菌常用的转录调控因子，可通过结合DNA启动子区域而引导RNA聚合酶以控制转录[48]。RpoN的作用需要其同源的细菌增强子结合蛋白(bacterial enhancer-binding protein，bEBP)协助，bEBP先与启动子上游约100-150 bp的增强子结合DNA区域相互作用，然后进行自身寡聚，通过DNA弯折与RpoN直接接触作用，水解ATP供能以帮助RNA聚合酶进行DNA的解链[48-50]。在T6SS的调节方面，RpoN及bEBP对不同菌种显示出不同的调节活性。Pectobacterium atrosepticum、A. hydrophila、Marinomonas的T6SS均需要RpoN及其同源bEBP激活转录[51]。同样地，bEBP家族成员VP1391对副溶血弧菌T6SS1在海洋条件下具有活性十分重要[8]。但正如前文所述，RpoN及bEBP对T6SS的作用是双向的。以霍乱弧菌为例，在V52菌株中，hcp操纵子的表达需要RpoN及VasH (一种bEBP)，但该菌株主要T6SS基因簇的表达则不受其调控；但在经典O1株及E1 Tor O1株中，rpoN的突变导致T6SS基因簇表达的上调[52]，可以推测在这两种菌株中，RpoN对T6SS起到了负向调控作用。RpoN及bEBP的双向调控作用甚至体现在同一种细菌的不同T6SS间。铜绿假单胞菌拥有3种T6SS系统(H1-T6SS、H2-T6SS和H3-T6SS)，它们分别介导不同的生物作用。RpoN可以抑制H2-T6SS及H3-T6SS右操纵子，但却促进H3-T6SS左操纵子的表达，分别位于H2-T6SS及H3-T6SS基因位点的基因sfa2及sfa3编码推定的bEBP，在sfa2突变体中，H2-T6SS的表达上调了3.7倍，这或许是bEBP对细菌T6SS抑制方面的又一个证据[53]。
2.4 c-di-GMPc-di-GMP是在细菌机体中广泛存在的一种第二信使分子，其在细菌的生长和机体行为中发挥着重要的协调作用，其中包括细菌的运动能力、毒力、生物膜形成以及细胞周期进程等。c-di-GMP对基因表达的调控是通过与转录因子或核糖开关的结合而实现的。T6SS作为重要的细菌毒力、运动性、生物膜执行成分，已发现在多种细菌中被c-di-GMP调节[54]。在弧菌属的不同种细菌中，c-di-GMP有着类似的生理作用。霍乱弧菌tfoY基因上游存在c-di-GMP核糖开关，细菌内c-di-GMP浓度下降会诱导TfoY蛋白的合成，进而激活T6SS，此处T6SS的主要作用为调控运动性等以防卫真核捕食者[25]。这种c-di-GMP与防御反应的耦联也在副溶血弧菌中被发现，表面感应可以触发副溶血弧菌内c-di-GMP浓度下降，这将诱导TfoY以激活T6SS1，介导细菌的防御性逃逸反应[55]。在鱼类溶藻弧菌中，PppA可以诱导c-di-GMP的含量下降与Hcp1表达分泌下降[56]，但降低的Hcp1水平是否由c-di-GMP介导仍有待研究。
除弧菌科外，在铜绿假单胞菌中，较高水平的c-di-GMP会使Hcp1产量升高[21]，推测c-di-GMP是铜绿假单胞菌毒力所涉及的T3SS、T6SS的主要调控信号分子。还有研究提出，当O2存在时，OdaI通过双鸟苷酸环化酶SadC抑制c-di-GMP的合成，而在厌氧过程中，SadC则催化c-di-GMP的生成[57]。O2介导的变化可以看作是铜绿假单胞菌对不同生存环境所进行的策略转换。因为c-di-GMP可被视为铜绿假单胞菌浮游与附着生活方式间过渡的信号，高水平的c-di-GMP会促进生物膜的形成及感染，而低水平则促进浮游生活与毒力。然而，铜绿假单胞菌的双鸟苷酸环化酶SadC可以抑制根癌农杆菌C58的T6SS活性，正如同根癌农杆菌内源双鸟苷酸环化酶产生的效应，这意味着高水平c-di-GMP会抑制其T6SS，这种抑制发生在转录水平[58]。一种推测是，c-di-GMP在根癌农杆菌刚到达植物伤口准备入侵时含量升高，下调T6SS，这是一种经济措施，细菌可以用更多的资源去刺激EPS生物膜的形成，便于建立稳定的定殖。
2.5 群体感应(quorum sensing，QS)细菌的QS涉及到自我产生的可以分泌到细胞外的化学信号，这些信号会在局部环境中积累到激活特定基因转录所需的水平，常见的QS信号有高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactone，AHL)、自诱导物-2 (autoinducer-2，AI-2)、2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(pseusomonas qinolone signal，PQS)、可扩散信号分子(diffusible signaling factor，DSF)等[59]。QS对细菌的调节体现在与细菌群体相关的许多方面。AHL型QS信号调控了泰国芽孢杆菌的生命活动，其可以激活T6SS以表达一些特征性毒素、同源免疫或抗毒素基因，而这些基因的产物可以抑制敏感细胞的生长或保护芽孢杆菌自身不被毒素伤害[60]，这是一种对种内竞争及种间竞争的策略。QS对T6SS的控制在铜绿假单胞菌及弧菌属细菌中被研究得较为详细。铜绿假单胞菌拥有3个QS系统：LasI/LasR、RhlI/RhlR、PQS/PqsR (MvfR)，编码T6SS的3个基因座受QS蛋白LasR及MvfR的控制；在POA1菌株中，H2-T6SS受Las与RhlQS系统的调控[61]。对霍乱弧菌而言，较低的群体密度会使LuxQ与CqsS传感器激酶磷酸化LuxU，这将进一步导致一系列后续事件，主要包括LuxO磷酸化，Small regulatory RNA (sRNA)被激活并与σ54协调作用，HapR被抑制，最终导致的结果是T6SS表达被抑制[61-62]。在溶藻弧菌中，QS对T6SS的调控还涉及到了其两个T6SS系统的串扰。当周围细菌密度较低时，与霍乱弧菌类似，溶藻弧菌的LuxO被磷酸化以激活sRNA表达，sRNA与σ54协调作用以抑制LuxR，而LuxR的作用是抑制T6SS1的表达或促进T6SS2的表达[63]。
3 总结与展望T6SS作为细菌的武器及防御工具，其合成与表达并不是时刻都进行的，使用T6SS与否反映出一种对生存策略的选择。对于细菌而言，使用T6SS是一种代价高昂的行为，这意味着大量物质与能量的耗费，还伴随着被真核生物捕食者消灭的可能。因此在不恰当的环境中开启T6SS是一种浪费或风险。对T6SS调控的研究仍存在诸多问题与局限。例如我们仍未完全清楚整个T6SS系统的调控通路、启动或抑制T6SS的环境信号(温度、渗透压、离子等)产生影响的具体分子机制、各种信号间相互的沟通与串扰等。而且，目前已有的研究也多是针对几种重要的细菌如霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、根癌农杆菌等，对更多细菌的研究仍有待进行。此外，目前已研究的大部分调控因子均为全局性调控因子，例如H-NS蛋白、双组分系统、RpoN等，这些蛋白在细菌其他方面也发挥调控作用，如何寻找关于T6SS独特的调控因子尚是目前存在的难题。在未来的研究中，或许可以通过对T6SS调控的研究，找到相应的靶点以干扰T6SS的功能，对细菌的致病力与毒力等方面产生干扰，这有望成为新的抗细菌感染的途径。
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