2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 张玲莉, 王建峰, 魏华, 于纪棉, 费红军, 岑叶平
- ZHANG Ling-Li, WANG Jian-Feng, WEI Hua, YU Ji-Mian, FEI Hong-Jun, CEN Ye-Ping
- 铜绿假单胞菌PAO1 ku基因缺失菌株的构建及其对生物被膜耐药性的影响
- Construction of Pseudomonas aeruginosa ku gene deletion mutant and its effects on antibiotic resistance of biofilm
- 微生物学通报, 2020, 47(12): 4219-4228
- Microbiology China, 2020, 47(12): 4219-4228
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.200033
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文章历史
- 收稿日期: 2020-01-12
- 接受日期: 2020-06-22
- 网络首发日期: 2020-08-31
2. 宁波检验检疫科学技术研究院 浙江 宁波 315012
2. Ningbo Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine, Ningbo, Zhejiang 315012, China
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种临床上重要的条件致病菌，常引起严重的医院获得性感染，导致呼吸道感染、菌血症、肺炎、烧伤感染、泌尿系统感染和囊性纤维化继发感染等多种疾病。PA易形成生物被膜，这是细菌附着于惰性或活性实体表面，为了适应生存环境，繁殖、分化并分泌多糖基质包裹菌体群落而形成的细菌聚集体膜状物。成熟的生物被膜形成后，生物被膜深层的细菌被多糖蛋白复合物包围，与外界沟通机会少，处于低营养物质、低氧分压的微环境[1]。这些环境因素导致细菌生长速率减慢，产生综合广泛性的应激反应以及使多药物外排泵基因表达上调，致使生物被膜具有极强的适应性与耐药性[2-3]。
非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)途径是DNA双链损伤修复(double-strand break，DSB)的主要途径之一，修复DSB过程中无需同源模板，直接将断裂缺口连接，因此常引起基因突变。Ku蛋白作为NHEJ途径的关键组分之一，在NHEJ修复途径中，可识别并稳定DSB双链末端，保护末端不被核酸酶降解，并招募LigD连接酶进行断裂末端的修复[4-5]。NHEJ途径广泛存在于真核细胞中，但仅在包括PA在内的部分细菌种类中发现[6-10]。研究结果显示PA生物被膜内部细菌具有极高的基因突变率，而PA生物被膜耐药性的提高或获得往往与某些相关基因的突变密切相关，如外排泵MexAB-OprM及MexCD-OprJ的表达上调可分别由它们各自的调控基因mexR及nfxB突变引起[11-13]，药物靶基因gyrA、gyrB的突变可引起对喹诺酮类药物耐药性增强[14-15]等。究竟是何种机制导致PA生物被膜基因突变率增强和耐药性提高呢？本课题通过构建ku基因的缺失突变菌株及其回补株，针对Ku对PA生物被膜耐药性的作用展开研究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒及培养条件研究涉及的菌株与质粒见表 1。大肠杆菌、铜绿假单胞菌及其突变菌株在37 ℃的LB培养基中培养，MIC测定使用MH培养基。
| 材料 Materials |
基因型及相关特征 Genotype and relevant characteristics |
来源 Source |
| 菌株Strains | ||
| E. coli | ||
| DH5α λpir | F-φ80 lac ZΔM15Δ(lacZYA-arg F) LAMpirU169 endA1 recA1 hsdR17(rk–, mk+) supE44λ– thi –1 gyrA96 relA1 phoA | This Lab |
| β2163 | F–, RP4-2-Tc::Mu ΔdapA::(erm-pir) | [16] |
| Pseudomonas aeruginosa | ||
| PAO1 | Wild type | This Lab |
| Δku | PAO1, knockout of ku gene | This study |
| Δku::ku | PAO1 Δku::ku | This study |
| 质粒Plasmids | ||
| pLP12 | oriTRP4 oriVR6Kvmi480 PBAD, Cmr | [17] |
