2020, Vol. 47扩展功能
文章信息
- 武志华, 赵璞钰, 丁一秀, 马强, 王雪寒, 刘惠荣
- WU Zhi-Hua, ZHAO Pu-Yu, DING Yi-Xiu, MA Qiang, WANG Xue-Han, LIU Hui-Rong
- 致病疫霉拮抗菌株B25-I-3的鉴定及其次级代谢产物
- Identification and secondary metabolites of strain B25-I-3 against Phytophthora infestans
- 微生物学通报, 2020, 47(11): 3586-3599
- Microbiology China, 2020, 47(11): 3586-3599
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.191019
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文章历史
- 收稿日期: 2019-12-08
- 接受日期: 2020-02-27
- 网络首发日期: 2020-06-01
马铃薯是我国的第四主粮，其最严重的病害之一为晚疫病(potato late blight)，病原菌为致病疫霉(Phytophthora infestans)[1]，能够导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂[2]，在多雨、冷凉的气候条件下能引起大田大面积发病。目前该病仍以化学防治为主，通常采用的药物试剂有甲霜灵锰锌、安泰生、薯瘟消、代森锰锌等。农药的长期使用不但导致P. infestans的抗药性逐渐增强，还破坏了生态环境。因此，研发能够防治马铃薯晚疫病的高效低毒的生物农药迫在眉睫。
粘细菌是一类具有形态发生、复杂多细胞行为和社会性行为的革兰氏阴性细菌[3]，属高等原核生物[4]，因捕食性生活方式而闻名[5]。粘细菌生物合成潜力巨大，50%以上的菌株能产生具有生物活性的次级代谢产物[6]，是很好的天然药物筛选资源[7]，其次级代谢产物中已有100多种基础结构和500多种衍生物被阐明[8]，具有应用研究开发潜力[9]。由于粘细菌具有产生的活性物质种类多、结构新、作用水平层次多、作用机制多样等特点，其研究工作日益受到重视[10]。研究报道发现粘细菌对多种真菌表现出拮抗活性，Liu等[11]发现Myxococcus fulvus ZJ2有抗白色念珠菌(Canidia albicans)的活性；王海英[12]分离纯化出的Cystobacter sp. 93009能够抑制毛霉(Mucor hiemalis)和黄曲霉(Aspergillas flavus)的生长；Myxococcus xanthus YR-7[13]、Myxococcus stipitatus X6-II-1[14]、Myxococcus virescens YR-35[15]等不同的粘细菌被发现对P. infestans表现出较强的抑制作用。
本研究从采集自内蒙古自治区包头地区的一份土壤样品中筛选出一株对P. infestans具有显著抑制作用的粘细菌菌株(实验室编号为B25-I-3)，通过形态特征与16S rRNA基因序列分析对该菌株进行分类鉴定，还进行了抗菌活性分析并通过正交试验优化发酵条件，然后对浓缩发酵液中活性物质的稳定性及抗菌活性进行检测，通过TLC与HPLC等初步分离后，将具有抗P. infestans活性的组分进行HPLC-MS检测，最后通过离体叶片法测定了活性物质对马铃薯晚疫病的防病作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 土壤样品内蒙古自治区包头地区的一片草地(N40.310 57°，E110.842 4°)，属草甸盐土，利用五点采样法采集表层1−10 cm处土壤。将土样风干后室温干燥保存。
1.1.2 培养基菌株的诱导与纯化所需培养基有ST21CX固体培养基、VY/2固体培养基、CAS液体培养基，抗菌活性分析所用培养基有PDA培养基、YPD液体培养基、土豆培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、黑麦固体培养基等[16]。
1.1.3 抗菌活性指示菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，均由本实验室提供。
1.1.4 主要试剂和仪器FeCl3、K2HPO4、NaNO3、MgSO4、CaCl2等，天津风船化学试剂科技有限公司；Taq DNA聚合酶，上海信裕生物科技有限公司。生化培养箱，上海一恒科技有限公司；体视显微镜，厦门叁诺西努科技有限公司；电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；液质联用仪，沃特世公司。
1.2 菌株的分离、纯化及保存将土壤样品预处理后，利用兔粪诱导法对其中的粘细菌进行分离[17]。识别兔粪球上或其周围土样上的粘细菌，利用直接转接法对其进行纯化[18]。挑取经观察没有杂菌的菌株子实体，接种于CAS液体培养基30 ℃、180 r/min振荡培养36 h，若CAS液体培养基澄清即认为该菌株已为纯菌[19]。将已纯化的菌株用20%无菌甘油置于−80 ℃保存。
1.3 菌株的鉴定 1.3.1 形态观察参照《伯杰细菌鉴定手册》[20]分类标准，对分离纯化出的于VY/2培养基上已生长8 d的菌落形态以及子实体的结构进行观察并拍照。
1.3.2 分子鉴定采用石英砂与溶菌酶法共同破壁对染色体DNA进行提取[21]，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1495R进行PCR扩增[22]。将PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，利用BLAST对其16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比对。
1.4 菌株B25-I-3抗菌谱检测将菌株B25-I-3接于VY/2固体培养基上，30 ℃培养7 d。将−80 ℃保存的S. aureus、E. coli与B. subtilis各20 μL分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜，次日将培养液4 ℃、8 000 r/min离心15 min后取菌体沉淀，并加入3 mL无菌水重新混悬，各取1 mL分别均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上。将20 μL保存于−80 ℃的S. cerevisiae接入YPD液体培养基，37 ℃、180 r/min振荡培养18 h后4 ℃、8 000 r/min离心15 min，加入3 mL无菌水混悬菌体沉淀并吸取1 mL均匀涂布在土豆培养基上。用直径为0.8 cm的无菌蓝色枪头扎取VY/2培养基上已生长7 d的菌株B25-I-3制成菌饼，将菌饼分别倒扣在涂有不同指示菌的平板上，以同样大小的VY/2培养基作空白对照，37 ℃培养2 d后观察抑菌情况。
采用平板对峙法[23]，将R. solani、V. dahliae、F. oxysporum、S. sclerotiorum分别接种于PDA培养基上，将P. infestans接入黑麦培养基，再用直径为0.8 cm的无菌蓝色枪头扎取VY/2培养基上已生长7 d的菌株B25-I-3制成菌饼，将菌饼倒扣于距各指示菌约2.5 cm处，以同样大小的VY/2培养基作空白对照，18 ℃培养7 d，观察是否出现抑菌圈，重复3次。
1.5 菌株B25-I-3发酵条件优化 1.5.1 生长曲线测定将VY/2培养基上培养7 d的菌株B25-I-3转到有100 mL VY/2液体培养基的锥形瓶中，30 ℃、180 r/min培养3 d，以10%的接种量转到100 mL VY/2液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养。每隔24 h于8 000 r/min离心10 min收集一次菌体，菌体经去离子水洗涤后再次离心，沉淀于50 ℃恒温烘干至恒重。测量菌体干重并绘制生长曲线[24]。
1.5.2 活性物质分布将VY/2培养基上培养7 d的菌株B25-I-3转接到100 mL的VY/2液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养3 d后打碎菌块，以10%的接种量转到100 mL VY/2液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养7 d。将发酵液8 000 r/min离心20 min，收集上清液(细胞外)。同时沉淀用无菌水洗涤3次后超声破碎(功率为220 W，超声5 min，暂停10 min，共超声30 min)后8 000 r/min离心20 min，收集上清液(细胞内)。将2次收集的上清液分别冻干并称重，按比例用无菌水溶解至浓度一致，经0.22 μm滤膜过滤，用滤纸片法[25]检测其抗致病疫霉的活性。
1.5.3 发酵条件优化对拮抗P. infestans的粘细菌菌株B25-I-3进行摇瓶发酵，利用单因素筛选与正交试验结合的方案对接种量、周期、温度与转速进行优化，以期为工业生产提供基础数据。表 1为发酵条件的单因子筛选方案。
| Factors | Levels | ||||
| Incubation temperature (℃) | 25 | 28 | 30 | 32 | 35 |
| Incubation time (d) | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| Inoculum size (%) | 5 | 8 | 10 | 12 | 15 |
| Rotating speed (r/min) | 150 | 160 | 170 | 180 | 190 |
根据单因素实验结果确定影响菌株B25-I-3对P. infestans拮抗活性较大的因素及水平范围，然后将菌株B25-I-3接入VY/2液体培养基中，30 ℃、180 r/min摇瓶振荡培养3 d后按表 2进行正交试验继续摇瓶振荡培养，然后利用滤纸片法[25]对发酵上清液的抗P. infestans活性进行检测。