| pLP12-ku | pLP12 derivative containing homologousarms of ku gene of PAO1 | This study |
| pBAD33 | pACYC184 ori, araC ParaBAD, Cmr | [18] |
| pBAD33-ku | pBAD33 derivative containing kugene | This study |
实验所用培养基及抗生素均购自北京索莱宝科技有限公司；2, 6-二氨基庚二酸(DAP)、D-Glucose和L-阿拉伯糖，Sigma-Aldrich公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase和限制性内切酶EcoR I、Nhe I、Spe I及T4 DNA ligase，TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒、细菌基因组提纯试剂盒、细菌总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；无缝克隆试剂盒ClonExpress II，南京诺唯赞生物科技有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和SYBR Green Select Master Mix，北京全式金生物技术有限公司。96孔全自动梯度PCR扩增仪，Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司；MultiskanTM FC酶标仪，Thermo Scientific公司；引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 铜绿假单胞菌ku缺失突变株的构建铜绿假单胞菌ku缺失突变株的构建方法参照Luo等[17]方法，所用引物见表 2。根据细菌基因组提纯试剂盒使用说明提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA作为模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase，以ku-EcoR I-MF1和ku-MR1为引物扩增ku基因上游同源臂A片段(531 bp)，以ku-MF2和ku-Nhe I-MR2为引物扩增ku基因下游同源臂B片段(705 bp)。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板(150 mg/L) 1 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 1.5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ (A片段)/60 ℃ (B片段) 20 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。以经PCR产物纯化后的A、B片段为模板，以ku-EcoR I-MF3和ku-Spe I-MR3为引物，通过交叠PCR扩增获得包含A、B片段DNA序列以及EcoR I、Spe I酶切位点的融合片段。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板A片段(100 mg/L) 0.5 μL，B片段(100 mg/L) 0.5 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，7个循环；98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30个循环。融合片段纯化后通过EcoR I/Spe I双酶切，得到的片段与经过双酶切的自杀载体pLP12连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α λpir感受态细胞，通过LB培养基中添加12 mg/L盐酸四环素和0.3% D-葡萄糖双重抗性以及PCR扩增筛选获得重组质粒pLP12-ku。
| 引物 Primers |
序列 Sequences (5′→3′) |
来源出处 Source |
| ku-EcoR I-MF1 | TGACGATGAATTCCACCATTCTCAAGGCAGGTCGGG | This study |
| ku-MR1 | ATTTACCCAGCGGCTCGCCTCACGGTATATGCACCAGGCCGAAGCT | This study |
| ku-MF2 | AGCTTCGGCCTGGTGCATATACCGTGAGGCGAGCCGCTGGGTAAAT | This study |
| ku-Nhe I-MR2 | TGTCAGAGCTAGCGGCCGACCAGACGCAACAGTTC | This study |