| Levels | Factors | ||
| Inoculum size (%) | Incubation temperature (℃) | Incubation time (d) | |
| 1 | 8 | 28 | 7 |
| 2 | 10 | 30 | 8 |
| 3 | 12 | 32 | 9 |
将菌株B25-I-3在最适发酵条件下进行培养后8 000 r/min离心20 min，收集上清液于−40 ℃低温冻干。用无菌水溶解冻干物，经0.22 μm滤膜过滤除菌，使发酵液最终浓缩50倍。滤纸片法检测浓缩发酵上清液对温度、蛋白酶K以及紫外光和自然光的稳定性，并对其耐贮性进行检测。
1.7 菌株B25-I-3活性物质抗细菌与抗真菌活性检测在菌株B25-I-3的VY/2液体发酵培养基中添加4%的XAD-16大孔吸附树脂，于最适条件下发酵培养后收集树脂，在自然条件下风干后加入10倍体积的甲醇洗脱3次，合并洗脱液并于旋转蒸发仪上减压浓缩，蒸干称重后用少量甲醇溶解，经0.22 μm微孔滤膜(有机相)过滤除菌后，置于4 ℃冰箱保存备用，采用滤纸片法检测其对S. aureus、E. coli、B. subtilis、S. cerevisiae、R. solani、F. oxysporum和S. scotiorum的拮抗活性。
1.8 菌株B25-I-3活性物质的初步分离与鉴定以甲醇与水为展开剂将浓缩后的菌株B25-I-3具有抗菌活性的次级代谢产物进行薄层层析实验，以确定高效液相色谱实验时最佳的流动相。根据表 3的洗脱方法对样品进行HPLC初步分离。收集单峰样品，分别将其再次浓缩，用甲醇溶解后使所有液体浓度相同，采用滤纸片法检测各峰样品对P. infestans的拮抗活性。
| Time (min) | Water (%) | Methanol (%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 80 | 20 |
| 10 | 80 | 20 |
| 40 | 0 | 100 |
| 60 | 0 | 100 |
| 66 | 95 | 5 |
| 67 | 95 | 5 |
对具有抗P. infestans活性的组分使用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪(Acquity UPLC Xevo Q-TOF)进行鉴定。利用色谱柱为BEH C18 (2.1×100 mm，1.7 μm)的C18-UPLC系统对样品首先进行色谱分离，上样量为10 μL，流速为0.3 mL/min。流动相A为有机相(乙腈溶液+0.2%甲酸溶液)，流动相B为水相(水+0.2%甲酸溶液)，在正离子扫描模式下按表 4梯度洗脱后使用质谱仪扫描检测。
| Time (min) | Mobile phase A (%) | Mobile phase B (%) | Curve |
| 0 | 5 | 95 | Initial |
| 2 | 5 | 95 | 6 |
| 5 | 50 | 50 | 6 |
| 8 | 60 | 40 | 6 |
| 16 | 70 | 30 | 6 |
| 23 | 80 | 20 | 6 |
| 26 | 80 | 20 | 6 |
| 28 | 5 | 95 | 6 |
克新1号、青薯9号、费乌瑞它和冀张薯于光照下生长5−8周，剪取植株中部健康且大小相近的叶片，冲净后置于150 mm的平板中，底部用脱脂棉保湿。处理组于叶片背面分别均匀涂布浓度为200、100、10、5、3和0 μg/mL菌株B25-I-3活性物质浓缩液，自然风干后，将100 μL P. infestans游动孢子悬液滴加于各个叶片的中脉，于20 ℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养7−10 d，观察P. infestans侵染情况并对叶片的相对病斑面积通过Adobe Photoshop CS5进行测量[26]。以无菌水分别替代P. infestans游动孢子悬液与菌株B25-I-3活性物质浓缩液为对照组1和2，每种处理都重复6个叶片，重复3次。
2 结果与分析 2.1 菌株B25-I-3的鉴定 2.1.1 形态鉴定通过兔粪诱导与子实体多次转接的方法从土样中共分离纯化出3株粘细菌，其均对致病疫霉表现出拮抗活性，其中拮抗活性相对较强的菌株编号为B25-I-3。该菌株能够在VY/2培养基上形成特征性的菌落，有圆形扩展的薄而半透明的膜。单个生长的柔软子实体为橙色，球形或椭球形，没有柄状结构，但有折光性，呈不规则点状分布，在其外围可产生透明粘液(图 1)，与《伯杰细菌鉴定手册》上橙色粘球菌的形态特征相似。
2.1.2 分子鉴定将菌株B25-I-3的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中，获得登录号为MH730555，与其中的已知序列进行相似性比对，发现与Myxococcus fulvus strain 1mx (登录号为KC862597)的相似性最高，可达100%。结合形态特征，确定菌株B25-I-3为橙色粘球菌(M. fulvus)。
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| 图 1 菌株B25-I-3的形态特征 Figure 1 The morphological characteristics of strain B25-I-3 注：A：菌落；B：子实体. Note: A: Colony; B: Fruiting bodies. |
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菌株B25-I-3可以杀死并溶解E. coli，而且可以抑制B. subtilis、F. oxysporum、R. solani、S. sclerotiorum、V. dahliae以及P. infestans的生长(表 5)，其中对P. infestans的抑制活性最强，但是对S. aureus和S. cerevisiae没有抑制活性。
| The indicator microorganism | The antibiotic activity |
| Escherichia coli | ++ |
| Rhizoctonia solani | ++ |
| Bacillus subtilis | + |
| Sclerotinia sclerotiorum | ++ |
| Staphylococcus aureus | − |
| Saccharomyces cerevisiae | − |
| Fusarium oxysporum | + |
| Phytophthora infestans | +++ |
| Verticillium dahliae | + |
| Note: +++: strong inhibition; ++: medium inhibition; +: weak inhibition; −: indicated no inhibition. | |
如图 2A所示，菌株B25-I-3接种后经2 d的迟缓期，在第2−3天进入快速增长期，第3−5天进入第2个迟缓期，第5−7天再次进入快速增长期，第7天时菌体重量达到最大值，之后急速减少，进入衰亡期，9 d后趋于稳定。将菌株发酵培养后，滤纸片法分别检测其胞内物及胞外物对致病疫霉的抗性。结果如图 2B所示，菌株B25-I-3的胞外物对致病疫霉的生长表现出一定的抑制作用，但并未检测到胞内物的抑菌活性，可初步说明菌株B25-I-3的抗致病疫霉活性物质主要存在于细胞外。
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| 图 2 菌株B25-I-3的生长曲线(A)及其活性物质的分布(B) Figure 2 The growth curve (A) and distribution of active substances (B) 注：图A中小写字母代表 0.01差异显著性水平.图B中：a：致病疫霉；b/c：胞外物质；d：胞内物质；e：空白对照. Note: A: The lowercase letters in Figure 2A indicate significant difference level of 0.01. B: a: P. infestans; b/c: Extracellular substances; d: Intracellular substances; e: Blank control. |
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(1) 转速的影响
不同转速对菌株B25-I-3发酵上清液抑菌活性的影响并不明显。转速为150−170 r/min时，抑菌活性呈上升趋势；当转速为170 r/min和180 r/min时，其对P. infestans的抑制活性相同且达到最强；在180−190 r/min时，抑菌活性呈下降的趋势(图 3A)，因此，确定最佳转速为180 r/min。
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| 图 3 不同转速(A)、接种量(B)、周期(C)和温度(D)对菌株B25-I-3发酵上清液活性的影响 Figure 3 Effect of shaking speed (A), inoculum size (B), time (C) and temperature (D) on the antibiotic activity of fermentation supernatant 注：图中小写字母代表 0.01差异显著性水平. Note: The lowercase letters indicate significant difference level of 0.01. |
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(2) 接种量的影响
菌株B25-I-3发酵上清液对P. infestans的抑制活性随接种量的增加先升后降，当接种量为10%时其活性最强，滤纸片与菌丝生长边缘的最短距离达到6.5 mm (图 3B)，因此选择10%为最适接种量。
(3) 发酵周期的影响