| ku-EcoR I-MF3 | TGACGATGAATTCCAGGTCGGGAAAGCCGGGTCA | This study |
| ku-Spe I-MR3 | TAGTCGTACTAGTATGCTTGGCACGCAATTCGCG | This study |
| ku-RF | TGGGCTAGCGAATTCGAGCTAGGAGGAATTCACCATGGCGCGTGCGATC | This study |
| ku-RR | TGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCAGGCCTTGCGCCG | This study |
| pBAD-ZF | CTAGAGTCGACCTGCAGGCA | [19] |
| pBAD-ZR | AGCTCGAATTCGCTAGCCCA | [19] |
| pBAD-mcf-TF | CCATAAGATTAGCGGATCCTACCT | [19] |
| pBAD-mcf-TR | CTTCTCTCATCCGCCAAAACAG | [19] |
| ku-F | GGCTACAAGCGGGTGAACAA | This study |
| ku-R | GGCTATCGACGAAAGCGAAGA | This study |
| 16s-F | GCGCAACCCTTGTCCTTAGTT | [20] |
| 16s-R | TGTCACCGGCAGTCTCCTTAG | [20] |
| 注：下划线序列：限制性内切酶识别序列. Note: Underlined sequences: Restriction endonuclease recognition sequences. |
||
重组质粒pLP12-ku电转化至大肠杆菌β2163感受态细胞，β2163因营养缺陷需在含有DAP的培养基上才能生长，通过12 mg/L盐酸四环素和0.3 mmol/L DAP筛选获得β2163/pLP12-ku菌株。β2163/pLP12-ku菌株作为供体菌，铜绿假单胞菌PAO1作为受体菌，分别在37 ℃、150 r/min振荡培养过夜，各取培养物100 μL混合后于37 ℃、200 r/min条件下振荡培养6 h，进行接合实验。先用含盐酸四环素(30 mg/L)和0.3% D-葡萄糖的LB培养基进行初筛，待菌落长成，提取细菌基因组DNA，以ku-EcoR I-MF3/ku-Spe I-MR3为引物对扩增鉴定；然后复筛：挑取鉴定正确的单克隆菌落于含0.3% D-葡萄糖的LB液体培养基中37 ℃培养过夜，取培养液涂布于含0.4% L-阿拉伯糖的LB平板中37 ℃培养过夜，挑取平板菌落，以ku-EcoR I-MF1/ku-Nhe I-MR2为引物对进行PCR扩增检测，获得缺失突变克隆，PCR产物纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。突变株用终浓度为20%的甘油于–80 ℃保存，命名为Δku。
1.2.2 铜绿假单胞菌ku基因敲除回补株的构建以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，ku-RF/ku-RR为引物对扩增获得ku基因表达片段(936 bp)，PCR反应体系(50 μL)：DNA模板(150 mg/L) 1 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。以pBAD33为模板，pBAD-ZF/pBAD-ZR为引物对扩增获得pBAD33载体片段(5 529 bp)。PCR反应体系(50 μL)：DNA模板(200 mg/L) 1 μL，引物F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 7 min。用ClonExpress II将纯化的ku基因表达片段与pBAD33载体片段进行无缝克隆连接，构建重组质粒pBAD33-ku；将pBAD33-ku转化于大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含10 μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37 ℃培养过夜，并筛选重组克隆以pBAD-mcf-TF/pBAD- mcf-TR为引物进行PCR鉴定(1 040 bp)；提取重组阳性克隆质粒转化至大肠杆菌β2163感受态细胞，转化产物涂布于含10 μg/mL氯霉素和0.3 mmol/L DAP的LB固体培养基，以筛选获得β2163/ pBAD33-ku菌株。以β2163/pBAD33-ku菌株作为供体菌，与缺失株PAO1Δku进行接合培养，培养物涂布于含有10 μg/mL氯霉素的LB抗性平板筛选克隆，以pBAD-mcf-TF/pBAD-mcf-TR为引物对进行PCR检测(1 040 bp)，并将PCR产物纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。回补株命名为Δku::ku。