菌株B25-I-3发酵5 d的抑菌活性还较低，但随发酵周期的延长抑菌活性逐渐增强，第7天活性达到最高，第8天时开始出现下降的趋势(图 3C)，最终确定最佳发酵周期为7 d。
(4) 温度的影响
温度为25−30 ℃时，菌株B25-I-3发酵上清液对P. infestans的抑制活性随温度的升高而增强，30 ℃时达到最高，菌丝生长边缘距滤纸片为6.5 mm，之后抑菌活性随温度的增高而降低(图 3D)，说明温度过高或过低都不利于M. fulvus B25-I-3活性物质的产生，因其最佳发酵温度为30 ℃。
选取对抑菌活性影响较大的接种量、温度与周期这3个因素进行正交试验，方案及结果如表 6所示。菌株B25-I-3经不同接种量、温度、周期产生的发酵上清液对P. infestans的抑制活性不同。其最优发酵条件为：接种量10%，温度30 ℃，周期7 d。极差分析可知影响发酵上清液抑制P. infestans活性的顺序为：温度 > 接种量 > 周期。
| Test No. | Factors | Radius of inhibition zone(mm) | ||||||
| Temperature (℃) | Incubation time (d) | Inoculum size (%) | Repeat 1 | Repeat 2 | Repeat 3 | Average value | ||
| 1 | 28 | 8 | 12 | 5.0 | 4.0 | 5.0 | 4.7f | |
| 2 | 30 | 7 | 10 | 8.5 | 8.5 | 8.5 | 8.5a | |
| 3 | 32 | 9 | 12 | 7.0 | 6.0 | 6.5 | 6.5bcd | |
| 4 | 28 | 9 | 8 | 4.5 | 5.0 | 5.5 | 5.0ef | |
| 5 | 30 | 9 | 12 | 7.5 | 7.0 | 7.5 | 7.3b | |
| 6 | 32 | 7 | 8 | 6.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0cde | |
| 7 | 28 | 7 | 10 | 5.5 | 6.0 | 5.0 | 5.5def | |
| 8 | 30 | 8 | 8 | 7.5 | 6.5 | 6.5 | 6.8bc | |
| 9 | 32 | 8 | 10 | 7.0 | 6.5 | 7.0 | 6.8bc | |
| K1 | 5.1 | 6.7 | 5.9 | |||||
| K2 | 7.5 | 6.1 | 6.9 | K=6.3 | ||||
| K3 | 6.4 | 6.3 | 6.2 | |||||
| k1 | 1.7 | 2.2 | 2.0 | |||||
| k2 | 2.5 | 2.0 | 2.3 | k=2.1 | ||||
| k3 | 2.1 | 2.1 | 2.1 | |||||
| R | 2.4 | 0.6 | 1.0 | |||||
| Note: K1, K2, K3: The means of the corresponding list, respectively; R: Range; The lowercase letters indicate significant difference level of 0.01. | ||||||||
对试验结果进行方差分析，如表 7所示。温度的P值最接近0.01，对试验结果影响较显著，是影响菌株B25-I-3发酵上清液抑菌活性的主要因素，接种量和周期为次要因素。通过比较F值大小，进一步确定温度为主要影响因素，接种量的影响则略高于周期。所以对发酵产物抑制P. infestans生长活性的影响大小顺序为：温度 > 接种量 > 发酵周期，与极差分析结果相符。
| Source of variance | The square sum of the mean squared | Mean square | Degrees of freedom | F | P |
| Temperature | 9.162 | 4.581 | 2 | 38.896 | 0.025 |
| Inoculum size | 1.436 | 0.718 | 2 | 6.094 | 0.141 |
| Incubation time | 0.302 | 0.151 | 2 | 1.283 | 0.438 |
| Deviation | 0.236 | 0.118 | 2 |
菌株B25-I-3发酵产生的活性物质在30−100 ℃恒温水浴中各处理30 min仍可对P. infestans保持较高的抑制活性(图 4)。与在4 ℃保存的活性物质的抗P. infestans活性相比，在30−50 ℃恒温水浴中处理后的活性物质对P. infestans的抑制活性下降并不明显，但在60 ℃及以上的恒温水浴中处理后的活性却有不同程度的升高，推测是较高的外界温度蒸发掉部分溶剂而使活性物质浓度升高所致。初步推断温度对菌株B25-I-3产生活性物质抑制P. infestans的影响较小。
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| 图 4 温度对发酵产物抑菌活性的影响 Figure 4 Effects of the temperature on the antibiotic activity of fermentation products Note: The lowercase letters indicate significant difference level of 0.01. |
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菌株B25-I-3浓缩发酵液在分别经紫外线和自然光照射以及蛋白酶K处理后，与未经处理的浓缩液相比，均对P. infestans的抑菌圈大小无显著变化(图 5A)。说明菌株B25-I-3的次级代谢产物对紫外线和自然光以及蛋白酶K稳定，该菌株抑制P. infestans的活性物质可能不是蛋白质。菌株B25-I-3的活性物质在不同低温条件下各保存15 d后对P. infestans的抑制作用均略有下降，其中于−80 ℃保存后的活性下降较为明显(图 5B)，说明菌株B25-I-3的次级代谢产物便于在−20 ℃与4 ℃条件下长期保存。
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| 图 5 自然光、紫外线、蛋白酶K (A)与贮存温度(B)对菌株B25-I-3发酵产物抗致病疫霉活性的影响 Figure 5 Effects of natural light, ultraviolet, proteinase K (A) and storage temperature (B) on the antibiotic activity of fermentation products Note: The lowercase letters indicate significant difference level of 0.01. |
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菌株B25-I-3发酵产生的具有拮抗P. infestans生长活性的次级代谢产物对S. aureus、E. coli、B. subtilis、S. cerevisiae、R. solani、F. oxysporum与S. sclerotiorum均表现出了抑制作用。但菌株对S. aureus及S. cerevisiae并未表现出抑制活性，推测菌株分泌的活性物质有限，而其发酵液经浓缩后活性物质浓度增加，表现出了比菌株更广的抗菌谱。
2.6 菌株B25-I-3抗菌活性物质的初步分离与鉴定以甲醇与水(4:1，体积比)为洗脱相对菌株B25-I-3的甲醇浓缩液进行HPLC检测，结果如图 6所示。浓缩液中的化合物大部分在25 min后吸收，洗脱时间在25−50 min，有较多物质被冲洗出来，其中1−6号峰对称且宽度较窄，分离度较好，而其余峰交叉在一起，未能达到极限分离。
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| 图 6 菌株B25-I-3活性物质的HPLC色谱图 Figure 6 HPLC chromatogram of the active substances |
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利用滤纸片法检测各个峰的馏分对致病疫霉的拮抗活性。图 6中峰5处收集的洗脱液对P. infestans具有较强的抑制作用，而其他峰处收集的馏分与交叉在一起的峰的混合馏分对P. infestans都未表现出抑制活性。初步判定峰5处的馏分中含有对P. infestans具有抑制作用的活性物质。对具有拮抗活性的组分进行HPLC-MS检测，结果如图 7所示。
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| 图 7 HPLC-MS图 Figure 7 HPLC-MS |
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经数据分析后，图 6中峰5处收集的馏分中主要含有2种物质，一种为N-(3-氨基-2-羟丙基)-N-甲基硫酸二酰胺[N-(3-amino-2-hydroxypropyl)-N-methylsulfuric diamide]，分子式为C4H13N3O3S，分子量为183.07，结构式见图 8A；另一种为甲基(2R)-2-叠氮基-3-羟基-2-甲基丙酸酯[methyl(2R)-2-azido-3-hydroxyl-2-methylpropanoate]，分子式为C5H9N3O3，分子量为159.06，结构式见图 8B。
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| 图 8 液质联用仪检测到的物质结构 Figure 8 Structure of the substances detected by HPLS-MS analysis Note: A: N-(3-amino-2-hydroxypropyl)-N-methylsulfuric diamide; B: Methyl(2R)-2-azido-3-hydroxyl-2-methylpropanoate. |