1.2.3 生物被膜的培养向24孔细胞培养板每个反应孔内置入1片灭菌细菌片(直径14 mm)，并加入2 mL LB液体培养基和100 μL稀释细菌悬液(终浓度为105 CFU/mL)混匀，37 ℃培养。每块培养板设置一个阴性对照孔(不加入菌悬液)。每24 h更换一次培养液(吸去1 mL菌悬液，加入1 mL LB液体培养基)。PAO1、Δku以及Δku::ku菌株在24孔细胞培养板中按上述方法进行生物被膜培养。取出细菌爬片，在无菌生理盐水中轻轻漂洗，收集漂洗后的生理盐水为浮游菌液。用细胞刮刀刮取细菌爬片上的细菌溶于生理盐水中，制得生物被膜菌液。
1.2.4 生物被膜形成能力的检测过夜培养PAO1、Δku以及Δku::ku菌株，将各菌液稀释至终浓度为105 CFU/mL，取200 μL加入于96孔板，每个菌株3个平行，等量LB液体培养基为阴性对照，于37 ℃培养，每24 h更换一次培养液。分别对培养3 d和6 d的96孔板用蒸馏水冲洗3次，洗去浮游菌，用甲醛固定5 min，结晶紫染色30 min，再用蒸馏水冲洗3次，放置至干燥后用400 μL 95%乙醇脱色，所得有色溶液用分光光度计测590 nm处吸光值。
1.2.5 生物被膜基因突变率的检测取100 μL培养1、3、6、9 d的各菌株生物被膜菌液及PAO1浮游菌液稀释后，分别涂布于LB固体培养基和含100 mg/L利福平的LB固体培养基，37 ℃培养18 h后进行平板菌落计数，按照Rosche等[21]方法计算基因突变率。
1.2.6 生物被膜菌耐药性的检测按照上述方法培养PAO1、Δku及Δku::ku菌株的生物被膜，分别取培养2、6、12 d的生物被膜溶于MH培养基中制得生物被膜菌液。采用微量稀释法测定环丙沙星、头孢他啶和庆大霉素的MIC。于96孔微量滴定板各孔中加入100 μL MH培养基，配制抗生素溶液，第一孔内加入浓度为128 mg/L的抗生素溶液100 μL，逐孔2倍稀释至浓度为0.5 mg/L，于每孔中加入稀释至0.5麦氏单位的生物被膜菌液，MH液体培养基为阴性对照，不加抗生素溶液的菌液为阳性对照，37 ℃培养20 h后观察结果，测得MIC。
1.2.7 基因转录水平检测分别取培养1、2、4、6 d的PAO1生物被膜菌液和浮游菌液，根据天根RNA抽提试剂盒说明书，分别抽提总RNA，取300 ng总RNA，通过EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录合成cDNA，反转录体系为20 μL。使用SYBR Green Select Master Mix，以cDNA为模板，ku-F/ku-R为特异性引物对，采用qPCR检测ku基因在浮游状态和生物被膜状态的转录水平。以16S rRNA基因为内参基因，所用引物见表 2。qPCR的反应体系(10 μL)：cDNA 1 μL (cDNA使用前进行稀释：检测ku基因稀释10倍，检测16S rRNA基因稀释100倍)，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR Green Select Master Mix 5 μL，超纯水3 μL。qPCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt (Livak)法分析数据，计算不同培养时间生物被膜菌中ku基因的转录水平。
2 结果与分析 2.1 铜绿假单胞菌ku缺失突变菌株的构建根据引物的设计，以PAO1基因组DNA为模板，扩增ku基因(PA2150)上游片段(A)和下游片段(B)，通过交叠PCR的方法将A片段和B片段融合为AB片段，并构建至载体pLP12中，获得重组自杀质粒(pLP12-ku)。将pLP12-ku电转化至大肠杆菌β2163中，获得供体菌β2163/pLP12-ku。供体菌与受体菌PAO1混合培养后，通过盐酸四环素和D-葡萄糖进行初筛，获得重组自杀质粒插入受体菌基因组的单交换同源重组克隆。单交换同源重组克隆经过L-阿拉伯糖诱导，vmi480致死基因反向筛选获得双交换同源重组克隆。以ku-EcoR I-MF1/ku-Nhe I-MR2为引物对，通过PCR扩增检测双交换克隆，获得ku缺失突变菌株。其中，回复突变克隆扩增片段为2 060 bp，ku缺失突变克隆扩增片段为1 236 bp (图 1A)。最后通过PCR产物测序验证证实ku缺失突变菌株Δku构建成功。
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| 图 1 ku基因缺失株及其回补株的PCR验证 Figure 1 PCR verification of ku gene deletion mutant strains and its complementary strains 注：M：DL2000 DNA Marker；A：1为野生菌株PAO1，2-6为ku缺失突变克隆Δku；B：1-6为回补株，7为阳性对照β2163/pBAD33-ku，8为阴性对照Δku. Note: M: DL2000 DNA Marker; A: Wild-type PAO1 in lane 1, ku gene deletion clones Δku in lanes 2-6; B: Complementary strains in lanes 1-6, positive control β2163/pBAD33-ku in lane 7, negative control Δku in lane 8. |
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根据引物设计，分别扩增获得ku基因及pBAD33载体片段，两者通过无缝克隆连接构建重组表达质粒pBAD33-ku，将重组质粒电转化至大肠杆菌β2163中，获得供体菌β2163/pBAD33-ku。供体菌与受体菌Δku接合培养获得回补株Δku::ku。以突变株为阴性对照，β2163/pBAD33-ku为阳性对照，pBAD-mcf-TF/pBAD-mcf-TR为引物对进行PCR检测，阳性克隆PCR条带大小为1 040 bp (图 1B)。
2.3 ku缺失对铜绿假单胞菌生物被膜形成能力的影响比较PAO1、Δku以及Δku::ku菌株生物被膜的形成能力，结果显示，培养3 d和6 d时，突变菌株与野生菌株形成的生物被膜厚度无显著差异(图 2)。
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| 图 2 ku基因对生物被膜菌形成能力的影响 Figure 2 Effect of ku gene on biofilm-forming ability of PAO1 at different cultivation times |
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以PAO1浮游菌液为对照，比较PAO1、Δku及Δku::ku这3种菌株在培养1、3、6、9 d时生物被膜中细菌的基因突变率。PAO1浮游菌的基因突变率在培养1 d时为0.6×10-11，培养9 d时上升至1.06×10-11，而生物被膜中的PAO1基因突变率显著高于浮游菌(图 3)，这与Driffield等[22]的研究结果相符。另外，生物被膜状态下，PAO1基因突变率随着培养时间的不同发生着变化，在第6天时，基因突变率达到最高值，而Δku的基因突变率在不同培养时间几乎没有变化，此时两者基因突变率差异达到最高，Δku基因突变率降低至PAO1约1/5处(P < 0.01)。回补株Δku::ku与野生菌株无显著差异(P > 0.05)。
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| 图 3 ku基因对生物被膜中的PAO1基因突变率的影响 Figure 3 Effect of ku gene on mutation rate of PAO1 within biofilms grown at different cultivation times 注：PL：浮游菌；BF：生物被膜. Note: PL: Planktonic bacteria; BF: Biofilm. |
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比较PAO1、Δku以及Δku::ku生物被膜菌对环丙沙星、头孢他啶和庆大霉素的耐药性，发现两者的耐药性随着生物被膜培养时间的延长皆有所增强。生物被膜培养6 d和12 d时，Δku对环丙沙星以及庆大霉素的耐药性比PAO1下降了50%，而两种菌株对头孢他啶的耐药性并无明显差别。回补株生物被膜对各抗菌药物耐药性与野生菌株无差异(表 3)。
| 抗生素 Antibiotics |
培养时间 Time (d) |
菌株 Strains |
||
| PAO1 | Δku | Δku::ku | ||
| 环丙沙星 Ciprofloxacin |
2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 6 | 2.0 | 1.0 | 2.0 | |
| 12 | 8.0 | 4.0 | 8.0 | |
| 庆大霉素 Gentamicin |
2 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 6 | 4.0 | 2.0 | 4.0 | |
| 12 | 8.0 | 4.0 | 8.0 | |
| 头孢他啶 Ceftazidime |
2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 6 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | |
| 12 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | |