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在只涂无菌水的空白对照组与只涂甲醇的对照组中，经P. infestans侵染后，4个品种叶片的相对病斑面积均在90%以上；试验组中，叶片的相对病斑面积随着活性物质浓度的升高而逐渐下降(图 9)，说明菌株B25-I-3抗致病疫霉活性物质对马铃薯晚疫病具有明显的防治作用，而且对不同品种的马铃薯无特异性。
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| 图 9 菌株B25-I-3活性物质对致病疫霉侵染马铃薯离体叶片的影响 Figure 9 Effect of active substances on the detached potato leaves infected by P. infestans 注：A：费乌瑞它；B：冀张薯；C：青薯9号；D：克新1号.小写字母：0.01差异显著性水平. Note: A: Feurita; B: Jizhangshu; C: Qingshu No.9; D: Kexin No.1. The lowercase letters indicate significant difference level of 0.01. |
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利用有益微生物抑制有害微生物是防治植物病害的有效途径之一[27]。El-Hasan等[28]从木霉菌(Trichoderma)中分离出的多种次级代谢产物均可以抑制植物病原体；Caulier等[29]发现枯草芽孢杆菌30B-B6对P. infestans具有抑制作用，能明显降低病害的发生；蒋继志等[30]将3株抗P. infestans的放线菌复合发酵后，发现发酵液能明显地抑制菌丝生长，且使菌丝变形或孢子囊发生异常破裂。因此，从微生物产生的活性物质中研发生物农药用以防治马铃薯晚疫病具有极大的可能性。
本研究对象是具有生物活性次级代谢产物“微工厂”之称的粘细菌。目前已从粘细菌中发现了约600多种生物活性物质，有抗菌、抗病毒、溶栓及抗癌等活性。如Chivosazol能破坏真菌的细胞壁及其稳定性[31]；Disorazol作用于微管蛋白，抑制细胞骨架形成[32]；Myxopyronin通过抑制RNA多聚酶活性而抑制细菌核酸的合成[33]。这些结果说明了利用粘细菌抑制P. infestans生长的可能性。M. fulvus的次生代谢产物越来越受到人们的关注，但是有关其次级代谢产物对植物病害，尤其是马铃薯晚疫病的防治作用鲜见报道。本研究中分离到的菌株B25-I-3对P. infestans表现出了较强的拮抗活性，其产生的次级代谢产物具有明显抑制P. infestans侵染马铃薯叶片的活性，且对不同品种叶片无损伤作用。该结果补充了抑制致病疫霉生长的微生物资源，并为未来抗马铃薯晚疫病生物农药的研发提供基础数据。
粘细菌能分泌大量的粘液及导致自溶的胞外酶，这使其在次级代谢产物的发酵生产方面有较大的局限性。温度、转速、周期、通风及补料等是优化微生物发酵的主要因素，这些因素并非单一地影响菌株发酵，而是通过各因素之间的交互作用共同影响[34]。植物乳杆菌AB-1 (Lactobacillus plantarum AB-1)的发酵条件经正交设计优化后，其产苯乳酸的量较优化前提高了1.17倍[35]；甲基营养型芽孢杆菌SD48 (Bacillus methylotrophicus SD48)的培养基组成和发酵条件经正交试验被系统优化后，其产生的大豆肽产量及其抗氧化活性有了较大的提高[36]。这些研究结果说明，微生物的生物活性是可以通过优化发酵条件来提高的。本研究对菌株B25-I-3抗P. infestans活性的发酵条件进行了正交优化，发现该菌株最优发酵条件为：摇床转速180 r/min，接种量10%，发酵周期为7 d，温度为30 ℃。这部分工作为未来开发基于菌株B25-I-3的抗马铃薯晚疫病生物农药奠定了基础。
此外，本研究对菌株B25-I-3发酵产生的活性物质的稳定性进行了分析，发现其耐受紫外线和自然光照射以及蛋白酶K的处理，且易于在低温条件下保存，该结果与任兴波等[15]分离得到的变绿粘球菌YR-35 (M. virescens YR-35)发酵浓缩液的稳定性结果一致。但变绿粘球菌YR-35产生的活性物质在温度为90 ℃时对P. infestans菌丝的抑制率仅能达到15.38%，而高温对菌株B25-I-3的活性物质影响较小。刘沛生等[37]分离得到的具有抗P. infestans活性的M. fulvus Xt-2的次级代谢产物对高温环境也较敏感。相比之下，本研究筛选的菌株B25-I-3其活性产物更具有应用于大田防治马铃薯晚疫病的潜力。
本研究表明菌株B25-I-3的次级代谢产物具有实用价值，能够作为防治马铃薯晚疫病的有效药剂加以开发与利用，但其发酵产生的活性物质究竟为何种物质以及其拮抗P. infestans的作用机理、大田应用等多个问题还需要今后的进一步研究。
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