通过qPCR比较PAO1浮游菌与PAO1生物被膜细菌在不同培养时间ku基因的转录水平，结果表明，培养2 d后，PAO1生物被膜ku基因转录水平比PAO1浮游菌增强了2倍，这样的差异并未随着生物被膜培养时间的延长而有所改变(图 4)。
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| 图 4 不同培养时间下ku基因转录水平 Figure 4 Transcription level of ku gene in PAO1 biofilms grown at different cultivation times compared to PAO1 planktonic bacteria 注：PL：浮游菌；BF：生物被膜. Note: PL: Planktonic bacteria; BF: Biofilm. |
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铜绿假单胞菌是临床常见条件致病菌，生物被膜的形成极大地增强了其耐药性。生物被膜的耐药机制由多种因素引起，包括外排泵机制上调、免疫逃逸、物理屏障以及低营养微环境等[23]。另外，表型变异在生物被膜特殊的环境因素中产生，也使得细菌对多种抗菌药物耐药[24-25]。研究显示，DNA错配修复途径(DNA mismatch repair)的失活可引起基因突变频率增加，从而引起PA生物被膜对抗菌药物耐药水平的提高[26-28]，这表明基因突变与生物被膜耐药性密切相关。实际上，即使在非人工诱导的情况下，野生型PA生物被膜的基因突变率可达浮游菌的100倍[22]。究竟是何种机制导致PA生物被膜基因突变率增加以及PA生物被膜的耐药作用增强目前仍不清楚。
NHEJ是DSB的主要修复机制之一，修复过程无需同源模板，直接将断裂缺口连接，常导致DNA发生序列改变。研究表明恶臭假单菌NHEJ与稳定生长期的细菌变异相关[29]，铜绿假单胞菌NHEJ途径可促进染色体片段缺失[30]。细菌的NHEJ修复途径主要由Ku蛋白和LigD连接酶参与，Shen等的研究显示Δku突变体与ΔkuΔligD双缺失突变体丢失染色体片段的概率下降，而Δku突变体的ku基因回补提高了染色体片段缺失的概率[30]，这些数据表明了Ku蛋白在NHEJ修复途径中的关键性。因此，我们认为ku基因缺失可导致NHEJ途径的失活。
NHEJ可以作用于细胞周期的任何时期，但在细菌中NHEJ的作用主要体现在生长稳定期、饥饿状态或孢子等营养低、生长慢的环境中[31-32]，这与生物被膜特殊的微环境状况非常相似。据谢轶等[33]的研究表明，PA细菌悬液培养1 d后未形成生物被膜，培养3 d后开始形成生物被膜，培养6 d可形成很厚的生物被膜。本研究显示，ku基因表达水平在PA生物被膜培养2 d后有所提高，说明NHEJ的作用在生物被膜形成早期得到了一定程度的激活，但是生物被膜形成能力检测结果表明ku基因并不影响生物被膜的形成。我们由此推测在PA中，生物被膜的形成不受NHEJ调节，但其是NHEJ作用的主要环境。
本研究中，通过筛选利福平耐药突变体检测生物被膜中PA野生菌株及ku缺失菌株的基因突变率，结果显示，随着生物被膜的形成和成熟，PA基因突变率不断提高，在培养6 d时达到最大值，但ku缺失突变株并未显示基因突变率的变化，这一结果表明NHEJ对生物被膜中PA基因突变率的提高有一定的促进作用。文献报道利福平耐药主要是因为rpoB基因发生突变引起，包括点突变、短的插入和缺失突变[34-35]，而NHEJ修复DSB引起的突变以短的插入和缺失为主[36]。我们由此推测ku缺失导致NHEJ途径被抑制，致使rpoB基因发生突变的频率降低，PA基因突变率下降。为验证这一推测，我们下一步的工作将对PA利福平耐药突变体进行rpoB基因测序，分析其突变类型，进一步明确ku介导的突变与生物被膜中PA基因突变率上升的联系。
PA对抗菌药物的耐药性可由多种耐药机制介导，而研究发现耐药机制可由基因突变激活或调节，如外排泵MexAB-OprM因mexR、nalB、nalC或nalD基因突变而上调，增强了对β-内酰胺类和喹诺酮类药物的耐受力[37]；喹诺酮类药物靶基因gyrA、gyrB或parC、parE以及氨基糖苷类药物靶基因rplY的突变降低了PA对该药物的敏感性[37-38]；ampC基因突变可增强β-内酰胺酶表达量，大大增强PA对头孢菌素的耐药性[39]。本研究发现ku基因对生物被膜状态中的PA环丙沙星和庆大霉素的耐药性有一定的正调控作用，这极有可能源于NHEJ途径在修复DNA的过程中产生的突变涉及了PA耐药机制的相关基因而影响了其活性，但NHEJ产生的突变影响了何种耐药机制以及其如何引起耐药机制活性变化，这一系列问题还有待进一步的研究。
综上所述，我们通过本研究发现PA在生物被膜环境下NHEJ途径活性增强，引起基因突变率升高，对某些抗菌药物耐药性增强。我们将在未来的工作中进一步探讨NHEJ引起基因突变率和耐药性增强的机制。
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